Выделение эмбриональных клетках эндотелия желудочков

Краткое содержание

Первичные культуры клеток является полезным методом для анализа конкретных популяций клеток, в частности из трансгенных эмбрионов мыши на определенных этапах своего развития. При этом эмбриональная желудочков расчленены и диссоциированных и антител конъюгированных бисера признать и выделить эндотелиальные клетки для дальнейшего анализа.

Аннотация

Клеточные культуры в значительной степени повысить нашу способность оценивать отдельных популяций клеток в культуре множества условий. В то время как увековечены клеточных линий предлагают значительные преимущества для их простоту использования, эти клеточные линии недоступны для всех потенциальных типов клеток. При изоляции первичных элементов из определенной области интересов, в частности, от трансгенных мышей, больше нюансов исследования могут быть выполнены. Основной метод предполагает рассечение органа или частичном орган интерес (например, сердце или конкретной области сердца) и диссоциации органа отдельные клетки. Затем эти клетки инкубировали с магнитными шариками конъюгированным с антителом, которое распознает тип клеток, представляющих интерес. Интерес клетки могут быть затем выделена с использованием магнита, с короткой инкубации трипсин диссоциации клеток из шариков. Эти изолированные клетки могут быть затем культивировали и анализировали, как хотелось бы. Этот метод был первоначально разработан для взрослого органа мышис, но может быть легко уменьшено для использования с эмбриональных органов, как показано здесь. Поскольку наш интерес в развивающихся коронарных артерий, мы хотели изучить эту популяцию клеток в течение определенных эмбриональных стадиях. Таким образом, исходный протокол должен быть изменен, чтобы быть совместимым с небольшим размером эмбриональных желудочков и низким потенциалом выход эндотелиальных клеток на этих стадиях развития. Используя эту уменьшенную подход, мы оценили ремоделирования коронарных сплетения в трансгенных эмбриональных желудочка эндотелиальных клеток.

Введение

Появление увековечены клеточных линиях революции основная клеточная биология ^1. В настоящее время доступные клеточные линии, полученные из широкого круга органов и охватывает все основные типы клеток. Тем не менее, установлено клеточные линии имеют некоторые ограничения. Процесс иммортализацией очевидно изменяет поведение клеток, в частности в отношении продолжительности жизни и пролиферацию, но также может влиять на экспрессию неожиданный белки, такие как белки цитоскелета ^2. Кроме того, хотя различные клеточные линии, которые доступны, существуют значительные различия между даже одного типа клеток в течение всего организма. Эндотелиальные клетки, в частности, разнообразные шоу поведения, на основании их линии артерий или вен и какой поток присутствует в емкости ^3. Еще более актуальным с точки зрения развития, однако, является то, что подавляющее большинство из доступных клеточных линий, полученных из взрослых тканей (см., например TОн коллекции доступны через АТСС). Эти взрослые клеточные линии, вероятно, не повторять динамический характер их эмбриональные предшественники. Быстро меняется пространственно-временной экспрессии генов наблюдалось во время разработки также показывают, что эндотелиальные клетки от одного органа в данной стадии развития не может вести себя так же, как эндотелиальные клетки от одного органа на другой стадии развития.

В качестве альтернативы с использованием коммерчески доступных иммортализованных линий клеток, первичные элементы могут быть изолированы от конкретной ткани, представляющих интерес. Среди преимуществ этой техники, эти первичные клетки могут быть выделены из конкретного органа или части органа в любой конкретной стадии развития. Кроме того, эти первичные клетки могут быть выделены из широкого спектра доступных трансгенных животных, позволяя в пробирке изучение нокаут гена и нокаут в избегая при этом другие проблемы, такие как эффективность трансфекции. Неудивительно, что многиеметодов были опубликованы подробно, как изолировать специфические типы клеток ^4,5. В общем, эти методы включают сбор области, представляющей интерес, диссоциации клеток, пометки конкретного типа клеток интереса, и выделение этих клеток для дальнейшего анализа.

Для изучения раннего эмбрионального населения коронарных эндотелиальных клеток, мы уменьшено ранее опубликованных методика ⁴ для использования с меньшим органа. С этим уменьшенную процедуру, мы можем изолировать коронарных эндотелиальных клеток из эмбрионального сердца в определенных эмбриональных стадиях. Эти клетки могут быть затем использованы в традиционных эндотелиальных анализов, таких как миграция анализов. До начала линий эмбриональных не стала более распространенной, работа с первичными клетками является бесценным технику.

Протокол

1. Подготовьте антителами конъюгированных Бисер

1. За один день до вскрытия, комбинировать антитела по выбору с соответствующим Dynabeads (например, IgG крысы Dynabeads на антителе, выработанном в крыса, 4 × 10 ⁸ бисер / мл) в соответствии с инструкциями производителя. Для крыс BD анти-CD31 антителами (0,5 мкг / мл, использовали для выделения эндотелиальных клеток), 3 мкл антител добавляется на каждые 25 мкл шариков, для конечной концентрации 1,5 мкг анти-CD31 антитело и 1 × 10 ⁷ бисер / 25 мкл буфера.
2. Выдержите бисером и антител в течение ночи при 4 ° С.

