Методическая статья

5/6th нефрэктомии в сочетании с высоким содержанием соли и азотной ингибирование синтазы, чтобы побудить хронического заболевания почек у крыс Льюиса

23.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50398

⸱

3 июля 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology & Hypertension, University Medical Center Utrecht

В этой статье

Краткое содержание

Двухступенчатый метод установить хронической болезнью почек (ХБП) у крыс Льюиса путем хирургического удаления 5/6th почечной массы описывается. Сочетание хирургической процедуры, NOS-торможение и высокую содержанием соли приводит к модели напоминающие человеческие CKD, позволяющей исследовать причинных механизмов и разработке новых терапевтических вмешательств.

Аннотация

Хроническая болезнь почек (ХБП) является глобальной проблемой. Замедление прогрессирования ХБП является одним из основных приоритетов в области здравоохранения. С ХБП характеризуется комплексом расстройств гомеостаза, интегративной модели на животных необходимы для изучения развития и прогрессирования ХБП. Для изучения развития ХБП и новых терапевтических вмешательств при ХБП, мы используем модель абляции 5/6th нефрэктомии, известный экспериментальной модели прогрессирующей почечной болезнью, напоминающей несколько аспектов человеческой CKD. Валового снижение почечного массы вызывает прогрессивное клубочковой и тубуло-интерстициального повреждения, потерю нефронов остатком и развитие системного и клубочковой гипертензии. Это также связано с прогрессивным внутрипочечный капиллярного потери, воспаление и гломерулосклероз. Факторы риска для CKD неизменно влияние на функцию эндотелия. Для имитации этого, мы объединяем удаление 5/6th почечной массы с окисью азота (NO) истощение и диеты с высоким содержанием соли. После прибытия и акклиматизации, животных повторноне воспринимаем NO синтазы (NG-нитро-L-аргинин) (L-NNA) с добавлением к питьевой воде (20 мг / л) в течение 4 недель, после чего правосторонний uninephrectomy. Через неделю Итого нефрэктомии (SNX) осуществляется с левой стороны. После SNX, животным дают восстановиться в течение двух дней, после чего LNNA в питьевой воде (20 мг / л) в течение еще 4 недель. Диеты с высоким содержанием соли (6%), дополнен в землю чау (см. тайм-линии рис. 1), продолжается в течение всего эксперимента. Прогрессирование почечной недостаточности следует с течением времени при измерении мочевины в плазме, систолическое давление крови и протеинурии. По шесть недель после SNX, почечная недостаточность сложилась. Почечная функция измеряется с помощью инулина «золотой стандарт» и пара-амино гиппуровую кислоты (ПАУ) оформление технологии. Эта модель ХБП характеризуется снижением скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и эффективного почечного кровотока плазмы (ЭПП), артериальная гипертензия (систолическое артериальное давление> 150 мм ртутного столба), протеинурия (> 50 мг/24 часа) И мягкой уремия (> 10 мм). Гистологические особенности включают тубуло-интерстициальный повреждение отражается воспаление, трубчатых атрофия и фиброз и координационных гломерулосклероза приводит к массовому сокращению здоровых клубочков в популяции остаток (<10%). Последующие меры до 12 недель после SNX показывает дальнейшего прогрессирования ХБП.

Введение

Благодаря своему прогрессивный характер, последующие терминальной стадией заболевания почек, сердечно-сосудистые и связанные с заболеваемостью и смертностью, CKD растущая проблема здравоохранения 1. Замедление прогрессирования ХБП Поэтому одним из главных приоритетов здравоохранения. С ХБП характеризуется комплексом расстройств гомеостаза, интегративной модели на животных необходимы для изучения развития и прогрессирования ХБП. Почка состоит из широкого спектра различных типов клеток, которые взаимодействуют друг с другом. Эта сложность не можно имитировать в лабораторных условиях.

