Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод В естественных изображений отличить острого и хронического воспаления

19.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50690

⸱

16 августа 2013 г.

 , 
1Lurie Family Imaging Center, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, 2Division of Pediatric Hematology/Oncology/Stem Cell Transplantation, Columbia University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем неинвазивного метода визуализации для различения воспалительных стадиях. Системной доставки люминолом показывает областях острого воспаления зависит от активности МПО в нейтрофилах. В противоположность этому, инъекция люцигенином позволяет выводить хронического воспаления зависит от Phox активность макрофагов.

Аннотация

Воспаление является фундаментальным аспектом многих заболеваний человека. В этом видео отчет, мы демонстрируем неинвазивных методов визуализации биолюминесценции, которые отличают острого и хронического воспаления в мышиных моделях. С повреждением ткани или патогена вторжения, нейтрофилы являются первой линией обороны, играют важную роль в посредничестве острой воспалительной реакции. Как воспалительная реакция прогрессирует, циркулирующих моноцитов постепенно мигрируют в место повреждения и дифференцироваться в зрелые макрофаги, являющиеся посредниками хроническое воспаление и способствовать восстановлению тканей, удаляя ткани мусора и производство противовоспалительных цитокинов. Внутрибрюшинной инъекции люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион, натриевой соли) позволяет обнаруживать острого воспаления в значительной степени опосредованы ткани проникновения нейтрофилов. Люминол специфически реагирует с супероксид генерируется в фагосомами нейтрофилов с биолюминесценции результаты миелопероксидазы (МPO) опосредованной реакции. Люцигенином (бис-N-methylacridinium нитрат) также вступает в реакцию с супероксид для того, чтобы генерировать биолюминесценции. Тем не менее, люцигенин биолюминесценции не зависит от МПО и это исключительно зависит от фагоцитарной NADPH оксидазы (Phox) в макрофагах при хроническом воспалении. Вместе люминол и люцигенином позволяет неинвазивной визуализации и продольный оценки различных популяций на фагоцитарную как острых, так и хронических воспалительных фаз. С учетом важной роли воспаления в различных заболеваний человека, мы считаем, что это неинвазивный метод визуализации может помочь исследовать дифференциальные роли нейтрофилов и макрофагов в различных патологических состояниях.

Введение

Воспаление является строго регулируется биологической реакции участвуют в различных заболеваний человека, в том числе микробной инфекции 1, заживление ран 2, диабет 3, 4 рак, сердечно-сосудистые 5, 6 нейродегенеративных и аутоиммунных заболеваний 7. Воспаление тканей требует надлежащей координации различных иммунных клеток в целях достижения возбудителя оформление, восстановления тканей, и болезнь разрешение. Нейтрофилы и макрофаги являются ключевыми медиаторами иммунного воспаления тканей. В острой фазе воспаления, нейтрофилы первыми отвечают различным вредным воздействиям и повреждение тканей 8. Нейтрофилов быстро вытекать из сосудов в ткань из обращения в месте повреждения, где клетки инактивировать вторжения микробов путем освобождения антимикробные гранул и фагоцитоза. Во фагоцитоз, нейтрофилы поглотить вторжения микробов в фагосомами, в течение которой клетки продуцируют высокие уровни СуперОксIDE (O 2 · -). Phagosomal супероксид является основным источником многих вниз по течению активных форм кислорода (АФК). Например, супероксид может быть dismutated в перекись водорода (H 2 O 2) спонтанное дисмутация или супероксиддисмутаза (SOD), 9, 10. В нейтрофилы, миелопероксидазы (MPO) дальнейшее преобразует перекиси водорода к антимикробным хлорноватистой кислоты (HOCl) 11. Как воспалительные реакции продолжаются, циркулирующих моноцитов постепенно мигрируют в место повреждения и дифференцироваться в зрелые макрофаги 2, чья фагоцитарной функции помогают удалить инактивированных патогенных микроорганизмов и клеточных обломков. Кроме того, в качестве ключевого регулятора в поздней фазе воспаления, макрофагов способствует восстановлению тканей, производя противовоспалительных цитокинов и 12, генерируя внеклеточный ROS на более низком уровне 9. АФК образуются в этой поздней стадии регулируют ремоделирования ткани, образование новых кровеносных и reepitheliaлизации 13.

