Методическая статья

Механическое раздражение индуцированных кальция Распространение волн в монослоев клеток: Пример бычьего эндотелиальных клеток роговицы

16K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50443

⸱

16 июля 2013 г.

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

В этой статье

Краткое содержание

Межклеточной Ca 2 +-Волны обусловлено щелевые каналы и полуканалы. Здесь мы описываем метод измерения межклеточных Са 2 +-Волн в монослоев клеток в ответ на местные одноклеточные механический стимул и его применение для исследования свойств и регулирование щелевые каналы и полуканалы.

Аннотация

Межклеточной коммуникации имеет важное значение для координации физиологических процессов между клетками в различных органах и тканях, в том числе головного мозга, печени, сетчатки, улитки и сосудов. В экспериментальных условиях, межклеточные Са 2 +-волны могут быть вызваны применением механической стимул к одной ячейке. Это приводит к высвобождению внутриклеточных сигнальных молекул IP-3 и Са 2 +, которые инициируют распространения Са 2 +-волны концентрически с механически стимулированных ячейки в соседних ячейках. Основные молекулярные пути, которые контролируют межклеточную Ca 2 +-волн предоставляются щелевых каналов, через прямую передачу IP 3 и полуканалы посредством высвобождения АТФ. Идентификация и характеристика свойств и регулирование различных коннексином и pannexin изоформы, что щелевые каналы и полуканалы допускаются quantificatioн распространения межклеточного Са 2 +-волны, миРНК, а также использование ингибиторов щелевых каналов и полуканалы. Здесь мы опишем метод для измерения межклеточных Ca 2 +-волны в монослоя эндотелия роговицы первичной клетки, нагруженные Fluo4-AM в ответ на контролируемые и локализованные механический стимул спровоцированы острые, кратковременные деформации ячейки в результате прикосновения к клеточной мембране с микроманипулятор-стекло с контролируемым размером микропипетки с наконечником диаметром менее 1 мкм. Мы также описывают выделение первичной бычьей роговицы эндотелиальные клетки и ее использование в качестве модельной системы для оценки Cx43-гемиканала активность в качестве ведомого силу для межклеточных Са 2 +-волн через высвобождение АТФ. Наконец, обсуждается использование, преимущества, ограничения и варианты этого метода в контексте разрыв канал перехода и гемиканала исследований.

Введение

Межклеточные связи и сигнализации имеют важное значение для координации физиологических процессов в ответ на внеклеточный агонистов на тканевом и оптово-органном уровне 1,2. Наиболее прямым способом межклеточной коммуникации создается возникновение щелевые контакты. Щелевые контакты являются бляшки каналов щелевых контактов, которые являются белковые каналы, образованные голова к голове стыковка двух коннексином (Cx) полуканалы соседних ячеек 3,4 (рис. 1). Щелевые соединения для прохода небольших сигнальных молекул с молекулярной массой менее 1,5 кДа, в том числе Са 2 + или 3 IP 5, в результате чего и модуляции Са 2 +-высвобождения из внутриклеточных запасов соседних ячеек 6 (фиг. 2). Каналов щелевых соединений жестко регулируется по внутри-и межмолекулярных взаимодействий белков и клеточных сигнальных процессах, как изменение и окислительно-восстановительныефосфорилирования 7. GJS облегчения согласованных действий связанных клеток, тем самым выступая в качестве химических и электрических синцитий. Например, распространение потенциала действия сердца через предсердных и желудочковых миоцитов опосредовано Cx основе каналов ГДж 85. CxS не только играют роль каналов щелевых контактов, но и формируют непарных полуканалы, тем самым функционируют как каналы в мембранах аналогично регулярных ионных каналов 8-10 (рис. 1). Полуканалы участвовать в паракринная сигнализации между соседними ячейками, контролируя обмена ионов и сигнальных молекул между внутри-и внеклеточной среде.