Для изучения новых терапевтических вмешательств при ХБП, мы используем модель абляции 5/6th нефрэктомии, известная экспериментальная модель прогрессирующей почечной болезнью, напоминающей несколько аспектов человеческой CKD 2,3. Валового снижение почечного массы вызывает прогрессивное клубочковой и тубуло-интерстициального повреждения, потерю нефронов остатком и развитие системного и клубочковой гипертензии. Это связано с прогрщий внутрипочечное капиллярных потерь 4, воспаления и гломерулосклерозу. Факторы риска для CKD неизменно влияние на функцию эндотелия 5. Мы использовали линии крыс (Lewis), который является относительно устойчивы к развитию ХПН и поэтому в сочетании удаление 5/6th почечной массы с оксидом азота (NO) истощение 6, 7, 8 и диеты с высоким содержанием соли 9. После прихода и акклиматизации, животных не получат NO синтазы (L-NNA) с добавлением к питьевой воде (20 мг / л) в течение 4 недель, после чего правосторонний uninephrectomy (UNX) с продолжением L-NNA после двух дней . Через неделю субтотальной нефрэктомии (SNX), то есть удаление 2/3rds почечной массы выполняется на левой стороне. После SNX, животным позволяют восстановиться в течение 2 дней, а затем снова по 20 мг / л LNNA в питьевой воде в течение 4 недель. Диеты с высоким содержанием соли (6%), дополнен в землю чау (см. тайм-линии рис. 1), продолжается в течение всего эксперимента. Tон причина для выполнения UNX на правой стороне и SNX на левой стороне в том, что почечные сосуды длиннее на левой стороне, что облегчает доступ к почке без растяжения сосудов слишком много, когда почки подвергается вне тела . В литературе модели описаны в котором полюса левой почки удаляются первым, а затем UNX из правой почки через неделю 10,11,12. В наших руках этой модели показали гораздо более быстрое развитие почечной недостаточности, но и гораздо большее изменение в потере почечной функции. Прогрессирование почечной недостаточности следует с течением времени при измерении мочевины в плазме, систолическое давление крови и протеинурии. По шесть недель после SNX, почечная недостаточность сложилось, характеризуется выраженным снижением скорости клубочковой фильтрации (69%) и эффективного почечного кровотока плазмы (62%) 13 гипертонией (систолическое АД> 150 мм рт.ст.), протеинурия (> 50 мг/24 ч) и мягкий уремия (> 10 мм). Гистологические особенности включают TUBULо-интерстициальный повреждение отражается воспаление, трубчатых атрофия и фиброз и координационных гломерулосклероза приводит к массовому сокращению здоровых клубочков в популяции остаток (<10%). Последующие меры до 12 недель после SNX не показывает дальнейшее прогрессирование ХБП, обеспечивая окно возможностей для оценки терапевтического вмешательства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты выполнены в соответствии с экспериментальными животными этические направляющие линии Комитета по Животным экспериментальной Утрехт. Протокол проводится под руководством и утверждения учреждения автора уходу и использованию животных комитета.

ХБП вызывают у самцов инбредных крыс Льюиса (Charles River, Sulzfeld, Германия) в возрасте 8 недель. Крыс содержали в стандартных условиях в легком, температуры и влажности контролируемой среде.

1. Подготовка хирургии

  1. Стерилизовать хирургических инструментов:
    • 1 студент Пинцет хирургический 1-2 зубов 12 см
    • 1 студент стандартных щипцов узором
    • 2 Semken щипцы
    • 1 Майо ножницами
    • 1 студент Iris ножницами
    • 1-Olsen Hegar иглодержатель с ножницами
    • Одеяло
  2. Проверка наличия списка:
    • Операционный стол с пусковой площадкой потепления и лампы
    • O 2, изофлурана
    • Ткани
    • Бритва
    • Весы
    • Стерильная операционная
    • Стерильные 5x5 марлю и 10x10
    • 70% спиртом
    • 0,9% раствором хлорида натрия
    • 1 мл шприц
    • Иглы (25G)
    • Гель коврики: Spongostan
    • Vicryl 4.0 и 5.0
    • Бупренорфин 0,03 мг / кг (1:10 разводили в физиологическом соли)
    • Чистую клетку для крыс после операции

