Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии

Краткое содержание

Эта статья демонстрирует протокол для характеристики механических свойств живых клеток с помощью микроиндентирования с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ).

Аннотация

Механические свойства клеток и внеклеточного матрикса (ECM) играют важную роль во многих биологических процессах, включая дифференцировку стволовых клеток, образование опухолей, и заживление ран. Изменение жесткости клеток и ECM часто являются признаками изменения в физиологии клеток или заболеваний в тканях. Таким образом, жесткость элемент является индексом для оценки состояния клеточных культур. Среди множества методов, применяемых для измерения жесткость клеток и тканей, микро-отступа использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) обеспечивает возможность надежного измерения жесткость живых клеток. Этот способ широко применяется для описания микро-масштабе жесткости для различных материалов, начиная с металлических поверхностей мягкой биологической ткани и клетки. Основной принцип этого метода является создание отступа ячейки с иглой АСМ выбранной геометрии и измерения приложенной силы от изгиба кантилевера АСМ. Установка силового отступы кривой в режим Hertzл для соответствующей геометрии наконечника может дать количественные измерения жесткости материала. Эта статья демонстрирует процедуру для характеристики жесткости живых клетках с помощью АСМ. Ключевые шаги в том числе процесс калибровки АСМ, сила-кривой приобретения, а также анализ данных с использованием обычного MATLAB демонстрируются. Ограничения этого метода также обсуждаются.

Введение

Механические свойства, особенно жесткости отдельных клеток и окружающей их внеклеточного матрикса (ECM) являются критическими для многих биологических процессов, в том числе рост клеток, подвижность, деление, дифференцировку и тканевого гомеостаза. ¹ Было показано, что клетки механическую жесткость в основном определяется цитоскелета, особенно сетей актина и промежуточных филаментов и других белков, связанных с ними. ² Результаты механических испытаний на сетях в пробирке актина и промежуточных филаментов предполагают, что клетки механика во многом зависит от структуры цитоскелета и предварительного напряжения в цитоскелета. ^3-5 Жесткость живых клеток затем рассматривается в качестве индекса для оценки структуры цитоскелета, ^{6, 7} активность миозина и многих других клеточных процессов. Более того, изменения в клеточной механические свойства также часто оказывается тесно свяated с различными условиями заболеваний, таких как образование опухолей и метастазов ^8-10 мониторинга механической жесткости живые клетки, следовательно, обеспечить новый способ контроля клеточной физиологии;. для обнаружения и диагностики заболеваний ^8;. а также для оценки эффективности медикаментозного лечения ^{11 , 12}

Несколько методов, включая частицы отслеживания микрореология, ^13-16 магнитный цитометрии скручивание, ¹⁷ микропипетки стремление ^18,19 и микроиндентирования ^20-22 были разработаны для измерения эластичности клеток. Микрореология отслеживания частиц прослеживает тепловых колебаний либо флуоресцентные частицы субмикронного вводили в клетки или координатных меток внутри клетки цитоскелета. ⁺²³ Упругих и вязких свойств клеток рассчитывается из измеренного смещения частиц использованием ФДТ. ^14,23 Этот метод позволяет одновременных измерений местныхмеханических свойств с высоким пространственным разрешением в разных местах в клетке. Тем не менее, инъекционное флуоресцентные частицы в клетки может привести к изменению клеточной функции, структуры цитоскелета, и, следовательно, клетки механики. Метод микропипетки пронизывает отрицательного давления в микропипетки с диаметром в диапазоне от 1 до 5 мкм, чтобы сосать небольшой кусок клеточную мембрану в пипетку. Сотовые жесткость рассчитывают из прикладной отрицательное давление и клеточные мембраны деформации. ¹⁸ Этот метод, однако, не может обнаружить неоднородное распределение жесткость по всей клетке. Магнитные цитометрии скручивание (ВТС) применяется магнитное поле для создания крутящего момента на супер шарики парамагнитный прикреплен к клеточной мембране. ¹⁷ сотовый жесткости происходит в этом методе из соотношения между приложенным крутящий момент и крутящий деформации клеточной мембраны. Это трудно контролировать расположение магнитных шариков в методе МТС, и это также challengiнг охарактеризовать деформация кручения с высоким разрешением. Микроиндентирования относится индентора с четко определенными геометрии пробить в клетку. Отступов силы и в результате углубление в клетках часто следуют предсказания модели Герца. Модуль Юнга клеток, может быть рассчитана по силе отступа кривые путем установки их в герцах модели. Этот способ широко применяется для проверки механических свойств тканей и клеток, несмотря на его ограничения, такие как неопределенность в точке контакта определение, применимость модели Герца, а также возможность физически повредить клетки. Среди многих устройствах для microindentaion ^20, атомно-силовой микроскоп (АСМ) является коммерчески доступной и широко применяется для характеристики механических свойств живых клетках и тканях ^21,24-27.

