Методическая статья

Визуализация черепно-лицевого развития в Sox10: Kaede Трансгенные данио рерио Линия Использование Покадровый конфокальной микроскопии

DOI:

10.3791/50525

⸱

30 сентября 2013 г.

 ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация экспериментальных данных стала ключевым элементом в представлении результатов для научного сообщества. Генерация живой покадровой записи растущих эмбрионов способствует лучшей презентации и понимания сложных процессов развития. Этот протокол является шаг за шагом руководство по маркировке элементов через фотопреобразования Kaede белка у рыбок данио.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Позвоночных палатогенезе является весьма Choreographed и сложный процесс развития, который включает в себя миграцию черепной нервного гребня (ЧПУ) клеток, конвергенции и расширения лицевых протуберанцев, и созревание черепно-лицевой скелет. Для изучения вклада черепной нервного гребня в конкретных регионах данио неба SOX10: Kaede трансгенных данио линия была сгенерирована. Sox10 предоставляет клонов ограничение Kaede репортера белка нервного гребня, тем самым делая клетку маркировка более точное процесс, чем традиционные краски или репортера инъекции мРНК. Kaede является фото-кабриолет белок, который меняет цвет с зеленого на красный после активации фото и дает возможность следить клетки точно. В Sox10: Kaede трансгенной линии была использована для выполнения анализа клонов очертить клеточные популяции с ЧПУ, которые приводят к верхнечелюстной против нижней челюсти элементов и иллюстрирующие гомологии лица протуберанцев в амниот. Этот протокол описывает шагс генерировать живой покадровой видео в Sox10: Kaede данио эмбрионов. Развитие решетчатой ​​пластине будет служить в качестве практического примера. Этот протокол может быть применен, чтобы сделать покадровой конфокальной запись любого Kaede или аналогичного photoconvertible репортерного белка в трансгенных данио рерио. Кроме того, он может быть использован для захвата не только нормальным, но также аномалии развития черепно-лицевых структур в данио мутантов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Орофациальные расщелины представляют собой наиболее распространенную черепно-лицевой деформации, с 1/700-1, 000 поставки затронуты 1. Срыв начале эмбрионального черепно-лицевого развития может привести к образованию расщелиной губы и неба (CL / P). В то время как причины синдромному щели были в значительной степени показано, генетические и эпигенетические основы несиндромальных форм орофациального clefting все еще ​​должны быть обнаружены 2-4. Для того, чтобы понять этиологию и патогенез этих пороков, необходимо осветить развитие черепно-лицевых структур на сотовой основе.

Во всех позвоночных животных черепных клетки....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Эмбрионов для фотопреобразования

  1. Настройте по крайней мере, десять пар Sox10: Kaede трансгенных данио между 5 и 6 вечера в вечер.
  2. На следующее утро, потяните разделители и собирать яйца около полудня. Передача их в чашки Петри и положить их в 28,5 ° С инкубатор.
  3. Около 24 часа в сутки после оплодотворения, очистите чашки Петри, удаляя мертвые эмбрионы. Проверьте стадии развития эмбрионов 13 с использованием светового поля микроскопии и любой флуоресцентного микроскопа с повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) фильтра. Kaede будет виден через этот фильтр.
  4. Когда эмбрионы достигают 60 HPF трансфер пять ярко ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В Sox10: Kaede трансгенной линии, миграционные и после перелетные CNCCs помечены флуоресцентно зеленый. В CNCC клетки, меченные зеленым флуоресцентным Kaede резюмировать эндогенной экспрессии Sox10 мРНК 5.

Среди других приложений, эта модель животное использовали лучше визуализировать развитие CNCC зависимых черепно-лицевых структур. Нормальное развитие специфических структур, а также патологического развития черепно-лицевой пороков развития, особенно расщелиной губы и неба были з.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь новый метод визуализации черепно-лицевого развития в данио модели показана. В Sox10: Kaede трансгенных данио линия была успешно используемые для описания миграционную картину CNCC подробно используется в качестве модельного организма 5.

Предыдущие исследования использовали грубые достопримечательности, такие как глаза к клеткам-мишеням и полагались на Kaede мРНК инъекций, фотопреобразования анализов или клетке флуоресцеина декстрана для фотопреобразования 10, 11, 14, 15.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Роберт Kelsh за любезно обмена данио Sox10 промоутер реагента.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Sox10: каэде трансгенная линия данио-рерио MGHДоступно через чашки Петри в лаборатории Ляо
100x15 ммBD Falcon351029
чашки Петри 35 ммx10 ммBD Falcon351008
Ultrapure Низкая температура плавления (LMP) AgaroseInvitrogen15517022
Lab Tek 2 Camera SlideSystem LabTek 154453
Микрозагрузчики 200/pkFisherE5242956003
Nikon A1R Si Confocal Ti seriesNikonNo каталожный номер
NIS Elements Software AR3.2 64-bitNikonNo каталожный номер

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
  2. Dixon, M. J., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Craniofacial DevelopmentNeural Crest MigrationTime lapse Confocal MicroscopySox10 Kaede TransgenicPhotoactivation ProtocolZebrafish Embryo ImagingCranial Neural CrestEthmoid Plate DevelopmentPrimary Palate FormationOrofacial Cleft Analysis

Похожие статьи