Всего горе иммунофлуоресцентного окрашивания новорожденных Retina мыши по расследованию ангиогенеза<em&gt; В естественных условиях</em

Краткое содержание

Неонатальной мышиной сетчатки обеспечивает хорошо характеризуется физиологической модели ангиогенеза, который позволяет исследования роли различных генов или наркотиков, которые модулируют ангиогенеза в В естественных условиях Контекста. Иммунофлуоресцентного окрашивания точно визуализировать сосудистое сплетение имеет решающее значение для успеха такого рода исследований.

Аннотация

Ангиогенез представляет собой сложный процесс образование новых кровеносных сосудов определяется прорастание новых кровеносных сосудов из ранее существовавших сосуд сети. Ангиогенез играет ключевую роль не только в нормальном развитии органов и тканей, но и во многих заболеваний, при которых образование кровеносных сосудов является нарушение регуляции, таких как рак, слепоту и ишемических заболеваний. Во взрослой жизни, кровеносные сосуды, как правило, так покоя ангиогенеза является важной мишенью для разработки лекарств романа, чтобы попытаться регулировать образование новых кровеносных частности, в болезни. Для того, чтобы лучше понять, ангиогенез и разработать соответствующие стратегии для регулирования его, требуются модели, которые точно отражают различные биологические шаги, которые участвуют. Сетчатки новорожденных мышей обеспечивает отличную модель ангиогенеза, поскольку артерии, вены и капилляры развиваются, чтобы сформировать сосудистого сплетения в течение первой недели после рождения. Эта модель также имеет то преимущество, что два-димерные (2D) структуры делает анализ простым по сравнению со сложными 3D анатомии других сосудистых сетей. Путем анализа сосудов сетчатки сплетения в различные моменты времени после рождения, можно наблюдать различные этапы ангиогенеза под микроскопом. В данной статье рассматривается простой процедуры анализа сосудистой сетчатки мыши с помощью флуоресцентного окрашивания isolectin и сосудистых специфических антител.

Введение

Ангиогенез представляет собой сложный процесс развития определяется образование новых кровеносных сосудов из ранее существовавших сосуд сети и регулируется несколькими путями передачи сигналов. Наиболее известным из них является VEGF пути. VEGF высвобождается ишемических клеток и приводит к инициированию ангиогенеза в соседних кровеносных сосудов. Ведущим эндотелиальных клеток из нового сосудистого прорастают является клетка 'чаевые', которое производит филоподии, что протянуть руку по направлению к источнику VEGF, и сопровождается пролиферирующих эндотелиальных клеток стебля. Таким образом, активированные эндотелиальные клетки мигрируют и пролиферируют в направлении лишенной сосудов области, где они образуют новый сосудистых трубок. Для того чтобы стабилизировать эти трубы, чтобы поддерживать кровоток, эндотелиальные клетки взаимодействуют с перицитов и гладкомышечных клетках, которые окружают новых кровеносных сосудов ^1. Ангиогенез является существенным для васкуляризации эмбриона и рост тканей. Однако, это также способствует развитию многих патологическихкал заболеваний, таких как рак, тогда как дефекты в ангиогенез, связанный с ишемической болезнью. Разработка эффективных лекарств для регулирования ангиогенеза в качестве средства лечения болезни поэтому представляет большой интерес. Например, эффективные анти-ангиогенных факторов приведет к снижению роста опухоли, в то время проангиогенные стратегии могут быть использованы для лечения ишемических заболеваний. Таким образом, модели ангиогенеза необходимы, чтобы лучше понять регулирование образование новых кровеносных и для разработки новых терапевтических стратегий для повышения или уменьшения роста сосудов.