2. Правая сторона Uninephrectomy

  1. Лечить таблицу с 70% спиртом.
  2. Место крысу в коробку и индукции анестезии с 4% изофлурана и 1 литр потока O 2. Примечание: в зависимости от вида крыс использовали, пред-и периоперационной анальгезии назначают, это должно быть обсуждено с местным ветеринаром.
  3. Передача крысе нос таблицу и поместить в конусе. Крысы и носовой обтекатель размещены на грелку для поддержания температуры тела крысы. Я крысас вентилируемой смесью 2% изофлуран и 1 л O 2.
  4. Бритье фланг крысы и дезинфицируют спиртом. Вымыть и продезинфицировать руки и носить стерильные хирургические перчатки. Несите крышку головы и маски. Сделать 1 - 1,5 см разрез параллельно ребрам с использованием анатомических щипцов и тупыми ножницами. Expose почки тупым рассечением мышц спины.
  5. Нижний полюс почки видно, тщательно используйте небольшие тупые щипцы для захвата паранефральная жировой ткани. Externalize почки, осторожно потянув на паранефральная жира щипцами. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить надпочечниках во время этой процедуры. Надпочечников могут быть легко удалены путем размещения щипцов на медиальной сайт в жировой ткани и осторожно перемещается вверх между надпочечников и почек, как показано на рисунке 2.
  6. Наведите почек мягко на марлю и подальше от окружающих жира и соединительной ткани. Определить почечную артерию и вену и поместить лигатуры (5.0викрил) с одним узлом вокруг сосудов, но не галстук узлом.
  7. Переместить свободный узел тщательно по сосудам к аорте примерно на 0,5 см, чтобы создать пространство между почками и узел. Это сделано, чтобы предотвратить лигатуры от соскальзывания после резки.
  8. Галстук узлом с двумя узлами. Если перфузии прекращается, цвет почки немедленно перейти в коричневый цвет. Не обрезайте концы лигатуры.
  9. Разрежьте почечные сосуды близко к почке и удалить почку. Осторожно потяните за длинные концы лигатуры для проверки кровотечения почечные сосуды. Лигатуры должны оставаться на месте на судне. Обрежьте длинные концы лигатуры. Обратите внимание, что остаток почечных сосудов втянется в брюшную полость немедленно.
  10. Тех вырезали почки высушить и взвесить его.
  11. Закройте скелетных мышц разрез с проточной швов с Vicryl 5.0. Введите 0,10 мл (0,03 мг / кг) бупренорфин внутримышечно в заднюю конечность. Закрытькожи с Vicryl 4,0 с внутрикожных швов. Это предотвращает крыс от открытия раны. Обратите внимание: из-за угнетения дыхания у крыс Льюиса, мы только даем послеоперационного обезболивания перед выключением изофлурана.
  12. Дом крысы в ​​чистой одиночной клетке с легким доступом к пище и воде. Поместите клетку половина на потепление площадку O / N и проверьте тщательно крысы на следующий день. Когда рану закрывают и крыса активна, который обычно между 6 и 12 ч после операции у крыс может быть помещен обратно в группе корпуса.

3. Левая сторона Итого Нефрэктомия

  1. Через семь дней те же препараты изготовлены на левой стороне, на правой стороне, как описано от 2,1 до 2,5. Перед операцией, количество почечной ткани, которая должна быть удалена соответствующая приблизительно 2/3rds веса правой почки рассчитывается. Подготовьте небольшие кусочки пены гель (Spongostan, Johnson & Johnson, Нью-Джерси) до операции.
  2. Наведите острыми ножницами вокруг верхнего полюса левой почки и резекцию верхнего полюса в одном инсульта (для Scissor месте, см. рисунок 3). Крышка непосредственно с куском гель пены и оказывают умеренное давление стерильной марлей.
  3. Повторите с нижнего полюса почки, как в 3.3.
  4. Поднимите почку, чтобы предотвратить свертывание на коже. Поддерживайте давление на мягкие гелевые подушечки и пены стерильной марлей, пока кровотечение не остановится. Если кровотечение продолжается, добавьте еще поролоновую губку.
  5. Поместите остатки почек с приверженцем гель коврики внутри брюшной полости. Закройте мышц и кожи и следуйте 2.9-2.12.