Во многих типах клеток (например, эпителиальные клетки, клетки остеобластов, астроциты, эндотелиальные клетки и т.д.) и органов (например, мозга, печени, сетчатки, улитки и сосудистой), межклеточные Са 2 +-волны имеют основополагающее значение для координации многоклеточных ответов 11. Увеличение внутриклеточного Са 2 + уровня в определенной ячейке не ограничивается этой клетке, но распространяются на окружающие соседние клетки, тем самым создавая межклеточных Са 2 +-волны 12,13. Эти межклеточные Са 2 +-волны имеют важное значение для нормальной физиологической регуляции клеточного слоя, как синцития и их регуляции был связан с патофизиологических процессах 11. В эндотелий роговицы и эпителия, различные группы 14-24, в том числе наши собственные 25-33, изучал механизмы и роли межклеточной коммуникации. В не-возбудимых клеток, как и эндотелиальные клетки роговицы, два различных режима межклеточной коммуникации происходят 28,29, а именно щелевые межклеточные связи и паракринные межклеточной коммуникации. Межклеточных щелевых контактов, коммуникация предполагает прямого обмена сигнальными молекулами через щелевые контакты 7. Gap переходаминых межклеточной коммуникации имеет решающее значение для поддержания тканевого гомеостаза, контроле пролиферации клеток, а также создание синхронизированных ответ на внеклеточный стресса 10,34,35. В ряде патологий, связь щелевых контактов снижается из-за дефектных CxS, и тем самым влияет щелевых межклеточных взаимодействий 36. Это подчеркивает важность и влияние щелевых межклеточных взаимодействий в многоклеточных организмах. В отличие от щелевых межклеточных коммуникаций, паракринные межклеточной коммуникации не зависит от межклеточной аппозиции, так как он связан с высвобождением диффузии внеклеточных мессенджеров (рис. 2). Различные типы сигнальных молекул высвобождаются во внеклеточном пространстве путем передачи сигналов клетками. Молекула затем транспортируется в клетки-мишени, где он обнаружен конкретный белок рецептора. Впоследствии рецептор-сигнал комплекс индуцирует клеточный ответ, которыйпрекращается путем удаления сигнала, инактивации или десенсибилизации. Выхода липофильных внеклеточной сигнализации посланников проникают в мембрану и действуют на внутриклеточные рецепторы. С другой стороны, гидрофильный посланники не проходят через плазматическую мембрану ответ клетки, но действовать как лиганд, который связывается с поверхностью экспрессированный рецептор белков, которые затем передают сигнал на внутриклеточную среду. Три основных семейств белков клетки поверхностным рецептором участвовать в этом процессе: ионно-канала связаны между собой, энзим-связанного, и протеин-связанные. Выпущен мессенджера молекула может действовать на рецепторы той же клетке (аутокринная) на клетки-мишени в непосредственной близости (паракринная) или на удаленные клетки-мишени, которые требуют системы кровообращения (эндокринной).

Во многих типах клеток, включая эндотелий роговицы 28,29, АТФ является одним из основных гидрофильными, паракринная факторами, которые определяют распространение межклеточных Са 2 +-волны 37-40. Дурния механической деформации, гипоксия, воспаление или стимуляции различными агентами, АТФ может быть освобожден от здоровых клеток 41-44 в ответ на напряжение сдвига, растягивать или осмотическое набухание 44,45. Различные АТФ-релиз механизмов было постулировано, в том числе везикулярный экзоцитоз 44 и множество транспортных механизмов, таких как АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортеры, плазмалеммы потенциал-зависимых анионных каналов 46, Р2Х7 рецептора каналов 47,48, а также коннексином полуканалы 49-52 и pannexin полуканалы 43,49,53. Внеклеточного АТФ может быть быстро гидролизуется до АДФ, АМФ и аденозин 54,55 по ectonucleotidases, которые присутствуют во внеклеточной среде. Внеклеточно выпущен АТФ и АДФ его метаболита 56 будет распространяться путем диффузии. Последующее взаимодействие этих нуклеотидов с пуринергической рецепторов в соседних ячейках было вовлечено в рropagation межклеточного Ca 2 +-волны 28,37,51. Два различных классов пуринергической рецепторы присутствуют: аденозин является основным природным лигандом для P1-пуриноцепторов, в то время как пурин (АТФ, АДФ) и пиримидиновые (UTP, UDP) нуклеотидов действовать на наиболее P2-пуриноцепторов 57.