2. Подготовка Коллаген Plate

1. Изолированные клетки образуют канальцев быстрее при выращивании на коллагеновый гель в противоположность простому покрытых коллагеном пластины. Поэтому, коллаген гели сделаны в ночь перед рассечение, как описано в ^6. На льду в капюшоне культуры ткани, объединить следующие реагенты (достаточно для 19 скважин): 206,4 мкл стерильной H <суб> 2 O, 140,4 мкл коллагена типа I (4,08 мг / мл), 38,4 мкл 10х M199 и 1,15 мкл 5 М NaOH.
2. Пипеткой 20 мкл этого коллагеновый гель в лунки 384-луночный планшет для тканевых культур. Место пластины в 37 ° C культуре ткани инкубаторе в течение 30 мин.
3. Добавить 80 мкл DMEM в каждую лунку и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° C. Удалить культуральной среды и повторите еще два раза.
4. По завершении последней промывки, добавьте 80 мкл 10% ФТС / DMEM в каждую лунку и инкубировать в течение ночи при 37 ° С. Удалить культуральной среде перед добавлением изолированных клеток.

3. Акцизные и переварить сердца

1. Усыпить тайм-беременные мыши на нужной день эмбрионального развития с использованием утвержденной эвтаназии технику. Все эксперименты были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл.
2. С помощью мыши в лежачем положении, обильно распылить вентральной стороне женщин с 70% этанолом дорассечение. Использование щипцов для подъема нижней части живота, кожа и мышцы от внутренних органов, разрезать нижнюю брюшную полость самки для визуализации внутренних органов.
3. Холдинг шейки матки щипцами, аккуратно вырезать каудальнее щипцов и начать подъема рога матки из брюшной полости. Поднимая рога матки, срежьте любой соединительной ткани, которая держит рог на месте. Чтобы закончить вырезания рога матки, вырезать стыке рога матки с яйцевода освободить рога матки.
4. Поместите рога матки в чашку Петри, содержащую холодный 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) и полоскание по мере необходимости. Разрезать рог матки через среднюю линию, чтобы открыть прилагаемый эмбриональных мешков.
5. Разрежьте зародышевого мешка на стыке плаценты и эмбриона, чтобы избежать случайного резки эмбриона и получения эмбриона. Поместите эмбриона во второй чашке Петри с холодным PBS. Вернуться чашки Петри с роге матки в лед.
6. Реecapitate эмбриона для улучшения доступа к грудной стенке. Если генотипирования необходимо, отрежьте хвост, чтобы удалить его и сохранить в трубке Эппендорф помещают на лед.
7. С эмбрионом на спине, разрезать грудную стенку для визуализации сердца и легких. Чтобы предотвратить выпадение сердца, чтобы вертикальный разрез вдоль боковой части грудной клетки, вблизи передних конечностей, а затем горизонтальный разрез в нижней части ребра, затем осторожно тянуть грудной стенки вверх и в сторону. Вплоть до примерно 13,5 дня эмбрионального развития, грудная стенка прозрачная, пособничество в визуализации.
8. Осторожно поднимите сердца с помощью щипцов и перерезал сосуды ниже. Затем на голову выше магистральных сосудах, чтобы освободить сердце. Если легочные сосуды не обрезаются, легкие могут быть удалены с сердцем. Таким образом, удаления посторонних тканей, например, легких, если это необходимо.
9. Отделить и отбросить предсердия и магистральных сосудах из желудочков. Используя ножницы, пропустить через мясорубку желудочков на мелкие кусочки (примерно 1 мм ^{3 <}/ Вир>) и место в приблизительно 500 мкл коллагеназы (1 мг / мл в стерильном PBS). Хранить образцы на льду, пока все желудочков не было измельчают и помещают в коллагеназы.
10. Повторите предыдущие шаги, пока желудочки не был вырезан из всех эмбрионов, собирая каждое сердце в отдельную пробирку Эппендорф. Если все эмбрионы имеют одинаковый генотип, сердца, могут объединяться в одну трубу Эппендорф. Количество образцов обработанных за один раз может быть ограничено на основе магнита используется для изоляции; DynaMag (123-21D), используемый здесь помещается не более 16 труб Эппендорф.
11. Положите фарш желудочков при 37 ° С с качания в течение 45 мин. Каждые 15 мин, осторожно удалить образцы и пипетку вверх и вниз для механической диссоциации клеток.