4. Шам хирургии

  1. Ложнооперированных управления проходят такую ​​же процедуру для того, чтобы подвергать почки. Вместо искоренения почки или резки полюса через неделю, как почки декапсулируется на одну неделю интервала, стараясь не нарушить надпочечников. Закрытие раны и послеоперационного ухода IDentical до 2,11 и 2,12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После субтотальной нефрэктомии, примерно 1/6th от общего числа почечных массу оставляют. Рисунок 4 показывает вес удаленной части правой почки со средней и стандартного отклонения в двух предыдущих экспериментов. При этом следует иметь в виду, что в течение недели после UNX, гипертрофии левого почек происходит, указывающий, что вес, который должен быть удален рассчитаны на основе веса правой почки всегда приводит к менее 5/6th удаления. Однако, так как это не возможно, чтобы определить вес левой почки в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хирургическое удаление 5/6th почечной массы у крыс Льюиса, в сочетании с высоким содержанием соли и временного ингибирования NOS приводит к модели ЦП, который напоминает человека CKD и позволяет исследовании причинных механизмов и эффективность терапевтического вмешательства в ЦП.

Модель 5/6th нефрэктомии является хорошо известной и широко описано модель для ЦП. Однако простое удаление 5/6th почечной массы не приводит к немедленному почечной недостаточности у всех крыс штаммами. Мы используе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Криста ден Ouden за отличную техническую помощь. Этот метод при финансовой поддержке голландского почечный фонд, грант C06.2174. MCV при поддержке Нидерландской организации научных исследований (NWO) Види-грант 016.096.359.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
   <сильный>реагент
L-NNASigma-aldrichN5501 
Spongostan dental: гелевые пенные подушечки 1x1x1 смJohnson& JohnsonMs0005 
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36EthiconV303H 
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36EthiconV392H 
Бупренорфин (0,3 мг/мл)Через местного фармацевта по заказу Reckitt Benckiser pharmaceuticalsunknown 
   <сильный>Оборудование
Студенческие тканевые щипцы - 1x2 зуба 12 смFine Science Tools (FST)91121-12 
Студенческие щипцы стандартного образцаFST91100-12 
Ножницы МайоFST14010-15 
2X Щипцы Semken FST11008-13 
Студенческие ножницы с радужной оболочкойFST91460-11 
Иглодержатель Olsen-Hegar FST12002-14 