Эта статья демонстрирует порядок использования Asylum MFP3D-Bio AFM охарактеризовать клетку механики. AFM не налы обеспечивает высокое разрешение топографию элементов, но и широко применяется для характеристики механических свойств клеток ткани. Принцип отступа АСМ показано на рисунке 1. АСМ кантилевера приближается клетку от нескольких микрометров выше; вступает в контакт с клеткой; отступы ячейки таким образом, чтобы отклонение кантилевера достигает заданной уставки, и отрывается от клетки. Во время этого процесса изгиба кантилевера записывается в виде функции его расположения, как показано на рисунке 1. , Прежде чем связаться с клеткой, кантилевера движется в среде без видимых отклонений. Когда отступа на клетку, кантилевер изгибам и увеличивает отклонение сигнала. Кантилеверов смоделированы как упругих стержней так, чтобы их отклонение пропорционально силе, приложенной к ячейке. Установив максимальный прогиб кантилевера, максимальная величина силы, приложенной к образцу ограничено, чтобы избежать гAmage к клеткам. Часть силовой кривой из точки В в точку С на рисунке 1, где кончик отступы в клетку, не благонадежен для модели Герца, чтобы извлечь клетки жесткость.

Рисунок 1. Иллюстрация AFM микроиндентирования и интерпретация кривой усилия. Верхней панели показано движение кантилевера АСМ обусловлен сканер пьезо. Вертикальное расположение консольные г и изгиба кантилевера сигнал г записывается в ходе процесса. Консольные начинается от точки, в несколько микрометров выше клетку. При приближении к клетке, δ образец отступа остается равным нулю, пока не достигнет точки В, где кончик входит в контакт с клеткой. Координаты точки B в сюжете критические значениядля анализа данных, обозначаемых (Z _0, D _0>). От В к С, кантилевер отступы в клетку до изгиба кантилевера не достигает заданного значения, которое установлено, что соотношение между целевой максимальный отступа силы и жесткости кантилевера. После отклонения сигнала достигает заданного максимального значения, консольные затем удаляется из клетки к точке D, где она часто вырваться вниз под зонд-образец адгезия, отделяется от клетки и возвращается на прежнее место при Е. На правой панели показана взаимосвязь между углублением и записанного г и г сигнала. В левой нижней панели представляет собой график кривой, силы, максимальный отступ консольные, из которых пружины измеряется быть 0.07N / м, установлен на уровне 17 нм так, чтобы максимальное отступов силы, приложенной к образец 1,2 NN. Ключевые места во время отступа будут отмечены.