4. Изоляция эндотелиальных клеток

1. Проход желудочка раствор коллагеназы через 70 мкм фильтр для удаления оставшегося группы клеток.
2. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 10 мин. ОтбрасыватьСупернатант, замените приблизительно 200 мкл 10% FBS в DMEM и пипетку вверх и вниз для диссоциации клеток.
3. Повторите предыдущий шаг один раз. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 10 мин после стирки второго 10% FBS / DMEM. Ресуспендируют клеток в 50 мкл 10% FBS / DMEM.
4. На заключительной стадии центрифугирования, готовят шариков.
   1. Поместить пробирку Эппендорфа, содержащие антитело и бусы на магнит в течение 1 мин.
   2. С трубкой на месте на магнит, удалить супернатант. Удалить трубки от магнита и добавляют приблизительно 100 мкл 10% FBS / DMEM.
   3. Поместите пробирку на магнит в течение 1 мин. Удалить супернатант и снова вымыть с 10% FBS / DMEM. Повторите эти действия для в общей сложности 3 стирок.
   4. После последней промывки, ресуспендируют антитела конъюгированы шариков в 10% FBS / DMEM (5 мкл на образец).
5. Для каждого образца клеток, добавляют 5 мкл антитела конъюгированы шариков. Поместите шарик-клеточные суспензии при 4 ° С с качалки FOR 30 мин.
6. В ламинарном боксе, поместите пробирки Эппендорфа, содержащие клетки и антитела, конъюгированного шариков на магнит в течение 1 мин. Удалить супернатант, удалите труб от магнита и промывали около 100 мкл 10% ФТС / DMEM. Повторите на 5 промывок.
7. После последней промывки, поместить пробирки на магнит в течение 1 мин, удалить супернатант, и снимите трубки от магнита. Добавьте примерно 100 мкл DMEM.
8. Место труб на магнит в течение 1 мин, удалить супернатант и удаления труб от магнита. Добавить 100-200 мкл предварительно нагретого 0,25% трипсин-ЭДТА. Инкубируйте образцы при 37 ° С и 5% СО _{2 в} течение 5 мин.
9. Место труб на магнит в течение 2 мин. Тщательно передачи содержащие клетки супернатант в свежие пробирки Эппендорфа. Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г.
10. Удалить супернатант. Ресуспендируют клеток в 80-100 мкл среды роста и пластины в 96 - или 384-луночные культуральные чашки обрабатывали, в зависимости от ожидаемого выхода(Примерно 450-600 клеток из желудочков E14.5-E16.5 эмбрионов). Для эндотелиальные клетки, эндотелиальные использовать культуральную среду роста (как определено ниже).

Результаты

Использование эндотелиальных конкретных антитело, которое распознает CD31, эндотелиальные клетки были выделены из желудочков эмбриональных (E) 13,5 (Фиг.1А) и 18,5 (фиг. 1B-1D) эмбрионов. При выращивании на необработанную блюдо культуры, эти клетки остаются округлые и образовали бы булыжник образцу, если рядом с сливной (рис. 1А). Развести коллаген также используется для нанесения покрытия на скважинах, и в то время как эндотелиальные клетки будут прилипать к нему

Обсуждение

Работа с первичной эмбриональных клеток позволяет разрабатывать новые эксперименты, чтобы обратиться в пробирке важных шагов развития. Тем не менее, процедуры выделения не является тривиальной. Критические шаги выделения любого типа клеток, включают обеспечение того, чтобы клетки хорошо разделены на коллагеназой и затем что они хорошо приостановлено во время промывания. Механическое вскрытие с помощью пипетки очень помогает отделения клеток в течение коллагеназы шаг и этап фильтрации удаляет скопления клеток. Э...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
REAGENTS
Timed-pregnant			Для препарирования на эмбриональной стадии интереса
Anti-mouse CD31	BD Bioscience	553370
Крыса IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
Коллаген	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
Коллагеназа, тип I	Worthington Biochemical	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Среда для роста эндотелиальных клеток	(изготовлена в лаборатории, как описано в примечаниях)		содержащая 20% FBS, 5 μ М β-mercapt– танол, 50 μ г/мл ЭКГ и 1x пенициллин/стрептомицин
β-mercapt– танол	Sigma-Aldrich	M6250
ECGS	Biomedical Technologies, Inc.	BT-203
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140
Трипсин-ЭДТА	Gibco	25300
384-луночный культуральный планшет	Greiner	T-3037-6	Планшет был приготовлен с тонким коллагеновым гелем, как описано в 6; площадь рабочей поверхности 10 мм2
Коллаген типа I	BD	354236	Использование в конце концентрация 1,5 мг/мл
M199, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	Используется в соответствии с указаниями в 13
EQUIPMENT
Стереоскопический микроскоп	Nikon	SMZ645
Инкубатор для клеточных культур	Thermo	3110
DynaMag	Invitrogen	123-21D
Настольная центрифуга	Thermo	75002430

мыши DMEM,