Method Article

Multiplexed Люминесцентная микрочипов для человека слюнных анализа белка с использованием полимерных микросфер и волоконно-оптических Связки

DOI:

10.3791/50726

⸱

October 10th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Tufts University, 2Department of Analytical Chemistry, Complutense University (Spain), 3Department of Electrical and Computer Engineering, Tufts University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем процедуру для профилирования белки слюны, используя мультиплексированных массивы антител микросфер на основе. Моноклональные антитела ковалентно связаны с флуоресцентными красителями кодируется 4,5 мкм полимерных микросфер с использованием карбодиимида химии. Модифицированные микросферы были депонированы в волоконно-оптических лунки для измерения уровня белка в слюне с помощью сэндвич-флуоресценции иммунологические.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем протокол для одновременного измерения шесть белков в слюне с помощью микросфер на основе массива антител оптоволоконный. Технология иммуно-массив использованы сочетает в себе преимущества микросфер на основе подвески изготовления матрицы с использованием флуоресцентной микроскопии. Как описано в протоколе видео, коммерчески доступные 4,5 мкм полимерные микросферы были закодированы в семи различных типов, различаемых по концентрации двух флуоресцентных красителей физически ловушке внутри микросфер. Кодированные микросферы, содержащие поверхностные карбоксильные группы были изменены с помощью моноклональных антител захвата через EDC / NHS связи химии. Для сборки белка микрочипов, различные типы кодированных и функционализированных микросфер были смешаны и случайным образом на хранение в 4,5 мкм лунки, которые были химическому травлению на проксимальном конце волоконно-оптического пучка. Волоконно-оптический пучок был использован и как носителя и для визуализации мicrospheres. После сборки, микрочипов был использован для захвата белков в слюне супернатант собирали из клиники. Детектирование на основе сэндвич-иммуноанализа с использованием смеси биотинилированных антител обнаружения для различных аналитов с стрептавидином, конъюгированным флуоресцентного зонда, R-фикоэритрином. Микрочипов был сфотографирован с помощью флуоресцентной микроскопии в трех различных каналов, по два для регистрации микросфер и один для сигнала анализа. Флуоресцентные микрофотографии были затем декодируются и проанализированы с помощью самодельного алгоритм в MATLAB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С первого микрочипов сообщил Марк Schena и коллегами в середине 1990-х, этот мощный инструмент был использован во многих областях биологических исследований 1. Антитела микрочипы, способные одновременно обнаруживать несколько белков в диагностических жидкостей, таких как кровь, имеют важное применение в клинической диагностике и скрининге биомаркеров 2-10. Слюна, содержащий многие из тех же аналитов как кровь, была рассмотрена в качестве предпочтительной альтернативой крови, потому что сбор слюны является безопасным, неинвазивным, и может быть осуществлена ​​с помощью минимально-квалифицированного медицинского персонала 11-13. В настоящее время мультиплексированный анализ белка с использованием образцов слюны ограничен несколькими важными факторами, в том числе низкой концентрации заданного анализируемого вещества 14 и широкого диапазона концентраций различных биомаркеров 15.

.

При этом мы показали, анализ шести белков: сосудистый эндотелиальный фактор роста человека (VEGF), интерферон гамма-индуцированный белок 10 (IP-10), интерлейкин-8 (IL-8), эпидермальный фактор роста (EGF), матрица metallopeptidase 9 (ММП-9) и интерлейкина-1 бета (IL-1β) . Выполнение метода была первоначально проверена с использованием стандартных растворов рекомбинантных белков, составляющих анализируемого вещества и блокирующем буфере. Реальные образцы слюны, собранные от пациентов различных хронических заболеваний органов дыхания, а также здоровых были также проверены с удовлетворительной работы. Протокол должен быть применим и к другим белковых аналитов и других микросфер на основе анализов. Эта платформа дает значительные преимущества в области аналитической химии, так как позволяет быстро, точно, и воспроизводимое одновременный анализ низких концентрациях нескольких белков с широким динамическим диапазоном, минимальных неспецифических взаимодействий, снижение потребления образца, и низкой стоимости по сравнению с Аналогичный иммуноферментный анализ (ELISA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Рисунок 1. . Рабочий процесс для применения волоконно-оптический массив микросфер антител в слюне профилирования (1) Микросферы внутренне закодированные с помощью двух флуоресцентных красителей, (2) кодированные микросферы внешне модифицированный белок-специфичных моноклональных антител, (3) мультиплексированные микросферы смешивают и (4) случайным образом на хранение в лунки, выгравированных на проксимальном конце волоконно-оптического пучка, (5) слюнных белков захватываются микросфер через сэндвич-иммуноанализа, и (6) количественно с помощью флуоресцентной микроскопии.