Основополагающим элементом ангиогенеза исследования является выбор подходящего сосудистой модели. Многие в пробирке модели были разработаны для воспроизведения основные этапы ангиогенеза, таких как миграция эндотелиальных клеток, пролиферацию и выживание ^2,3. Часто используемым в анализе пробирке является формирование разветвленной сети эндотелиальных клеток на матрицу Матригель, хотя тего не является специфичным для эндотелиальных клеток, а также не обычно включают поддержку перицитов и гладкомышечных клеток. Оценка исключая виво прорастание кровеносных сосудов использованием культуры мышь органов, таких как эмбриональные анализ тела, аортальный анализа кольцо и плода плюсневой анализ позволяет проводить анализ ангиогенеза эндотелиальные клетки в контексте дополнительных вспомогательных клеток. Однако основным ограничения этих анализов включают отсутствие кровотока и регрессии сосудов с течением времени, что дает ограниченное окно для анализа. Поэтому, чтобы понять регуляции ангиогенеза, точнее, в естественных условиях модели требуются например, разработанных в мыши с помощью подкожно имплантировали губки или Матригель зажигания, а также задние модели ишемии нижних конечностей. Тем не менее, эти модели являются сложными для анализа из-за сложных 3D архитектуру новых сосудов. В противоположность этому, данио эмбриона оказалось отличной моделью для визуализации ангиогенеза в целоморганизма ^4. Тем не менее, мышь эволюционно гораздо более тесно связаны с человеческим, чем данио рерио, что делает мышь предпочтительной моделью во многих случаях. Следовательно ангиогенеза послеродовой сетчатки мыши представляет собой хорошо охарактеризованы методом выбора для исследования ангиогенеза. Это не только обеспечивает физиологический установки, но и 2D-сосудистом сплетении, которые можно легко визуализируют с использованием соответствующих флуоресцентных красителей. Архитектура сети судна, пролиферацию эндотелиальных, прорастание, периваскулярные набора клеток и сосудов реконструкции могут быть исследованы с помощью этой техники.

В неонатальный сетчатки мыши, развитие кровеносных сосудов сетчатки происходит в первые недели постнатальной жизни. Мыши, в отличие от людей, рождаются слепыми и сетчатка стала васкуляризированной только после рождения. Сосудов сетчатки возникают в центре сетчатки близко к зрительному нерву в постнатальный день 0 (Р0), а также разработать ангиогенезом с образованием сильно организоватьD сосудистого сплетения, которое достигает периферии сетчатки примерно на ⁵ P8. Кровеносные сосуды развивать характерным образом с капиллярной сплетение постепенно возрастает в направлении от диска зрительного нерва к периферии, чтобы генерировать регулярное чередование артерий и вен с промежуточным капиллярной сети. Сосудистой сети сетчатки обеспечивает идеальную модель для изучения ангиогенеза как сосуды могут быть легко идентифицированы, как они растут в том, что по существу является 2D плоскости, что делает его относительно легко изучить сосудистой сети сетчатки в плоской горы препаратов ^5. Способ выделения мышью сетчатки новорожденных для анализа эндотелиальные клеточные ответы опрокинуться естественных условиях несколько часов бывший сообщалось ^6. Кроме того, более детальное исследование всей сосудистой сети сетчатки и связанные с ними сосудистые маркеры требует иммуноокрашивания фиксированных экземпляров сетчатки на разных стадиях развития.

Здесь мы предлагаемПодробное описание надежный и технически прямой метод, который мы используем для целом окрашивания горе мышиных сетчатки сосудистого сплетения, от начального энуклеации послеродовой глаза (см. также ⁷⁾ через протоколы окрашивания до конечного изображения под микроскопом.

Протокол

Все стадии проводили при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Энуклеация и фиксации Послеродовая Глаза

1. Наведите мышь умерщвлены гуманным щенка на бок, снимите кожу, покрывающую глаз с помощью ножниц.
2. Используйте ножницы и щипцы, чтобы выяснять глаз.
3. Место ножницами ниже энуклеированными глаза, вырезать зрительном нерве и окружающих тканей и вынуть глаз. Переход на 24-луночный планшет, содержащий 4% параформальдегида (PFA) состоит в 2х PBS при комнатной температуре.
4. Позвольте каждому глазу, чтобы исправить в течение 10 - 15 мин, а затем перенести в холодное 2x PBS на льду в течение 5 - 10 мин. Лучше всего, чтобы поразить enucleations и последующей фиксации для обеспечения степень фиксации равна для каждого глаза.