Межклеточной коммуникации могут быть исследованы различными методами, такими как загрузка путем соскоба перенос красителя, местные uncaging агонистов, как IP 3 и Ca 2 +, механическое раздражение, и т.д.. Здесь мы опишем изучение Ca 2 +-волн вызванного механической стимуляции одной ячейки. Преимущество изучения Са 2 +-волн при механическом раздражении в том, что он обеспечивает легкий инструмент для количественной оценки распространения Ca 2 +-волны в течение долгого времени, и это позволяет количественно сравнения различных предварительной обработки клеток. В эндотелий роговицы, эти межклеточные Ca 2 +-волны позволяют сотрудничествасогласованный ответ от монослоя, добровольно выступает в качестве возможного механизма защиты нерегенеративная эндотелий роговицы помогают противостоять эндотелий внеклеточный напряжений при внутриглазной хирургии, или под воздействием медиаторов воспаления во время иммунного отторжения или увеит 58,59.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выделение клеток эндотелия роговицы

Перед началом работы: Изолировать клеток из свежих глаз, полученных из местных бойню, как можно скорее после энуклеирующий глаз. Убедитесь в том, что глаз был энуклеировали от коровы максимальных 18 месяцев, пять минут после смерти и сохранил в сбалансированном солевом растворе Эрла - 1% раствором йода при 4 ° С для транспортировки в лабораторию.

  1. Возьмите глаз сбалансированный солевой раствор Эрла - 1% раствором йода и поместить его в чашке Петри (100 х 20 мм).
  2. Стерилизацию глаз с раствором, содержащим 70% этанола и промыть сбалансированный солевой раствор Эрла, содержащей 1% йода.
  3. От этого шага, работай в стерильных капот. Осторожно рассекают роговицу от глаз и поместите его в чашке Петри (35 х 10 мм), содержащее сбалансированный солевой раствор Эрла, с слой эпителиальных клеток вверх. Осторожно удалите оставшиеся ткани Iris STIбудем прикреплены к роговице, если необходимо.
  4. Передача роговицы в сбалансированный солевой раствор Эрла другой содержащие чашки Петри с эндотелиальный клеточный слой вверх и промывки дважды сбалансированный солевой раствор Эрла.
  5. Передача роговицы с эндотелиальный слой вверх в виде песочных часов, которая представляет собой чашеобразный блюдо и покрыть ее питательной среды. Рост среда состоит из среды Игла, модифицированную по Дульбекко, содержащей 25 мМ глюкозы, 10% фетальной бычьей сыворотки, 6,6% L-глутамина, 2,5 мкг / мл амфотерицина-В и 1% антибиотиков противогрибковым смеси, содержащей 10000 единиц / мл пенициллина, 10 000 мкг / мл стрептомицина и 25 мкг / мл амфотерицина В.
  6. Снимите среде с всасывающим пипетки.
  7. Применить 300 мкл раствора трипсина (0,5 г / л) в эндотелиальных слой роговицы (все шаги, которые включают трипсин выполнены с использованием той же концентрации).
  8. Поместите песочные часы содержащие роговицы в закрытой чашке Петри и положить его в МКПubator течение 30 мин при 37 ° С и 5% СО 2.
  9. Аккуратно очистите эндотелиальные клетки от роговицы с огневой полировкой крюкообразными стеклянной пипетки Пастера в стерильных капот.
  10. Отсасывать раствор, содержащий эндотелиальные клетки и добавить его в колбах с культурой (25 см 2), содержащего 4 мл культуральной среды.
  11. Применить 300 мкл питательной среды к роговице и повторить соскоб и добавляют раствор, содержащий эндотелиальными клетками в культуральную колбу.
  12. Повторите это последний шаг (1.11) еще раз.
  13. Поместите Культуральные флаконы содержащий роговицы эндотелиальных клеток в питательной среде в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
  14. Через два дня, добавляют 6 мл культуральной среды.
  15. Обновите ростовой среде каждый второй день.