1. Микросферы Кодирование

  1. Взвесьте европий натрия (III) thenoyltrifluoroacetonate тригидрат (Eu-TTA, ММ = 869,54 г / моль) в стеклянном флаконе янтарного и подготовить исходный раствор 200 мм в тетрагидрофуране (ТГФ). Осторожно перемешать с помощью пипетки; визуально убедиться,краситель полностью не растворится.
  2. Взвесить кумарин 30 (C30, ММ = 347,41 г / моль) в стекл нный сосудик на янтарного и подготовить 12 мМ маточного раствора в ТГФ. Осторожно перемешать с помощью пипетки; визуально убедиться, краситель полностью не растворится.
  3. Подготовка 700 мкл рабочего раствора для каждого типа микросфер с использованием исходных растворов и ТГФ достичь конечной концентрации приведены в таблице 1.
  4. Убедитесь, микросферы (10% вес / объем) хорошо взвешенные на вортексе, а затем передать 60 мкл суспензии в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  5. Добавить 600 мкл PBS в суспензии микросфер и перемешать с помощью пипетки 20x. Центрифуга трубки при 10000 оборотов в минуту для 3 мин и осторожно удалите супернатант. Повторите эту процедуру еще 2 раза, чтобы промыть микросферы.
  6. Промыть 3 раза таблетки микросфер с ТГФ с использованием аналогичной процедуры, как на стадии 1.5.
  7. Центрифугируют суспензию микросфер / ТГФ при 10000 оборотах в минуту в течение 3 минут, удалить супернатант, и повторно приостанавливать осадок в 600 мклРабочий раствор приведены в таблице 1. Перенести смесь в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  8. Закройте микроцентрифужную пробирку парафильмом и поместить его на шейкере. Встряхнуть до 3000 мин-и выдержать в течение 24 часов, защиты от света, покрывая установку с использованием коробку, покрытую алюминиевой фольгой.
  9. Центрифуга суспензии микросфер при 10000 оборотах в минуту в течение 3 мин с образованием гранул.
  10. Удалить супернатант раствор красителя, промыть микросферы 6x с 600 мкл метанола, а затем с 600 мкл PBS, содержащим 0,01% Tween-20 другой 6x, как описано на стадии 1.5.
  11. Хранить кодированные микросферы в 600 мкл PBS, содержащим 0,01% Tween-20 при 4 ° С до использования, не защищают от света.
Имя типа микросфер: 1 2 3 4 5 6 сильный> 7
Eu-TTA (мМ) 100 100 10 100 10
C30 (мМ) 1 1 6 6 1 6

Таблица 1. Концентрации Eu-TTA и C30 рабочих растворов.

