Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Культивирование первичных Крыса Внутренняя Медуллярной собирательных канальцев Клетки

14.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50366

⸱

21 июня 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Аргинин-вазопрессина (АВП) управляет тонкой настройки тела водный гомеостаз путем содействия реабсорбции воды почечными клетками основной. Здесь мы приводим протокол для выращивания первичной крыса внутренней медуллярной собирательных канальцев клеток, пригодных для выяснения молекулярных механизмов, лежащих AVP-опосредованной реабсорбции воды.

Аннотация

Аргинин-вазопрессина (АВП) способствует реабсорбции воды почечных собирательных канальцев клетки и тем самым основным настраивает тело водного гомеостаза. AVP связывается с вазопрессина V2 рецепторов (V2R) на поверхности клеток и тем самым индуцирует синтез цАМФ. Это стимулирует клеточные процессы сигнализации приводит к изменениям в фосфорилировании воды канал аквапорин-2 (AQP2). Протеинкиназы phoshorylates AQP2 и тем самым вызывает перемещение AQP2 из внутриклеточных везикул в плазму мембраны содействия реабсорбции воды из первичной мочи. Аберрации релизе AVP из гипофиза или AVP-активированной сигнализации в основные клетки может привести к центральной или нефрогенной несахарный диабет, соответственно, повышенной плазме крови AVP уровень связан с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как хроническая сердечная недостаточность и синдром неадекватной секреции антидиуретического гормона.

Здесь мы приводим протокол для cultivatiна первичных крысы внутренней медуллярной собирательных канальцев (IMCD) клетки, которые выражают V2R и AQP2 эндогенно. Клетки, которые подходят для выяснения молекулярные механизмы, лежащие в основе управления AQP2 и таким образом открыть новые лекарственных препаратов для лечения заболеваний, связанных с нарушением регуляции AVP-опосредованного реабсорбции воды. IMCD клетки получают от крыс почечной внутренний medullae и используются для экспериментов шесть-восемь дней после посева. IMCD клетки можно культивировать в обычных клеточных культур посуда, фляги и микро-титр пластин различных форматов, процедура требует лишь несколько часов, и подходит для стандартных лабораторий клеточной культуры.

Введение

При почечной собирающего протока основные клетки, аргинин-вазопрессин (AVP) управляет реабсорбции воды, стимулируя введение водного канала аквапорин-2 (AQP2) в плазматической мембране. AVP связывается с G-белком вазопрессина 2-го типа рецепторов (V2R) стимулирует аденилатциклазу и тем самым образование цАМФ. Инициирование этого сигнального каскада приводит к активации протеинкиназы A (PKA). PKA фосфорилирует AQP2 на серин 256 (S256), который является ключевым триггером для его перераспределение из внутриклеточных везикул в плазматической мембране. Мембранные вставки способствует реабсорбции воды по осмотическому градиенту и настраивает тело водного гомеостаза.

Нарушение регуляции AVP-опосредованной реабсорбции воды, в связи с аберраций вазопрессина или AVP-активированной сигнализации или причин связана с тяжелыми заболеваниями. Снижение реабсорбции воды вызваны мутациями V2R или AQP2 приводит к нефрогенной несахарный диабет, в то время как отмated плазме крови AVP уровень связан с чрезмерным реабсорбции воды в сердечно-сосудистых заболеваний, таких как хроническая сердечная недостаточность и синдром неадекватной секреции антидиуретического гормона (SIADH).

Значение AVP-опосредованной реабсорбции воды обусловлена ​​не только ее проявление в болезни. AVP-индуцированной транслокации AQP2 несущих везикул и слияние с плазматической мембраной представляет собой строго цАМФ-зависимого exocytic процесса, который в настоящее время не очень хорошо понял. Другие примеры для цАМФ-зависимого экзоцитоза являются секреции ренина в почках и Н + секреции в желудке. Таким образом, выяснение молекулярных механизмов, регулирующих AQP2-транслокации в основной почечной клетки не только помогает понять сходные молекулярные процессы в других типах клеток, но также может проложить путь к новым методам лечения для лечения заболеваний, связанных с нарушениями AVP-опосредованной реабсорбции воды .