2. Культура клеток

  1. Удалить культуральной среды и промыть клетки дважды сбалансированный солевой раствор Эрла, когда слияния будет достигнута (в пределах АбуT 10 дней после изоляции).
  2. Добавить 1,5 мл раствора трипсина к клеткам, чтобы отделить их и колбу помещают в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2) в течение от 3 ​​до 4 мин.
  3. Добавьте 12 мл ростовой среды. Внесите среду в три раза и выходить, чтобы разогнать клетки и подсчитать клетки.
  4. Семенной клеток с переменным фракции в зависимости от плотности клеток и поместить их в инкубатор. Приготовьте два хорошо камерные слайды (с площадью 4,2 см 2) с-клеток 165000 клеток (плотность клеток 39286 на см 2). Подготовка 80 см2 колбах культуры для нового прохода при плотности 6250 на см 2, и добавляют свежую культуральную среду до общего объема 25 мл.
  5. Обновите среды каждые два дня.
  6. Слияния клеточного слоя достигается после 3 до 4 дней. Использование клеток для экспериментов.
  7. Когда слияния клеточного слоя в колбах достигнут, повторите шаги 2,1 до 2,6. Клеточные культуры до прохода 2 можно использовать Fили экспериментов.

3. Механической стимуляции для индукции волны кальция

  1. Загрузите клетки в слайд-камерные с 10 мкМ Fluo-4 утра в фосфатно-буферном солевом растворе в течение 30 мин при 37 ° С при осторожном встряхивании.
  2. Удалить Fluo-4 утра раствор, промыть клетки пять раз забуференным фосфатом физиологическим раствором, клетки инкубировали с фосфатным буферным солевым раствором и оставить клетки в течение 5 мин при комнатной температуре перед измерением.
  3. Excite при 488 нм с аргоном и использованием лазерных светоделителе HFT 488, собирать флуоресценции при 530 нм с использованием longpass эмиссионный фильтр LP 505, установите отверстие на минимум. Используйте масло погружения объектив 40X (воздуха, 1,2 NA). В экспериментах с ARL-67156, использовать объектив 10X (воздуха, 0,3 NA).
  4. Искать по области, в которой клетки сливающийся на конфокальной микроскопии.
  5. Позиция пипетки так, чтобы она при температуре 45 ° по отношению к каретке камерные и прикосновения к клеточной мембране.Спровоцировать короткий (≈ 1 сек) механическое раздражение в одну ячейку. Механическую стимуляцию состоит из острого, кратковременные деформации ячейки, прикоснувшись менее 1% клеточной мембраны со стеклянной микропипетки (диаметр кончика <1 мкм), соединенный с пьезоэлектрическим кристаллом nanopositioner, управляется через усилитель который установлена ​​на микро-манипулятором. Стеклянные микропипетки сделаны с микроэлектродом съемника. Убедитесь, что nanopositioner управляется напряжением от 0,2 до 1,5 В при механической стимуляции. Напряжение выше 1,5 В может привести к повреждению клеток. Для каждого типа клеток и состояние, оптимальное напряжение на механическую стимуляцию без повреждения клетки должны быть тщательно определена путем применения серии напряжений, начиная с низкой (0,2 В) до высокой (1,5 В) напряжения. Напряжение является мерой силы стимуляции, так как это напряжение определяет механические напряжения и деформации, которые применяются к клеточной мембране.силу механическую стимуляцию может быть рассчитано умножением механических напряжений с областью. Так как обе области (<3,14 мкм 2) и механическое напряжение очень низкие, сила механическую стимуляцию низка. (Обратите внимание, что, когда клетка повреждена, рассеивание флуоресценции из клетки и клетки темнеет.)
  6. Измерьте пространственных изменений [Ca 2 +] я после механической стимуляции с конфокальной микроскопии.
  7. Сбор и хранение изображений.
  8. Нарисовать многоугольные области, представляющей интерес для определения общей площади поверхности чувствительных клеток (активная область, AA) с помощью программного обеспечения из конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Все эксперименты выполнены с соблюдением всех соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов и протокола демонстрируется осуществляется под руководством и утверждение содержания и использования животных комитета Католический университет Левена.

