Методическая статья

Разделение сперматогенного Типы клеток с использованием STA-PUT скорости осаждения

DOI:

10.3791/50648

⸱

9 октября 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania, 2Biomedical Graduate Studies, University of Pennsylvania, 3Department of Animal Biology and Center for Animal Transgenesis and Germ Cell Research, University of Pennsylvania, 4Department of Genetics, University of Pennsylvania, 5Department of Biology, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способ STA-PUT позволяет для разделения различных популяций клеток сперматогенных в зависимости от размера и плотности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Млекопитающих сперматогенез представляет собой сложный процесс дифференциации, что происходит в несколько этапов в семенных канальцах яичек. В настоящее время нет надежной системы культуры клеток позволяет сперматогенного дифференциации в пробирке, и большинство биологические исследования сперматогенных клеток требуют урожай тканей от животных моделях, таких как мыши и крысы. Потому что яичко содержит многочисленные типы клеток - как не-сперматогенеза (Лейдига, Сертоли, миелоидных и эпителиальные клетки) и сперматогенеза (сперматогенов сперматоциты, круглые сперматиды, конденсации сперматиды и сперматозоиды) - изучение биологических механизмов, участвующих в сперматогенеза требуют изоляции и обогащение этих различных типов клеток. Метод СТА-PUT позволяет для разделения гетерогенной популяции клеток - в данном случае, от яичек - через линейным градиентом BSA. Отдельные типы клеток осадок с разной скоростью осаждения в соответствии с серазмер LL, и фракции, обогащенные для различных типов клеток могут быть собраны и использованы в дальнейших анализов. Хотя способ STA-PUT не приводит к чрезвычайно чистых фракций из типов клеток, например, как могут быть получены с определенными методами сортировки клеток, он обеспечивает значительно более высокий выход общего числа клеток в каждой фракции
(~ 1 х 10 8 клеток / сперматогенеза тип клеток из исходного населения 7-8 х 10 8 клеток). Этот метод высокая доходность требует только специализированные изделия из стекла и может быть выполнена в любом холодном помещении или большой холодильник, что делает его идеальным методом для лабораторий, которые имеют ограниченный доступ к специализированным оборудованием вроде активацией флуоресценции сортировщика клеток (FACS) или элюент.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Млекопитающих сперматогенез представляет собой сложный процесс дифференциации, что происходит в несколько этапов в семенных канальцах яичек 1. Вкратце, стволовых как сперматогоний, что проживание вблизи эпителия семенных канальцев разделяй и дифференцироваться в сперматоцитах, которые затем подвергаются мейоза дивизий. После мейоза завершена, в результате гаплоидные клетки, или круглые сперматиды, пройти спермиогенеза, процесс дифференциации, которая включает пролитие цитоплазме и уплотнения ядра. Сперматид постепенно развивать жгутик и пройти удлинение и конденсацию ядра, производя удлинения, а затем конденсационных сперматиды соответственно. Конечные про....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол СТА-PUT состоит из трех этапов: 1) создание аппарата и реагентов, 2) Получение клеточной суспензии из цельных яичек, и 3) загрузка сотовый, осаждение и сбор фракции. Когда выполняется командой двух исследователей, протокол занимает восемь часов в среднем.

1. Настройка СТА-PUT Аппарат (рис. 1)

*** STA-PUT аппарат должен быть помещен в 4 ° C большим холодильником или холодной комнате, что также может вместить коллектор фракций, если это метод сбора является предпочтительным.

  1. В ночь перед (или по крайней мере за несколько часов до) выполнения метода, мыть все оборудование (особенно изделия из ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идеальным результатом от процедуры СТА-PUT довольно заметно разделение клеток из яичек в зависимости от размера ячейки и плотности. В то время как клетки, выделенные из семенников которые седиментации через градиента BSA, несколько различных групп клеток можно наблюдать. Любые скопления клеток, как правило, опускаются на дно градиента и не будет загрязнять других фракций. Чуть дальше градиента будет большой соматические и мейоза клетки. Дальше до градиента по-прежнему будет более мелкие круглые сперматиды. В верхней час.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Те, кто изучает сперматогенез полагаться на животных моделях для образцов сперматогенных клеток, как надежная система культуры клеток еще не существует для генерации всех типов сперматогенного клеток 3. Хотя сперматогенного клетки легко собраны из цельных яичек, приводит только смешанное население. Это создает проблему для тех, кто желает изучать конкретные подтипы этих клеток, такие как мейотических клеток, круглых сперматид и конденсационных сперматид. Три различные методы в настоящее время используются для.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы. Этот протокол, демонстрируется предполагает использование лабораторных мышей и был казнен в соответствии со всеми соответствующими руководящими принципами, правилами и регулирующими органами. Животные, используемые в настоящем протоколе ведутся под руководством и утверждения университета институционального комитета уходу и использованию животных Пенсильвании (IACUC протокол № 804284).

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано NIH гранты GM055360 к SLB и U54HD068157 к агр. JMB была поддержана T32 генетики подготовки Грант в Университете Пенсильвании (GM008216).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Можно использовать BSAAffymetrix/USB10857 100MGAlternate.
0,5%, 2% и 4% растворы БСАРастворите 0,25 г, 11 г и 22 г (соответственно) в общих объемах 50 мл, 550 мл и 550 мл 1x KREBS (соответственно).Будет сделан день проведения процедуры STA-PUT. Фильтр простерилизовать.
KREBS (10x)3,26 г KH2PO4 + 139,5 г NaCl +5,89 г MgSO4/7H20 + 40 г Dextrose + 3,78 г CaCl2/2H20 + 7,12 г KCl, доведите до 2 л с помощью автоклава/фильтра ddH20и храните при температуре 4 °°; C в течение нескольких месяцев.
KREBS (1x)Растворить 4,24 г NaHCO3 in 100 мл ddH20. Добавьте 200 мл 10x KREBS. Доведите до 2 л с помощью ddH20.Будет сделан день проведения процедуры STA-PUT. Фильтр простерилизовать.
КоллагеназаSigmaC9891-1G DNAse
SigmaDNEP-5MG
ТрипсинSigmaT9201-1G
DAPIПредпочтение исследователя
Triton-X100Предпочтения исследователя
Формальдегид (~37%)Предпочтения исследователя
ТАБЛИЦА 2: ОБОРУДОВАНИЕ
Оборудованиекомпании#Комментарии
Комплектный аппарат STA-PUTProScience Glass ShopSTA-PUT (для этой процедуры используется стандартная отстойная камера: кат. No 56700-500)Включает в себя всю стеклянную посуду и оборудование для аппарата. Для выполнения STA-PUT с меньшим количеством ячеек доступна альтернативная стеклянная посуда.
10 μ m сетчатый фильтрFisherbrand22363549
Инструменты для препарирования мышейПредпочтения исследователя
14 мл пробирки для сбора фракций с круглым дном и колпачкамиПредпочтения исследователя
Потребность примерно в 100 пробирках
Сборник фракцийGE Healthcare Life SciencesМодель: Frac-920, Код товара: 18-1177-40Можно использовать альтернативный.
Предметные стекла для микроскопа, покровное стеклоПредпочтения исследователя
Световой/флуоресцентный микроскопПредпочтения исследователя
Каталог

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
  2. Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006)....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

STA PUT Velocity SedimentationSpermatogenic Cell SeparationTestis Cell IsolationBSA Gradient SedimentationCell Fraction CollectionFluorescence Microscopy AnalysisWestern Blot AnalysisCell Size DifferentiationNuclear Morphology AssessmentGerm Cell Enrichment

Похожие статьи