Миlucidating механизмы, контролирующие AQP2 требует собирательных канальцев основные модели клетки. Для этого ряда различных клеточных линий млекопитающих почки имеются. Тем не менее, эти модели имеют несколько недостатков. Во многих клеточных системах уровень протеина AQP2 низка (табл. 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, ООО-PK1) 1-10, другие эктопически сверхэкспрессируют человека (MCD4, WT10) 11,12 или крысы (CD8) 13 AQP2. В MCD4 и COS-7 клетки V2 рецептор не выражена. Насколько нам известно, нет постоянной клеточной линии в качестве модели доступны, который является производным от почечной внутренней медуллярной собирательных канальцев, что часть почки, где AQP2 выражение наиболее распространенным, но от корковых собирательных канальцев 1,11,13-16 . Такие модели клетки являются, например, широко используется увековечили mpkCCD (например, 17) или недавно созданным mTERT CCD-14 клеточных линий. Обе клеточные линии эндогенно экспресс AQP2 и V2R но так как они являются производными откоркового канала сбора, скорее всего, содержат различные протеомом по сравнению с внутренней медуллярной собирательных канальцев (IMCD) клеток. Они должны, например, выражают различные Na + транспортные системы.

Здесь мы приводим протокол к культуре первичных клеток, экспрессирующих IMCD V2R и AQP2 эндогенно. Эта модель, таким образом, представляет наиболее тесно физиологической ситуации в мочеточник коллекционирования. Так как установление культура требует только стандартные лабораторное оборудование других лабораторий могут легко принять этот подход.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. Подготовка чашек для культивирования
    1. Оттепели коллагена IV типа O / N при 4 ° С и растворить ее в стерильной 0,1% уксусной кислоты. Объем использовать, зависит от типа и количества блюд, в которых клетки должны быть посеяны. Используйте 2 мкг / см 2.
    2. Выдержите блюд по крайней мере, в течение 1 часа при комнатной температуре и мыть дважды дистиллированной водой (А. tridest).
    3. Разрешить блюда как следует высохнуть.
  2. Дополнение среднего
    1. Увеличение уровня глюкозы до 4,5 г / л путем добавления 1,75 г глюкозы в 500 мл среды. Для регулировки среднего до 600 мосмоль, добавляют 100 мМ NaCl и 100 мМ мочевины, повышение осмолярности до 200 мосмоль и 100 мосмоль соответственно.
    2. Добавить 1% заменимых аминокислот, 1% Ultroser, 500 мкМ DBcAMP, 20 ед / мл нистатина и 0,25 мкг / мл гентамицина (1:200 разбавление исходного раствора с концентрацией 50 мкг / мл) до 600 мосмоль среда DMEM недавно в день препарата.
  3. Раствор фермента
    1. Добавить 1 мг / мл гиалуронидазы и 2,2 мг / мл коллагеназы в DPBS содержащий 0,25 мкг / мл гентамицина и нистатин. Подготовка 1 мл этого раствора фермента для переваривания 2 почки внутренней medullae. Решение должно быть стерилизованы фильтрацией и хранится в 50 мл пробирки Фалкон.

2. Культивирование первичных Крыса Внутренняя Медуллярной собирательных канальцев (IMCD) Клетки

Все процедуры обращения с животными будут осуществляться в соответствии с местным и федеральным законодательством.