Ссылки

  1. AS, G. o, Chertow, G. M., Fan, D., McCulloch, C. E., Hsu, C. Y. Chronic kidney disease and the risks of death, cardiovascular events, and hospitalization. N. Engl. J. Med. 351 (13), 1296-1305 (2004).
  2. Fleck, C., Appenroth, D., et al. Suitability of 5/6 nephrectomy (5/6NX) for the induction of interstitial renal fibrosis in rats--influence of sex, strain, and surgical procedure. Exp. Toxicol. Pathol. 57 (3), 195-205 (2006).
  3. Griffin, K. A., Picken, M. M., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A. K. Functional and structural correlates of glomerulosclerosis after renal mass reduction in the rat. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (3), 497-506 (2000).
  4. Kang, D. H., Kanellis, J., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
  5. Baylis, C. Nitric oxide synthase derangements and hypertension in kidney disease. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 21 (1), 1-6 (2012).
  6. Bongartz, L. G., Braam, B., et al. Transient nitric oxide reduction induces permanent cardiac systolic dysfunction and worsens kidney damage in rats with chronic kidney disease. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298 (3), 815-823 (2010).
  7. Fujihara, C. K., De N, G., Zatz, R. Chronic nitric oxide synthase inhibition aggravates glomerular injury in rats with subtotal nephrectomy. J. Am. Soc. Nephrol. 5 (7), 1498-1507 (1995).
  8. Fujihara, C. K., Sena, C. R., Malheiros, D. M., Mattar, A. L., Zatz, R. Short-term nitric oxide inhibition induces progressive nephropathy after regression of initial renal injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (3), F632-F640 (2006).
  9. Dikow, R., Kihm, L. P., et al. Increased infarct size in uremic rats: reduced ischemia tolerance? J. Am. Soc. Nephrol. 15 (6), 1530-1536 (2004).
  10. Elrashidy, R. A., Asker, M. E., Mohamed, H. E. Pioglitazone attenuates cardiac fibrosis and hypertrophy in a rat model of diabetic nephropathy. J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther. 17 (3), 324-333 (2012).
  11. Haylor, J., Schroeder, J., et al. Skin gadolinium following use of MR contrast agents in a rat model of nephrogenic systemic fibrosis. Radiology. 263 (1), 107-116 (2012).
  12. Moriguchi, Y., Yogo, K., et al. Left ventricular hypertrophy is associated with inflammation in sodium loaded subtotal nephrectomized rats. Biomed. Res. 32 (2), 83-90 (2011).
  13. van Koppen, A., Joles, J. A., et al. Healthy bone marrow cells reduce progression of kidney failure better than CKD bone marrow cells in rats with established chronic kidney disease. Cell Transplant. , (2012).
  14. Baylis, C., Corman, B. The aging kidney: insights from experimental studies. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (4), 699-709 (1998).
  15. Szabo, A. J., Muller, V., Chen, G. F., Samsell, L. J., Erdely, A., Baylis, C. Nephron number determines susceptibility to renal mass reduction-induced CKD in Lewis and Fisher 344 rats: implications for development of experimentally induced chronic allograft nephropathy. Nephrol. Dial Transplant. 23 (8), 2492-2495 (2008).
  16. Darling, I. M., Morris, M. E. Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion. Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).
  17. Levey, A. S. Measurement of renal function in chronic renal disease. Kidney Int. 38 (1), 167-184 (1990).
  18. Myers, G. L., Miller, W. G., et al. Recommendations for improving serum creatinine measurement: a report from the Laboratory Working Group of the National Kidney Disease Education Program. Clin. Chem. 52 (1), 5-18 (2006).
  19. Hostetter, T. H., Meyer, T. W. The development of clearance methods for measurement of glomerular filtration and tubular reabsorption. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287 (5), F868-F870 (2004).
  20. Koeners, M. P., Racasan, S., Koomans, H. A., Joles, J. A., Braam, B. Nitric oxide, superoxide and renal blood flow autoregulation in SHR after perinatal L-arginine and antioxidants. Acta. Physiol. (Oxf). 190 (4), 329-338 (2007).
  21. van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
  22. Kreutz, R., Kovacevic, L., Schulz, A., Rothermund, L., Ketteler, M., Paul, M. Effect of high NaCl diet on spontaneous hypertension in a genetic rat model with reduced nephron number. J. Hypertens. 18 (6), 777-782 (2000).
  23. Liu, Z. C., Chow, K. M., Chang, T. M. Evaluation of two protocols of uremic rat model: partial nephrectomy and. 25 (6), 935-943 (2003).
  24. Griffin, K. A., Picken, M., Bidani, A. K. Method of renal mass reduction is a critical modulator of subsequent hypertension and glomerular injury. J. Am. Soc. Nephrol. 4 (12), 2023-2031 (1994).
  25. Meyer, F., Ioshii, S. O., et al. Laparoscopic partial nephrectomy in rats. Acta. Cir. Bras. 22 (2), 152-156 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи