Выделение эмбриональных клетках эндотелия желудочков

Краткое содержание

Первичные культуры клеток является полезным методом для анализа конкретных популяций клеток, в частности из трансгенных эмбрионов мыши на определенных этапах своего развития. При этом эмбриональная желудочков расчленены и диссоциированных и антител конъюгированных бисера признать и выделить эндотелиальные клетки для дальнейшего анализа.

Аннотация

Клеточные культуры в значительной степени повысить нашу способность оценивать отдельных популяций клеток в культуре множества условий. В то время как увековечены клеточных линий предлагают значительные преимущества для их простоту использования, эти клеточные линии недоступны для всех потенциальных типов клеток. При изоляции первичных элементов из определенной области интересов, в частности, от трансгенных мышей, больше нюансов исследования могут быть выполнены. Основной метод предполагает рассечение органа или частичном орган интерес (например, сердце или конкретной области сердца) и диссоциации органа отдельные клетки. Затем эти клетки инкубировали с магнитными шариками конъюгированным с антителом, которое распознает тип клеток, представляющих интерес. Интерес клетки могут быть затем выделена с использованием магнита, с короткой инкубации трипсин диссоциации клеток из шариков. Эти изолированные клетки могут быть затем культивировали и анализировали, как хотелось бы. Этот метод был первоначально разработан для взрослого органа мышис, но может быть легко уменьшено для использования с эмбриональных органов, как показано здесь. Поскольку наш интерес в развивающихся коронарных артерий, мы хотели изучить эту популяцию клеток в течение определенных эмбриональных стадиях. Таким образом, исходный протокол должен быть изменен, чтобы быть совместимым с небольшим размером эмбриональных желудочков и низким потенциалом выход эндотелиальных клеток на этих стадиях развития. Используя эту уменьшенную подход, мы оценили ремоделирования коронарных сплетения в трансгенных эмбриональных желудочка эндотелиальных клеток.

Введение

Появление увековечены клеточных линиях революции основная клеточная биология ^1. В настоящее время доступные клеточные линии, полученные из широкого круга органов и охватывает все основные типы клеток. Тем не менее, установлено клеточные линии имеют некоторые ограничения. Процесс иммортализацией очевидно изменяет поведение клеток, в частности в отношении продолжительности жизни и пролиферацию, но также может влиять на экспрессию неожиданный белки, такие как белки цитоскелета ^2. Кроме того, хотя различные клеточные линии, которые доступны, существуют значительные различия между даже одного типа клеток в течение всего организма. Эндотелиальные клет....

Протокол

1. Подготовьте антителами конъюгированных Бисер

1. За один день до вскрытия, комбинировать антитела по выбору с соответствующим Dynabeads (например, IgG крысы Dynabeads на антителе, выработанном в крыса, 4 × 10 ⁸ бисер / мл) в соответствии с инструкциями производителя. Для крыс BD анти-CD31 антителами (0,5 мкг / мл, использовали для выделения эндотелиальных клеток), 3 мкл антител добавляется на каждые 25 мкл шариков, для конечной концентрации 1,5 мкг анти-CD31 антитело и 1 × 10 ⁷ бисер / 25 мкл буфера.
2. Выдержите бисером и антител в течение ночи при 4 ° С.

2. Подготовка Коллаген Plate

Результаты

Использование эндотелиальных конкретных антитело, которое распознает CD31, эндотелиальные клетки были выделены из желудочков эмбриональных (E) 13,5 (Фиг.1А) и 18,5 (фиг. 1B-1D) эмбрионов. При выращивании на необработанную блюдо культуры, эти клетки остаются округлые и образовали бы булыжник образцу, если рядом с сливной (рис. 1А). Развести коллаген также используется для нанесения покрытия на скважинах, и в то время как эндотелиальные клетки будут прилипать к нему

Обсуждение

Работа с первичной эмбриональных клеток позволяет разрабатывать новые эксперименты, чтобы обратиться в пробирке важных шагов развития. Тем не менее, процедуры выделения не является тривиальной. Критические шаги выделения любого типа клеток, включают обеспечение того, чтобы клетки хорошо разделены на коллагеназой и затем что они хорошо приостановлено во время промывания. Механическое вскрытие с помощью пипетки очень помогает отделения клеток в течение коллагеназы шаг и этап фильтрации удаляет скопления клеток. Э.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
REAGENTS
Timed-pregnant			Для препарирования на эмбриональной стадии интереса
Anti-mouse CD31	BD Bioscience	553370
Крыса IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
Коллаген	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
Коллагеназа, тип I	Worthington Biochemical	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Среда для роста эндотелиальных клеток	(изготовлена в лаборатории, как описано в примечаниях)		содержащая 20% FBS, 5 μ М β-mercapt– танол, 50 μ г/мл ЭКГ и 1x пенициллин/стрептомицин
β-mercapt– танол	Sigma-Aldrich	M6250
ECGS	Biomedical Technologies, Inc.	BT-203
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140
Трипсин-ЭДТА	Gibco	25300
384-луночный культуральный планшет	Greiner	T-3037-6	Планшет был приготовлен с тонким коллагеновым гелем, как описано в 6; площадь рабочей поверхности 10 мм2
Коллаген типа I	BD	354236	Использование в конце концентрация 1,5 мг/мл
M199, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	Используется в соответствии с указаниями в 13
EQUIPMENT
Стереоскопический микроскоп	Nikon	SMZ645
Инкубатор для клеточных культур	Thermo	3110
DynaMag	Invitrogen	123-21D
Настольная центрифуга	Thermo	75002430

мыши DMEM,