Протокол

1. Калибровка жесткость пружины кантилевера

1. Загрузка кантилевера АСМ в соответствии с инструкциями производителя. Это необходимо очистить держатель зонда с этанолом перед любым экспериментов. Это поможет ограничить бактериальное загрязнение к культуре во время измерений АСМ.
2. Калибровка InvOLS (обратное Чувствительность оптического рычага). Этот параметр описывает количество фотодиодов ответа (Вольт) на нанометр отклонений кантилевера.
3. Загрузите чистое предметное стекло на предметный столик, а затем установить голову АСМ и отрегулируйте лазерного луча и приведение в соответствие с инструкциями производителя. Engage иглой АСМ на стекле.
4. С пьезо отозвана, перестроить зеркало на фотодиод чтение -2 V. Выполните измерения силовой спектроскопии с точки запуска (максимальный отклик фотодиод) +2 В.
5. С пьезо отозвана, перестроить зеркало на фотодиод чтение -2 V. Выполните FORCE спектроскопических измерений с точки запуска (максимальный отклик фотодиод) +2 В. Примечание: Значения напряжения здесь являются специфическими для Asylum АСМ. Это значение должно быть установлено в соответствии с инструкциями, предоставляемыми компанией производителем.
   После сбора данных завершена, увеличить, чтобы фирма-области контакта силовой кривой. Выполните линейной аппроксимации в этот регион, чтобы найти наклон, который будет в В / нм. Обратная этого значения описывает Светочувствительность консольно-фотодиод ансамбля.
6. Сброс зеркало выравнивание к свободному отклонение 0 В.
7. Калибровка жесткости кантилевера. Тепловой настройки метод используется для определения пружина кантилевера ^28.
8. После калибровки InvOLS, поднимите сканер от образца этапе такие, что нет взаимодействия между зондом и образцом.
9. Начать захват тепловых данных. Во время этого процесса тепловой вибрации консоли луч RecordeD. Программное обеспечение АСМ анализирует спектр мощности такие тепловые вибрации и участки его в окне данных.
10. Через несколько секунд сбора данных, выполните подходят к сегменту данных с центром в самой низкочастотной (основного резонанса) пик, чтобы определить жесткость пружины.

2. Загрузки образца

1. Установить принадлежность Блюдо нагревателя на сцене AFM, если уже не оборудованы.
2. Установите температуру до 37 ° С, и ждать в течение 20 мин для системы достичь стабильного теплового равновесия.
3. Место культуры блюдо на сцене AFM и закрепите его с помощью хомута снабжены блюдо нагревателя. Важно, чтобы свести к минимуму времени между удалением блюдо из инкубатора и размещение его на стадии, чтобы избежать травм к клеткам. Для измерений более чем на 30 мин, CO ₂ независимых среда должна быть использована для замены нормальной культуральной среде.
4. Нанесите небольшое падение 37 ° C культуральной среде до кончика тОн АСМ кантилевера, и опустите голову АСМ, пока наконечник не просто погружен в жидкость.
5. Используя вид сверху ПЗС-камеры, перестроить лазерного луча на кантилевер (выравнивание в жидкости будет иным, чем в воздухе, из-за изменения показателя преломления среды).
6. Engage иглой АСМ на чистую площадь культуры блюдо.
7. Выполнить калибровку InvOLS как описано выше, на кантилевер чувствительность в жидкой среде.

Примечание: а) если клетки культивируют на гидрогели, калибровка InvOLS должна быть выполнена заранее против нижней поверхности чашки для культивирования заполнены среды для культивирования клеток. При переключении на образцы клеток, особое внимание должно быть уделено не изменить выравнивание лазерного луча с кантилевера. б) InvOLS должен быть откалиброван всякий раз, когда происходит изменение в лазерном выравнивания. в) Кроме того, рекомендуется принимать InvOLS как среднее значение из нескольких калибровочных кривых, сосле каждой калибровки генерирует различные InvOLS. Изменение InvOLS, однако, мала по сравнению со средним значением. Например, калибровки Bruker DNP-10 кантилевер с жесткостью 0,06 Н / м в жидком в 100 раз производить среднее значение InvOLS 66,3 нм / В, со стандартным отклонением только 0,5 нм / В.