2. Рассечение Послеродовая мышиной сетчатки

1. Передача глаза в чашку Петри, содержащую 2x PBS с помощью пластиковой пипетки Пастера, который был сокращен, чтобы расширить отверстие и место под Dissecting микроскопом.
2. Удалите жир вокруг глаз с помощью пинцета и ножниц.
3. Пирс края роговицы с острыми ножницами и вырезать вокруг роговицы и радужной оболочки глаза и выбросить.
4. Вставьте пинцет между сетчаткой и склерой и удалить склеры стараясь не оторвать сетчатки. Слой сосудистой оболочки глаза также могут быть удалены, но если есть риск повреждения сетчатки, происходящих во время этого этапа, сосудистой оболочки слой может быть оставлен, поскольку это не должно значительно влиять на качество иммунной окраски.
5. Снимите объектив и стекловидного тела с помощью щипцов.
6. Снимите hyaloids сосудов, собирая их вместе в центре глаза с тонким пинцетом Затем быстро подними от центра сетчатки (альтернативно СНиП у основания гиалоидная сосуды с тонкими ножницами).
7. Промойте чашеобразных сетчатки с PBS в чистую чашку Петри.
8. Сделать 4 до 5 радиальных надрезов достижении примерно 2/3 радиуса сетчатки с помощью пружинных scissoRS создать «лепесток» формы.
9. Слить PBS помощью пипетки Пастера, чтобы сгладить сетчатки, а затем удалите остатки PBS с небольшой кусочек впитывающей бумаги.
10. Медленно пипетки холодную (-20 ° С) метанола по капле на поверхности сетчатки, пока полностью не покрыты, а затем наводнения с дополнительным количеством метанола. Это поможет исправить сетчатки и будет способствовать проницаемости. Сетчатки станет белым.
11. Трансфер в 2 мл трубки с помощью пластиковой пипетки Пастера, который был сокращен, чтобы расширить отверстие.
12. Оставьте сетчатки холодным метанолом в течение по крайней мере 20 минут, прежде чем приступить иммунной окраски. Из антитела, используемые здесь, только VE-кадгерина не может быть успешно использован в метаноле фиксированной сетчатки. В этом случае нужно сетчатки перейти прямо к иммунным после шага 9.
13. При необходимости сетчатки могут быть сохранены в метаноле при -20 ° C в течение нескольких месяцев до окрашивания.

3. Иммуно / isolectin окрашивания сетчатки Vasculature

1. Осторожно снимите / слить метанола и осторожно промыть сетчатки кратко в PBS (на данном этапе сетчатка все еще находится в той же 2 мл трубку из п. 11 выше).
2. Снимите крышку и PBS сетчатки со 100 мкл Пермь / Блок раствор (PBS + 0,3% Тритон + 0,2% BSA) + 5% от соответствующей сыворотки (см. таблицу 1) и слегка встряхнуть в течение 1 часа.
3. Удалить Пермский край / Блок и инкубировать сетчатки при осторожном встряхивании в течение ночи при 4 ° С с 100 мкл выбранного основного антитела (см. таблицу 1) и / или IsolectinB4, приготовленные путем разведения в Перми / Block.
4. Удалить антитело / isolectin и мыть сетчатки 4 х 10 мин в PBS + 0,3% Тритон (PBSTX).
5. В некоторых случаях, например, следующим окрашиванием IsolectinB4-Alexa488 или непосредственно конъюгированное первичного антитела, вторичное антитело не требуется, и сетчатки может быть установлен непосредственно (стадия 7). Когда неконъюгированный первичных антител был использован на шаге 3, затем 100 мкл соответствующего фторescent вторичным антителом (разведенного 1/200 в PBSTX) добавляли и оставляли для инкубации в течение ночи при 4 ° С и в течение 4 ч при комнатной температуре.
6. Удалить вторичными антителами и мыть сетчатки 4 х 15 мин в 2 мл PBSTX.
7. Передача сетчатки на слайды, используя широкие пластиковые отверстие пастеровской пипетки и удалить избыток PBSTX с абсорбентом ткани. Горы сетчатки путем добавления 50 мкл Продли mountant на покровное и осторожно позицию по сетчатке.
8. Передача слайды холодильнике в течение ночи при 4 ° С, гарантируя, что они плоские и защищенном от света месте, с тем чтобы продлить mountant установить.
9. Изображение сетчатки помощью конфокальной микроскопии или эпифлуоресцентной микроскопом.

Результаты

После вскрытия сетчатки должна выглядеть плоской цветок (рис. 1). При использовании протоколов, описанных выше, эндотелиальные клетки можно увидеть, используя isolectin B4-Alexa488 окрашивания и поддержки сосудистых клеток мышц визуализировали с использованием анти-альфа-актин гладких мышц (рис. 2). Низкий вид энергии с использованием 5-кратным цель на рисунке 2 позволяет обзор сосудистых организации сетчатки. Кроме того, используя различные комбинации антител, приведен...

Обсуждение

Изложенный здесь метод предлагает простой и эффективный способ получения изображения из цветного целом препараты горе сетчатки новорожденных мышей, что делает его легко поддаются количественной оценке и физиологически соответствующие модели ангиогенеза. Первоначально, мышь глаз может быть довольно трудно анализировать из-за его небольшого размера и формы мира, так что некоторые практики и хорошие инструменты вскрытия необходимы для надежных результатов. Препарирование глаза подготовлены в 2x концентрации PBS важно, пото...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Material
Пластиковые пипетки 3 мл	Научные лабораторные принадлежности	PIP4210	Удалите наконечник ножницами для создания широкого отверстия
BD Falcon 24-луночные пластины	Научные лабораторные принадлежности	353226
Выберите чашки Петри ТВ 90 мм	Научные лабораторные принадлежности	SLS2002
Гистобондовые слайды	VWR	631-0624
Покровные стекла 22 x 22 мм	VWR	631-1336
Пинцет Dumont #5	World precision instruments	14095
Пружинные ножницы длиной 10,5 см, с прямыми лезвиями 8 мм Мировые	прецизионные инструменты	501235	Используются для энуклеации
Ножницы Vannas длиной 8,5 см, с прямыми лезвиями 7 мм и сверхтонкими наконечниками 0,025 x 0,015 мм	Мировые прецизионные инструменты	500086	Используются для препарирования сетчатки
глаза Сверхтонкие ножницы длиной 8 см с прямыми лезвиями 3 мм, и сверхтонкими наконечниками 0,015 x 0,015 мм	Мировые прецизионные инструменты	501778	Используются для препарирования сетчатки
кристаллического прозрачного’ пробирки 2 мл	Starlab	E1420-2000
<сильно>Реагенты
фосфат натрия двухосновной	реактив Sigma	S0876	PBS
Фосфат калия одноосновной	Sigma	P5655	PBS реактив
Натрия хлорид	Sigma	S9625	PBS реактив
Параформальдегид	Sigma	P6148	Составите в 2x PBS и храните при -20 ° C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Сыворотка осла	Sigma	D9663
Сыворотка от козы	Vector	S-1000
Prolong Gold реагент против выцветания	Invitrogen	P36930	Монтажный реагент
Isolectin GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Использование при 1:200 разведение
Изолектин GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Использование при разведении
Primary Антитела
Anti-NG2 (кролик поликлональный)	Millipore	AB5320	Обнаруживает перициты
Anti-GFAP (клон GA5, моноклональный мыши)	Millipore	MAB360	Обнаруживает астроциты
Anti-Desmin (клон Y66, кролик моноклональный)	Millipore	04-585	Обнаруживает перициты
Anti-Collagen IV (кролик поликлональный)	Chemicon	AB756P	Обнаруживает сосудистую базальную мембрану
Anti-alpha гладкомышечного актина-Cy3 (клон 1A4, мышиный моноклональный)	Sigma	C6198	Обнаруживает клетки гладкой мускулатуры сосудов.
Анти-эндоглин (клон MJ7/18, моноклональный крыса)	BD Pharmingen	550546	Обнаруживает эндотелиальные клетки
Anti-CD31 (клон MEC13.3, моноклональный крыса)	BD Pharmingen	553370	Обнаруживает эндотелиальные клетки
Anti-VE-кадгерин (клон 11D4.1, моноклональный крыса)	BD Pharmingen	550548	обнаруживает соединения эндотелиальных клеток
Anti-Alk1 (поликлональный козий)	R& D Systems	AF770	Обнаруживает эндотелиальные клетки
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	Все вторичные антитела аликвитируются сразу по прибытии и хранятся при -20 °C.
Козий антикрысиный Alexa488	Invitrogen	A11006	Все вторичные антитела аликируются сразу по прибытии и хранятся при -20 °C.
Козий антикрысиный Alexa594	Invitrogen	A11007	Все вторичные антитела аликируются сразу по прибытии и хранятся при -20 °C.
Козий антимышиный препарат Alexa488	Invitrogen	A11029	Все вторичные антитела аликвитируются сразу по прибытии и хранятся при температуре -20 °C.
Осёл против коз - Alexa594	Invitrogen	A11058	Все вторичные антитела аликируются сразу по прибытии и хранятся при температуре -20 °C.
Microscopes
Dissection микроскоп	Zeiss	Stemi SV6
Камера	Zeiss	Axiocam HRc	Камера для рассекающего микроскопа
Эпифлуоресцентный микроскоп	Zeiss	Axioimager с апотомной
камерой	Zeiss	Axiocam HRm	Камера для Axioimager
Конфокальный микроскоп	Фотоаппарат Nikon	A1R

1:200