В бычьих эндотелиальных клеток роговицы (BCEC), функциональных щелевых выражаются и обе щелевые межклеточные связи и паракринные межклеточной коммуникации вносят значительный вклад в межклеточной коммуникации в интерактивном режи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой рукописи, мы опишем простой метод измерения межклеточных Ca 2 +-волн в монослоям первичных бычьих эндотелиальных клеток роговицы путем предоставления локализованных и контролируемой механической стимуляции с помощью микропипетки. Механически стимулированных клетки реагируют с локальным повышением внутриклеточного IP 3 и Ca 2 +, оба из которых имеют важное значение внутриклеточных сигнальных молекул, которые управляют межклеточных Ca 2 +-волн 11,67. IP-3 напря...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Научно-исследовательская работа выполнена в лаборатории при поддержке грантов от Фонда исследований в области - Фландрия (FWO; номера грантов и G.0545.08 G.0298.11), Межвузовской достопримечательность поляков программы (бельгийские политики в области науки; P6/28 номер гранта и P7/13) и встроена в FWO Исследования, поддерживаемые сообществом. ЦРБ после защиты докторской диссертации научно-исследовательского фонда - Фландрия (FWO). Авторы очень благодарны всем нынешним и бывшим членам лаборатории молекулярной и клеточной сигнализации (Католический университет Левена), д-р SP Шринивас (Университет Индианы Школа оптометрии, США), лаборатория доктора Leybaert (Гентский университет) и Доктор Vinken (БСУ), которые предоставили полезные обсуждения, оптимизированные процедуры или были вовлечены в разработку инструментов для изучения коннексином полуканалы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS)Молекулярные зонды Invitrogen-Gibco (Карлсруэ, Германия)14155-048
Йодсигма-Альдрич (Дайзенхофен, Германия)38060-1EA
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Молекулярные зонды Invitrogen-Gibco (Карлсруэ, Германия)11960-044
L-глутамин (глутамакс)Молекулярные зонды Invitrogen-Gibco (Карлсруэ, Германия)35050-038
Амфотерицин-BSigma-Aldrich (Deisenhofen, Германия)A2942
Антибиотик-антимикотическая смесьInvitrogen-Gibco-Molecular Probes (Карлсруэ, Германия)15240-096
ТрипсинInvitrogen-Gibco-молекулярные зонды (Карлсруэ, Германия)25300-054
DulbeccoМолекулярные зонды PBS Invitrogen-Gibco (Карлсруэ, Германия)14190-091
Fluo-4 AMInvitrogen-Gibco-молекулярные зонды (Карлсруэ, Германия)F14217
ARL-67156 (6-N,N-диэтил-b,g-дибромметилен-D-АТФ) Sigma-Aldrich (Дайзенхофен, Германия)A265
Апираза VISigma-Aldrich (Дайзенхофен, Германия)A6410
Апираза VIISigma-Aldrich (Deisenhofen, Германия)A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)Синтез пептидов
на заказ Gap27 (SRPTEKTIFII)Синтез пептидов
Peptide (SRGGEKNVFIV)Синтез пептидов
на заказ siRNA1 Cx43 (смысл: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Отожженная миРНК была приобретена в Eurogentec (Луйк, Бельгия)
siRNA2 Cx43 (смысл: 5'CAAUUUCCUGCCGCAAUdTdT) Отожженная миРНК была приобретена в Eurogentec (Луйк, Бельгия)
siRNA scramble: скремблированная последовательность siCx43-1 (смысл: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Отожженная миРНК была приобретена в Eurogentec (Луйк, Бельгия)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)Thermo Electron (Ульм, Германия)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ульм, Германия)
Двухкамерные стеклянные стеклаLaboratory-Tek Nunc (Роскилле, Дания)155380
Конфокальный микроскоп Carl Zeiss Meditec (Йена, Германия)LSM510
Пиез– лектричный кристаллический нанопозиционер (Piezo Flexure NanoPositioner)PI Polytech (Карлсруэ, Германия)P-280
HVPZT-усилительPI Polytech (Карлсруэ, Германия)E463 HVPZT-усилитель
Стеклянные трубки (замена стекла 3,5 нанолитра)World Precision Instruments, Inc. Сарасота, Флорида, США4878
Micr– lectrode puller Zeitz Instrumente (Мюнхен, Германия)WZ DMZ-Универсальный съемник
на заказ Control

Ссылки

  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074(2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6(2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451(2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8(2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Fluo4 AM

Похожие статьи