2. Подготовка Белок захвата микросфер

  1. Подготовка MES буфера [2 - (N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) 0,1 М, 0,9% NaCl, 0,01% SDS, рН 5,7], а PBS / SDS буфера (фосфат натрия 0,01 М NaCl, 0,154 М, SDS 0,01%, рН 7.4) заранее при комнатной температуре.
  2. Добавить 200 мкл закодированный суспензии микросфер (содержащий ~ 2 мг микросфер) в Safe-Lock 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Важно использовать этот тип трубки микроцентрифужных, чтобы избежать утечки во время инкубации на стадии 2.6.
    3. <литий> Вымойте микросферы с 600 мкл MES буфер 3 раза, как описано в шаге 1.5. Добавить 700 мкл MES на таблетки микросфер и хорошо перемешать с помощью пипетки.
  3. Подготовка 0,105 г / мл 1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимида (EDC, ММ = 191,7 г / моль) и 0,163 г / мл сульфо-N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NHS, ММ = 217,13 г / моль) решения в MES буфере в отдельные пробирки.
  4. Добавить 150 мкл свежеприготовленные EDC падение решение по капле в суспензии микросфер. EDC гидролизует очень быстро, при этом необходимо использовать свежеприготовленный раствор для обеспечения эффективности иммобилизации. Сразу же после добавления EDC, добавьте 150 мкл раствора сульфо-NHS ​​на микросферах, хорошо перемешать с помощью пипетки и проверить суспензию гомогенной.
  5. Закройте пробирку крышкой, запечатать его парафильмом, и поместить его на шейкере. Взболтать в 1500 оборотах в минуту в течение 4 часов, защищать от света, используя окно покрывают алюминиевой фольгой.
  6. Центрифуга микросфер suspensион при 10000 оборотах в минуту в течение 3 мин с образованием гранул и удалить супернатант. Промыть микросферы с 500 мкл PBS / SDS буфера 3x, как описано на стадии 1.5.
  7. Добавить 200 мкл PBS / SDS буфера к осадку, смешивать микросферы хорошо и передавать решение 300 мкл PBS / SDS-буфера, содержащего 60 мкг антитела захвата. Важно, чтобы приостановить осадка микросфер, а затем добавить к суспензии микросфер в раствор антител.
  8. Выдержите смесь антитело-микросферы путем встряхивания при 1500 оборотах в минуту в течение 4 часов на шейкере, защищать от света, используя окно покрывают алюминиевой фольгой.
  9. Центрифуга суспензии микросфер при 10000 оборотах в минуту в течение 3 мин с образованием гранул и удалить супернатант. Промыть микросферы с 500 мкл StartingBlock (TBS) блокирующем буфере 3 раза, как описано на стадии 1.5.
  10. Смешайте микросфер с 1 мл блокирующего буфера TBS и инкубировать микросфер в 1500 оборотах в минуту в течение 1 часа на орбитальном шейкере, защищают от света с использованием коробки бухтукрасный алюминиевой фольгой.
  11. Центрифуга суспензии микросфер в 7000 оборотах в минуту в течение 3 мин с образованием гранул и удалить супернатант. Промыть 3 раза гранул с 500 мкл блокирующего буфера TBS, как описано на стадии 1.5.
  12. Центрифуга микросфер раствор при 7000 оборотах в минуту в течение 3 мин с образованием гранул и удалить супернатант. Добавить 500 мкл TBS блокирующий буфер и перемешать с помощью пипетки.
  13. не сохранить измененный суспензии микросфер при 4 ° С до использования, защиты от света.
  14. Повторите эту процедуру, чтобы сделать другие типы микросфер с использованием соответствующих антител.

3. Волоконно-оптический микрочипов Ассамблея

  1. Смешать 50 мкл каждого типа белок захвата микросфер в новую пробирку микроцентрифужных автоклавного. Центрифуга фондовые микросферы бассейн в 7000 оборотов в минуту в течение 3 минут, и удалите супернатант, так что оставшийся объем составляет примерно 100 мкл.
  2. Вырезаются вручную волоконно-оптических пучков в примерно 5 см в длину ипоследовательно полировать оба конца на шлифовальные машины с помощью 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 и микронных бриллиант 0,05 притирки фильмы. Обрабатывают ультразвуком полированную пучок в деионизированной воде в течение 2 мин, чтобы удалить любые частицы.
  3. Нанесите небольшое магнитной мешалки в 0,5 мл микроцентрифужных трубки, добавьте 400 мкл не содержащей белков PBS буферами и размешать на магнитной перемешивающей пластине в течение 30 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  4. Etch один конец полированной расслоения в растворе 0,025 N HCl для 150 с 10,16. Сразу погрузить и разрушать ультразвуком травления конец в деионизированной воде в течение 1 мин. Высушите пучки волокон с помощью сжатого воздуха.
  5. Установите расслоение на держателе волокна и блокировать травлению в конец без пузырьков, безбелковый PBS буфере в течение 1 часа.
  6. Депозит 1 мкл Аликвоту суспензии микросфер хранящейся на протравленной конце волоконно-оптического пучка. Защитите установку от света с коробкой с алюминиевой фольгой, и ждать в течение 15 мин. Объем суспензии будетуменьшить выпариванием и заставить микросфер в протравленных лунок. Повторите эту стадию загрузки еще раз.
  7. Используйте тампон, насыщенный раствора образца для удаления микросферы, которые не попавшие в лунки. Белок микрочипов теперь готов к использованию. Перейти сразу к шагу 4.1 для анализа слюны.

4. Анализ слюны применением микросфер Microarray

  1. Добавить 200 мкл раствора образца (100 мкл надосадочной слюна разбавляют равным объемом StartingBlock Т20 (PBS) блокирующем буфере. Протокол сбора слюны в течение супернатанта был опубликован ранее 10). в 0,5 мл автоклавного микроцентрифужных трубки. Dip белка микрочипов, загруженной на волокне в раствор и инкубируют на шейкере при 600 оборотах в минуту в течение 2 часов, защищать от света, используя окно покрывают алюминиевой фольгой.
  2. Подготовка 20 мл промывочного буферного раствора путем добавления 200 мкл 10%-ного раствора BSA и 200 мкл 10% Твин-20 в 19,6 мл PBS, MIх хорошо, осторожно встряхивая.
  3. Опустите белка микрочипов в новый автоклавного микроцентрифужную пробирку, содержащую 200 мкл моющего буфера и встряхните при 600 оборотах в минуту в течение 2 мин. Повторите эту промыть 3 раза.
  4. Инкубируйте микрочипов в 100 мкл раствора коктейлем детектирующего антитела, содержащего 5 мкг / мл анти-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, IL-1β биотинилированные антитела обнаружения в StartingBlock Т20 (PBS) блокирующем буфере в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере при 600 оборотах в минуту, защищать от света, используя окно покрывают алюминиевой фольгой.
  5. Вымойте микрочипов 3 раза промывочным буфером, как описано в шаге 4.3.
  6. Инкубируйте микрочипов в 200 мкл 20 мкг / мл стрептавидин конъюгат R-фикоэритрин (SAPE) раствора в PBS при 600 оборотах в минуту на шейкере в течение 10 мин, защищать от света, используя окно покрывают алюминиевой фольгой.
  7. Вымойте микрочипов 5x промывочным буфером, как описано в шаге 4.3.
  8. Очистка дистальный конец волокна (то есть, конец далекоиз микросфер) пачка с тампоном, насыщенным абсолютного этанола.
  9. Сушат оба конца волокна с сжатым воздухом. Установите волокна на epifluorescent микроскопа и изображения через дистальный конец световода.
  10. Приобретать микросфер изображения, соответствующие Eu-TTA, C30, и Sape интенсивности флуоресценции. Настройка Оптические фильтры и время экспозиции для флуоресцентной визуализации Eu-TTA, C30, и SAPE приведены в таблице 2.
Канал Eu-TTA C30 SAPE
Возбудитель 365/10x 350/50x 546/10x
Светоделитель 525DCLP 400DCLP 560LP
Излучатель 620/60m 460/50m 580/30m
Время воздействия 1 сек 0,3 сек 1 сек

Таблица 2. Параметры для трех флуоресцентных изображений микрочипов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресцентные изображения из трех каналов, показывающих небольшой участок волоконно-оптического пучка показаны на рисунках 2A-C. Эти изображения были проанализированы с использованием алгоритма, написанный на MATLAB (как описано более подробно в разделе обсуждение). Анализ использует и информацию кодирования изображения Eu-TTA (рис. 2а) и кодирование C30 изображение (фиг.2В) для декодирования микросфер, и были рассчитаны интенсивности флуоресценции различных микросфер ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследователи должны обратить особое внимание на следующие шаги: для большей точности декодирования, необходимо проверить эти микросферы равномерно приостановлено по всей инкубации и мыть шаги во время процедуры кодирования микросферы. Кроме того, кодированные микросферы должны быть защищены от света в течение всего эксперимента. После надлежащих кодирования и хранения процедур, мы обнаружили, что общая точность декодирования был выше 99%. Кодированные микросферы следует хранить при температуре 4 ° С. Избегайте ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья (грантов 08UDE017788-05). EBP также признает поддержку от испанского фонда по науке и технике (FECYT). Авторы благодарят Шонда Т. Gaylord и Pratyusha Mogalisetti за критическое прочтение рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Краситель Eu-TTAFisher ScientificAC42319-0010
THFSigma-Aldrich34865-100ML
Флакон из янтарного стеклаFisher Scientific03-339-23B
Кумарин 30 красительSigma-Aldrich546127-100MG
МикросферыBangslabsPC05N/6698
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиFisher Scientific05-408-129
PBS 10x концентратSigma-AldrichP5493-1L
ВодаSigma-AldrichW4502-1L
МетанолSigma-Aldrich34860-100ML
Tw-20Sigma-AldrichP7949-100 мл
BupH MES буферизованный физиологический растворThermo Scientific28390
SDSSigma-Aldrich05030-500ML-F
NaOH растворFisher ScientificSS256-500
Safe-lock микроцентрифужная пробиркаVWR labshop53511-997
EDCThermo Scientific22980
Sulfo-NHSThermo Scientific24510
Захват антител VEGF человекаR& D SystemsMAB293
Антитела для захвата человека IP-10R& D SystemsMAB266
Human IL-8 capture антителаR& D SystemsMAB208
Антитела к захвату человеческого EGFR& D SystemsMAB636
Антитела для захвата человека MMP-9R& D SystemsMAB936
Human IL-1β capture антителаR& D SystemsMAB601
Мышь IgG1 контроль изотипа антителR& D SystemsMAB002
StartingBlock (TBS) буферThermo Scientific37542
HCl стандартный раствор 1,0 NSigma-Aldrich318949-500 мл
0,5 мл микроцентрифужные пробиркиFisher Scientific05-408-120
Безбелковый (PBS) буферThermo Scientific37572
Рекомбинантный человеческий VEGF 165НИР D Systems293-VE
Рекомбинантный человек IP-10R& D Systems266-IP
Рекомбинантный человек IL-8R& D Systems208-IL
Рекомбинантная человеческая EGFR& D Systems236-EG
Рекомбинантный человек MMP-9R& D Systems911-MP
Рекомбинантный человеческий IL-1&бета;НИР D Systems201-LB
StartingBlock T20 (PBS) буферThermo Scientific37539
Блокатор BSA в PBSThermo Scientific37525
Биотинилированное обнаружение антител VEGFR& D SystemsBAF293
Биотинилированное антитело IP-10R& D SystemsBAF266
Биотинилированные антитела к IL-8 R& D SystemsBAF208
Обнаружение биотинилированных антител к EGFR& D SystemsBAF236
Биотинилированные антитела MMP-9R& D SystemsBAF911
Биотинилированный IL-1&бета антитела R& D SystemsBAF201
стрептавидин, R-фикоэритрининвитрогенS-21388
этанол (200 проба)Sigma-AldrichE7023-500ML

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
  2. Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
  3. Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
  4. Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
  5. de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
  6. Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
  7. Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
  8. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  9. Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
  10. Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
  11. Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
  12. Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
  13. Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
  14. St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
  15. Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
  16. Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
  17. Schena, M. Protein Microarrays. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).
  18. Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from: http://www.rndsystems.com/Products/MAB002 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Fluorescent MicroarraySalivary Protein AnalysisPolymer MicrospheresFiber optic BundlesMicrosphere EncodingAntibody CouplingFluorescence MicroscopySandwich ImmunoassayBiofluid AnalysisMATLAB Algorithm

Related Articles