Время курсы для гликозилазу деятельность 8-оксогуанин ДНК гликозилазу являются двухфазные выставке взрыв формирования продукта и линейной стационарной фазы. Использование охлаждение потока техники, взрыв и стационарное показатели могут быть измерены, что соответствует удалению 8-оксогуанин и выпуск гликозилаза от продукта ДНК соответственно.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Стационарная, Pre-стационарная, и односпальная кровать-оборота кинетические измерения активности ДНК гликозилаза
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человеком 8-оксогуанин ДНК-гликозилаза (OGG1) вырезает мутагенных окислительное повреждение ДНК 8-оксо-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) из ДНК. Кинетическая характеристика OGG1 проводится для измерения скорости 8-oxoG иссечение и выпуска продукции. Когда OGG1 концентрации ниже, чем субстратной ДНК, временной ход образование продукта являются двухфазные; быстрый экспоненциальной фазе (т.е. разрыв) образования продукта следует линейной стационарной фазы. Первоначальный выброс образования продукта соответствует концентрации фермента в зацепление на подложке, и взрыв амплитуда зависит от концентрации фермента. Первого порядка константа скорости взрыв соответствует истинный коэффициент 8-oxoG иссечение и медленнее стационарного скорости измеряет скорость выпуска продукта (продукт ДНК константы скорости диссоциации, K OFF). Здесь мы описываем стационарный, предварительно стационарных и одного оборота подходы для выделения и измерения зрecific шаги во OGG1 каталитического велоспорт. Меченных флуоресцентными поражение-содержащий олигонуклеотид и очищенный OGG1 используются для облегчения точного кинетических измерений. Так как низкие концентрации фермента используются для стационарных измерений, ручное перемешивание реагентов и гашение реакции может быть выполнен, чтобы установить стационарные скорости (к выключен). Кроме того, экстраполяция стационарных скоростью до точки на оси ординат в нулевой момент времени показывает, что взрыв образование продукта произошла во время первого оборота (т.е. у-перехват положительна). Первого порядка константа скорости экспоненциальной фазе всплеска может быть измерена с использованием быстрое смешивание и закалки метод, который проверяет объем продукта, полученного на короткие промежутки времени (<1 сек) до стационарной фазы и соответствует скорости 8 -oxoG иссечение (т.е. химии). Химические стадии, может также быть измерена с использованием одного оборота подход, при котором каталитический велосипедепредотвратить насыщение ДНК субстрата с ферментом (E> S). Эти подходы можно измерять элементарных констант скорости, которые влияют на эффективность удаления повреждений ДНК.
Введение
Аэробной среде спешит геномной нестабильности. Основным promutagenic поражение ДНК в результате окислительного стресса 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-oxoG). Это связано с неоднозначным кодирования потенциал 8-oxoG. Человека 8-оксогуанин ДНК гликозилазу (OGG1) отвечает за разработку базы репарации 8-oxoG. Гликозилазу деятельности OGG1 акцизов 8-oxoG базы в результате ДНК-продукт с сайта апуриновыми (AP-сайта). Слабую активность лиазы OGG1 можно надрезать AP-сайта в некоторых случаях.
Кинетическая характеристика ДНК гликозилазами вообще считает, что они проявляют двухфазный курсах времени. После начальной фазы быстрого образования продукта
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление фермента и субстрата ДНК
- Сверхэкспрессируют OGG1 как GST-слитого белка в E. палочка, использовать GST-тегов для очистки, а затем удалить GST-теги расщеплением HRV-3C протеазы (рис. 1) 6.
- Покупка химически синтезированы 5'-6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) меченого олигонуклеотида, содержащих один 8-oxoG остатка и ее комплементарной нити немеченого олигонуклеотида. 34-мерного олигонуклеотида содержать 8-oxoG в положении 17 от 5'-конца. Очищают этих олигонуклеотидов помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
- Подготовка двухцепочечной ДНК субстрата, содержащего 8-oxoG путем сме....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Стационарные кинетический анализ проводили с использованием 200 нМ субстратной ДНК и четырех различных концентраций очевидно OGG1 (15, 30, 45 и 60 нМ), как определено с помощью анализа Брэдфорда 2. Время курса образования продукта были пригодны для линейного уравнения для определения у-перехват, которые были 2,2, 11, 15 и 26 нМ, соответственно, по отношению друг к концентрации белка (фиг. 2В). У-перехватывает были дополнительно нанесены относительно друг фактическую концентрацию белка
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Кинетическая описанные здесь подходы наметить методы определения элементарных кинетических констант. Если временной ход образование продукта является двухфазным с первой ферментативной оборот, происходящие быстро, то шаг после химии является лимитирующей при последующем каталитическом оборотов. В случае OGG1, первый оборот может быть измерена с использованием высоких концентраций фермента, либо с предельной (S E) концентрации ДНК. В первом случае, реакцию ограничиваться "одного оборота и о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим доктора Джули К. Хортон за критическое прочтение рукописи и д-р Раджендра Прасад за полезные советы и обсуждения. Части этого исследования были первоначально опубликованы в журнале Biological Chemistry, Sassa ET. др.., "Контекст Последовательности ДНК Воздействие на гликозилаза активности человека 8-оксогуанин гликозилаза ДНК." J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Эта работа была поддержана, полностью или частично, Национального института исследований в области здравоохранения грантового проекта Z01-ES050158 в очной программе исследований, NIEHS.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| >5'-6-FAM меченые олигонуклеотиды, содержащие один 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5'-P32 меченые радиоактивными олигонуклеотидами. Рекомендуется степень очистки полиакриламидным гелем. | |
| Немеченые олигонуклеотиды (комплементарная цепь) | Eurofins MWG Operon | Степень очистки полиакриламидного геля рекомендуется. | |
| одноразовый шприц BD Luer Lock объемом 1 мл | Также можно использовать одноразовый шприц BD Medical 309628 Lue Lock от других поставщиков. | ||
| одноразовый шприц BD Luer Lock объемом 10 мл | BE Medical | 309604 | Одноразовый шприц Luer Lock от других поставщиков. |
| Equipment | |||
| Циркуляционная водяная баня | Любой поставщик | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument от других поставщиков также может быть использован | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager от других поставщиков. | |
| Программное обеспечение | KaleidaGraph |
Ссылки
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