3. Сбор силовые кривые клеточной отступов

1. Выберите ячейку для отступа. С помощью оптического микроскопа, перемещать этап в положение кантилевера выше ячейки так, чтобы кончик расположен в пери-ядер регионе. Точные регулировки консольном положении может быть осуществлено путем применения смещения к X и Y сканеров.
   Примечание: АСМ кантилевера должна быть снята с поверхности образца при перемещении предметного столика, чтобы выбрать клетку-мишень. Это защищает от консольной стук в образце, так как поверхности образца не может быть плоской.
2. Переключитесь на режим силовой спектроскопии. Установить отступскорость в пределах 1-10 мкм / сек, достаточно низкой, чтобы избежать гидродинамический эффект.
3. Установите точку отклонения триггера, который ограничивает максимальный отступ силы, чтобы избежать повреждения клеток. Выберите Относительная запуска вариант, который поправит любой дрейф в отклонении сигнала. Максимальное усилие 2 Nn является хорошей отправной точкой для большинства образцов. Эта величина, однако, должны быть скорректированы в соответствии с образцом жесткости. Для мягких образцов более низкое значение следует использовать, чтобы избежать чрезмерных отступов к образцу. Для жестких образцов высокого значения должны быть использованы для создания измеримых отступа.
4. Установить сила расстояние, достаточно большое для того, чтобы наконечник будет полностью отделенный от клеточной между силой измерений. Как правило, сила расстояние установлено на 5 мкм.
5. Управляйте AFM взять одну кривую силы.
6. Собрать не менее трех кривых силы в разных местах в пери-ядер регионе каждой ячейки. Хотя это полезно для съемки несколькихкривые на каждой ячейке для надежных статистических данных, принимая слишком много графики сил может привести к изменениям в ячейке жесткости из-за стресса от зонда АСМ.
7. При сборе данных завершена, снять наконечник, и повторите шаги 3.1-3.6 для столько ячеек, сколько необходимо для хороших статистических данных по сотовым жесткость при определенном условии образца. Как правило, клетки 30 измеряются для каждого состояния.

Для характеристики распределения жесткости в пределах одной ячейки, сила-карта режим применяется. В Force-режим карты, установить размер сканирования включить интересующей области; установить соответствующее разрешение, установить отступ параметры, как те, которые выбраны для одной кривой силы; AFM будет растровый через определенный пробной области и принять одно графики сил в каждом пикселе в образце регионе.

4. Анализ данных

Записанный графики сил, анализируются с помощью пользовательской процедуры MATLAB для расчета ячейки жесткости. Ниже приведено краткое описание процедуры MATLAB:

1. Программа MATLAB идентифицирует контакт координаты точки z0 и D0 (см. рисунок 1) с использованием алгоритма, принятого из опубликованного метода Лина и др. ^29.:
2. Для каждой точки данных на силовой кривой, выполните линейной аппроксимации данных слева от точки интереса, и Герц модели подходят вправо (с использованием выбранной точки в качестве начальной точки соприкосновения), до множества максимальным отступом (200-300 нм рекомендуется).
3. Для каждой точки, вычислить относительную погрешность RMS подходит как и подвести этих значений.
4. Точка, которая достигает минимума общей монтажной ошибки выбрана в качестве начальной точки соприкосновения.
   Примечание: Время вычислений может быть уменьшена за счет реализации золотого сечения поиска, а не линейно сканирования всей кривой силы.
5. Пример δ деформации и отступов силы F рассчитываются следующим образом:
   
6. Наименьших квадратов применяется, чтобы соответствовать F против δ данных в пост-контактной области, Z Z ≥ _0, в модели Герца, чтобы извлечь модуль Юнга, E ячейки:
   
   , Где V является коэффициент Пуассона.
   Примечание: при δ составляет более 10% от толщины образца (высота ячейки), то измеренное клетки жесткость зависит от жесткости подложки. Толщина пери-ядерной области, как правило, порядка нескольких микрометров. Таким образом, только первые 200-300 нм F-кривой δ пригодно для модели Герца.

Результаты

На рисунке 2а три представителя силовые кривые взяты из фибробластов 3T3 культивировали на пластиковой поверхности, полиакриламидном геле модулей Юнга 3000 Па и 17000 Па соответственно. После тщательного выявления точек контакта в кривые, отступов силы как функция деформации ячейки представлена ​​на рис 2b. Под силу величины меньше, чем 0,3 Н.Н., пирамидальной формы кончика отступы 3 мкм в клетку культивируют на 3 полиакриламидном геле кПа. В противоположность этому, усилие более 1,6 нн...

Обсуждение

Метод АСМ углубление имеет преимущества, чтобы охарактеризовать механические свойства живых клеток. Хотя и менее чувствительны, чем магнитные цитометрии скручивания и оптический пинцет, который может измерить силы на уровне piconewton ^32, АСМ может обнаружить силы сопротивления из образцов от десятков пико-Ньютона до сотен нано-Newton, сопоставимый с Диапазон силы, которая могут быть применены к клеткам с помощью микропипетки ^19. Этот диапазон силы отвечает потребностям создание значительных деформ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Атомно-силовой микроскоп	Asylum Research	MFP3D-BIO