НАДФН-оксидазы фагоцитов (Phox) является основным источником супероксида в обоих нейтрофилов и макрофагов 9. Phox является мульти-субъединицы комплекса, сборка жестко регулируется 9. Холоферментом содержит несколько цитозольные регуляторных субъединиц (P67 Phox, Phox p47, p40 Phox и RAC) и связанный с мембраной гетеродимером цитохрома Ь 558 (состоит из субъединицы CYBA и CYBB). Цитохром б 558 является реакция ядро, в которой субъединицы CYBB (также известный как p91 Phox и NOX2) осуществляет первичный окислительно-восстановительной реакции цепи 9. Интересно, что свои сайты сборки отличаются между нейтрофилов и макрофагов. В состоянии покоя нейтрофилы, цитохрома Ь 558, в основном, присутствующего в мембране внутриклеточных гранул хранения 14. В процессе фагоцитоза, нейтрофилы собрать чoloenzymes в фагосомами 9, где высокий уровень активности МПО также присутствуют. Нейтрофилов Phox быстро потребляет кислород и оказывает свое бактерицидное власти продукции АФК, явление называется респираторный взрыв 11. Напротив, макрофаги, имеют более низкий уровень экспрессии и MPO цитохрома б 558 встречается в основном в плазматической мембране 15, 16. Таким образом нейтрофилы продуцируют высокие уровни супероксид на антимикробную активность, в то время как макрофаги вырабатывают меньше супероксид для регулирующих функций 15.

Поскольку воспаление является сложной в процессе естественных условиях, неинвазивные методы визуализации специфичны для разных фаз воспаления позволит количественных и продольной оценки модели заболеваний. Использование механистических исследований, ранее мы показали, использование двух хемилюминесцентного вещества, люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион) и люцигенином (бис-N-methylacridinium нитрат), Для неинвазивной визуализации острых и поздних (хронических) стадиях воспаления, соответственно 17. Люминол позволяет визуализировать нейтрофилов активности МПО в острой фазе воспаления 18-20, в то время как люцигенин биолюминесценции может быть использован для оценки активности макрофагов в связи с поздней стадии хронического воспаления или 17. В этой рукописи, мы использовали два экспериментальных моделей воспаления (PMA SC и SC LPS), чтобы продемонстрировать эти методы визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Все исследования на животных проводились в рамках утвержденных институциональных протоколов и руководств по уходу за животными.

1. Реагенты и растворы

  1. PMA решение для подкожно прививки: Подготовка исходного раствора форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА) в дозе 5 мг / мл в ДМСО. Хранить раствор при -20 ° C. Перед посевом таять исходного раствора и разбавляют до 1 мг / мл в PBS PMA.
  2. LPS решение для подкожно прививки: растворите липополисахарида (LPS из Salmonella enterica серотипа Enteritidis) в стерильном PBS при концентрации 1 мг / мл до подкожно прививки.
  3. Люминол решение для острой фазы изображения: растворите люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион, натриевая соль) в стерильном физиологическом растворе (0,9% NaCl) при концентрации 10 мг / мл. Раствор можно хранить при -20 ° C перед использованием.
  4. Люцигенин решение для визуализации хронической фазе: Растворите люцигенин (бис-N-methylacridinium нитратов) в стерильном физиологическом растворепри дозе 2,5 мг / мл. Раствор можно хранить при -20 ° C перед использованием.

2. Подкожный PMA Воспаление модели

  1. Обезболить NCr голым мышам в индукционной камера с 1-2% изофлурана. Подтвердите общей анестезии потеря движения и постоянная частота дыхания. Передача животного на носовой конус поставляется изофлураном перемешанные газ и держать животных под наркозом.
  2. Используйте изопропиловый спирт протрите чистить и дезинфицировать место инъекции на левом фланге.
  3. С помощью стерильной техники, вводят 50 мкл раствора PMA прививки (содержащей 50 мкг PMA) в подкожное пространство на левом боку. Удалить избыток жидкости из места инъекции с использованием изопропилового спирта площадку. Избегать использования обезболивание, как это может влиять на воспалительные реакции.
  4. Переместить животное обратно к корпусу клетку и внимательно следить его выхода из наркоза. В целях оказания помощи в восстановлении, использовать грелку держать животное тепло.

3. Подкожный LPS Воспаление модели

  1. Обезболить C57BL/6J мышей с 1-2% изофлурана в индукционной камере. После создания общей анестезии, передать животному носовой конус поставляется изофлураном газа и держать животное под наркозом.
  2. Используйте изопропиловый спирт для очистки протрите место инъекции на левой лапы.
  3. С помощью стерильной техники, вводят 50 мкл раствора LPS прививки (содержащей 50 мкг ЛПС) в левую лапу. Удалить избыток жидкости из места инъекции с использованием изопропилового спирта площадку. Избегать использования обезболивание, как это может влиять на воспалительные реакции.
  4. Переместить животное обратно к корпусу клетку и внимательно следить его выхода из наркоза. Используйте грелку держать животное теплой во время восстановления.