  1. Анестезировать крыс в СО 2 (в коробке насыщенной CO 2) или изофлурана (U-400 Анестезия блока, Univentor ООО, Мальта; воздушный поток 350-400 мл / мин с 2-2,5% ИФ). Обезглавить животных для кровотечением, которое позволяет точно обнаружения границы между внутренним и беловато темнее внешнего мозгового вещества. Кроме того, кровотечение минимизирует число изолированных эритроцитов. Удалить почек имыть их в стерильной DPBS дополнена гентамицин и нистатин (см. выше) на льду. Все дальнейшие шаги будут осуществляться в стерильных условиях чистой скамейки.
  2. Передача почки от DPBS раствор на стерильной компресс, чтобы удалить лишнюю жидкость. Удалить жировой капсулой почки стерильным пинцетом и ножницами.
  3. После почки еще фиксируется в компресса, вырезать немного рядом с продольной осью внешней (корковый) стороны. Удостоверьтесь, чтобы не прорезать полностью, а оставить его в одной части, связанные в почечную лоханку.
  4. С изогнутыми ножницами аккуратно вскрыть внутреннюю medullae беловатые, которые окружены мерцающим розовым внешнего мозгового вещества. Соберите их в DPBS, содержащие гентамицин и нистатин в 60 мм культуры блюдо на льду.
  5. После того как все medullae изолированы и собирали на льду, уменьшить объем DPBS до уровня, когда они просто покрыта буфера. Используйте стерильный лезвие бритвы, чтобы сократить medullae кубиками из 5мм 3.
  6. Расплава и Круглый острые конец стерильной пипетки Пастера, держа ее кратко в пламя. Убедитесь, что пипетки охлаждается, прежде чем продолжить.
  7. Передача суспензии ткани в 50 мл пробирки, содержащие Фалькон свежеприготовленный стерильный раствор фермента гиалуронидазы и коллагеназы (см. 1.3.1) с помощью закругленной пипетки Пастера. Закрыть крышку плотно и инкубируют при 37 ° C при непрерывном перемешивании (220 оборотов в минуту) в регулярные водяной бане в течение 1,5 столешница - 2 часов.
  8. Для растирания подвеска, не пипетки смесью вверх и вниз несколько раз с круглым пипетки Пастера (см. выше), пока суспензия становится гомогенной мутным.
  9. Центрифугируют суспензию в течение 5 мин при 300 мкг и 16 ° С. Удалите супернатант, ресуспендируют осадок тщательно DPBS, содержащие гентамицин и нистатин и центрифуга снова. Повторите эту стадию промывки один раз.
  10. Ресуспендируйте элементов в полностью дополнена средних и семя их в Culture блюд и / или микро-титр луночных планшетах. Получение 2 medullae (1 животное) даст достаточное для одной клетки 60 мм культуры блюдо.
  11. После 24 часов, мыть клетки в два раза с 600 мОсмол DMEM и добавить свежей средой. В течение следующей недели клетки следует мыть 2-3 раза (рис. 1). 6-8 дней после посева, IMCD клетки могут быть использованы для экспериментов. Запомнить инкубировали в них в среде без DBcAMP и нистатин в течение 24 ч перед началом эксперимента. В противном случае AQP2 будут расположены исключительно в плазматической мембране.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное культивирование первичных клеток крысы IMCD приведет к монослоя 6-8 дней после посева (рис. 2). В 60 мм блюдо культуры есть приблизительно 6 х 10 6 клеток. Клетки плотно прилипать к культуральной посуды, так как они были покрыты коллагена типа IV, компонент базальной мембраны 18. Поэтому IMCD клетки не отделится даже в течение нескольких процедур тщательного мытья. До 80% от культивируемых клеток выразить эндогенно V2R и AQP2. Эти основные клетки, в то время как клетки, ли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представляем подробный протокол для подготовки и культивирования первичных клеток IMCD крысы. Этот подход дает до 21 см 2 клеток из одной крысы 20. Эксперимент требует стандартное оборудование культуре клеток и может быть осуществлена ​​одним человеком в течение примерно 6 часов. Таким образом, этот подход может быть использован как стандартный лабораторный метод.

Первичные элементы IMCD крыса может быть посеяны в культуре блюда разных размеров, начиная от 96-луночны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Немецкого Forschungsgemeinschaft (DFG; KL и KL 1415/3-2 1415/4-2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллаген IV типа мышиBD Biosciences356233
гиалуронидазаSIGMAH6254
Коллагеназа типа CLS-IIBiochrom AGC2-22
DMEM + GlutMAXInvitrogen GIBCO21885108
нистатинSIGMAN4014
Ultroser GCytogen15950-017
Заменимые аминокислоты (NEA)Biochrom AGK0293
ГентамицинИнвитроген GIBCO15710
DBcAMPBIOLOGD009

Ссылки

  1. Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
  2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
  3. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
  4. Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
  5. Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
  6. Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
  7. Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
  8. Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
  9. Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
  10. Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
  11. Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
  12. Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
  13. Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
  14. Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
  15. Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
  16. Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
  17. Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
  18. Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
  19. Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
  20. Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
  21. Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
  22. Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
  23. Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
  24. Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
  25. Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
  26. Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
  27. Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
  28. Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
  29. Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
  30. Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

Теги

Первичные клетки собирательных трубок внутреннего мозгового слоя крысыизоляция внутреннего мозгового слояферментативное переваривание тканипротокол культивирования клетоксигналинг аргинин-вазопрессинатранслокация аквапорина-2экспрессия V2-рецепторапокрытие коллагеномвестерн-блот-анализиммунофлуоресцентная микроскопия
Культивирование первичных Крыса Внутренняя Медуллярной собирательных канальцев Клетки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.