4. Биолюминесценции изображений воспаления

  1. Анестезию животных в индукционной камере с 1-2% изофлуран смешанного газа. Confirm общей анестезии потеря движения и постоянная частота дыхания.
  2. В то время как животное все еще находится под анестезией, интраперитонеально (внутрибрюшинно) вводят люминол раствора (10 мг / мл), либо люцигенином раствор (2,5 мг / мл) в течение острое или хроническое воспаление изображений, соответственно. Конечный доза 100 мг / кг в течение люминол и 25 мг / кг в течение люцигенином. Низкие дозы люцигенином (10-15 мг / кг) может быть использован, чтобы избежать возможной токсичности некоторых линий мышей. Признаки токсичности включают одышку и дыхательной недостаточности. Штамм C57BL/6J имеет более низкую, чем переносимость люцигенин NCr обнаженной напряжения.
  3. Передача животных в изображения камеры системы визуализации биолюминесценции.
  4. Выполнять последовательные изображений биолюминесценции с интервалом в 1 мин. Каждый шаг визуализации состоит из 1 раз приобретении мин, F / стоп = 1, биннинге = 16 и 0 сек задержки.
  5. В панели захвата изображений, с тем чтобы последовательного многоступенчатого изображений, нажмите на последовательность установки BUTton. Обеспечить достаточный шаги изображений в приобретении профилем для определения максимальным выходным люминесценции (обычно 15 одну минуту шагов будет достаточно). 15 мин изображений раздел позволяет достаточно времени для поглощения подложки и системный кровоток.
  6. Удалить животное от изображения камеры и переместить его обратно в корпус клетке. В целях оказания помощи в восстановлении, использовать грелку держать животное тепло.
  7. Во время после приобретения анализа, используйте пакет изображений программное обеспечение для расчета пика Всего биолюминесцентными сигнал через стандартизированные области интереса (ROI). Изображения присутствуют в виде сияния в фотон / сек / см 2 / SR с минимальным и максимальным порогом указано. Количественные данные представлены в виде общего потока в фотонов в секунду на ROI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы провели продольное изображение биолюминесценции для оценки острых и хронических воспалений в экспериментальных моделях воспаления. Форбола 12-миристат-13-ацетатом (РМА) является сильнодействующим протеинкиназы С (РКС), агонист, который активирует Phox для супероксида аниона и вызывает интенсивный острой воспалительной реакции 21. SC инъекции 50 мг PMA в NCr голых мышей привело к быстрому раздражению кожи и острое воспаление в местах инъекций 18, 22, 23. Мы проводили ежедневно изображений течение...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом докладе мы демонстрируем биолюминесценции метод неинвазивной визуализации воспаления в живых животных. Преимущества двух люминесцентные субстраты, люминол и люцигенином, способ может различать различные фазы воспаления. Люминол биолюминесценции связан с нейтрофилов в острой фазе воспаления, тогда как люцигенин биолюминесценции опосредовано макрофагов в хроническую фазу. Относительно небольшие (М = 177,16 г / моль) и электрически незаряженных, люминол может легко проникать как в плазме и phagosomal мембрана 2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов в данном исследовании.

Благодарности

Эта работа была поддержана Нэнси Лурье Marks Foundation. Мы благодарим доктора Нэнси Е. Коль за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим К. Кин Вонг за помощь в подготовке этого видео отчет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA)Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, МиссуриP8139 
Липополисахарид из серотипа enteritidis Salmonella entericaSigma-Aldrich Co., Сент-Луис, МиссуриL2012 
Люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион, натриевая соль)Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, MOA4685 
Люцигенин (бис-N-метилакрилидиний нитрат)Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, MOM8010 
Система визуализации IVIS Spectrum с программным пакетом Living Imaging 4.2Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA 

Ссылки

  1. Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
  2. Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).
  3. Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Inflammation, stress, and diabetes. J. Clin. Invest. 115, 1111-1119 (2005).
  4. Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
  5. Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
  6. Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
  7. Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
  8. Harlan, J. M. Leukocyte-endothelial interactions. Blood. 65, 513-525 (1985).
  9. Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
  10. Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
  11. Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
  12. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
  13. Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
  14. Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
  15. Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
  16. Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
  17. Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
  18. Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
  19. Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
  20. Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
  21. Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
  22. Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
  23. Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
  24. Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
  25. Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
  26. Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
  27. Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
  28. Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
  29. Dahlgren, C., Karlsson, A. Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 3-14 (1999).
  30. Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
  31. Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Биолюминесцентная визуализацияострое воспалениедетектирование нейтрофиловдетектирование макрофаговсубстрат люминолсубстрат люцигенинмышиные моделивоспалительный ответпоследовательная визуализация
Метод В естественных изображений отличить острого и хронического воспаления
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.