Методическая статья

Модель in vitro для изучения иммунных реакций мононуклеарных клеток периферической крови человека на респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию человека

7.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50766

⸱

10 декабря 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Radboud university medical center

В этой статье

Краткое содержание

Респираторно-синцитиальный вирус человека (HRSV) может вызывать тяжелый бронхиолит у маленьких детей. Часть патогенеза тяжелого заболевания HRSV обусловлена иммунным ответом хозяина. Стимуляция первичных иммунных клеток человека с помощью HRSV обеспечивает быструю и воспроизводимую модельную систему для изучения активации воспалительных путей и инфекции.

Аннотация

Инфекции респираторно-синцитиального вируса человека (HRSV) представляют широкий спектр тяжести заболевания, начиная от легких инфекций и заканчивая опасным для жизни бронхиолитом. Важной частью патогенеза тяжелого течения заболевания является усиленный иммунный ответ, приводящий к иммунопатологии.

Здесь мы описываем протокол, используемый для исследования иммунного ответа иммунных клеток человека на инфекцию HRSV. Во-первых, мы описываем методы, используемые для культивирования, очистки и количественного определения котла-утилизатора. Затем мы опишем модель in vitro человека, в которой мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) стимулируются живыми HRSV. Эта модельная система может быть использована для изучения нескольких параметров, которые могут способствовать тяжести заболевания, включая врожденный и адаптивный иммунный ответ. Эти реакции могут быть измерены на транскрипционном и трансляционном уровне. Более того, вирусное заражение клеток можно легко измерить с помощью проточной цитометрии. В целом, стимуляция PBMC с помощью HRSV в реальном времени обеспечивает быструю и воспроизводимую модельную систему для изучения механизмов, участвующих в заболевании, вызванном HRSV.

Введение

Респираторно-синцитиальный вирус человека (HRSV) является наиболее распространенной причиной инфекций нижних дыхательных путей у детей. Каждый год более 33 миллионов детей в возрасте до пяти лет заражаются HRSV, что приводит к более чем трем миллионам госпитализаций и почти 200 000смертей1. Растущий объем фактических данных свидетельствует о том, что HRSV также представляет значительную угрозу для пожилых людей и взрослых с основными хроническими заболеваниями2.

Большинство инфекций HRSV у маленьких детей проявляются легкими симптомами, сравнимыми с обычной простудой, и не требуют клинического вмешательства. Тем не менее, небольшой части пациентов требуется госпитализация и искусственная вентиляция легких из-за тяжелого бронхиолита.

Частью патогенеза болезни HRSV является чрезмерный и неадекватный иммунный ответ хозяина на инфекцию3,4. Это иллюстрируется несколькими наблюдениями. Период максимального течения болезни часто предшествует пику вирусной инфекции и лучше совпадает с клеточной инфильтрацией инфицированных тканей и высвобождением воспалительных цитокинов3. Еще одна линия доказательств связана с испытаниями инактивированной формалином HRSV (FI-RSV) в 1960-х годах. Вместо того, чтобы вызывать защиту у младенцев младшего возраста, вакцина привела к чрезмерному иммунному ответу, что привело к усилению респираторных заболеваний и повышению заболеваемости и смертности.

Было разработано несколько моделей для изучения патогенеза инфекций HRSV. Непрерывные клеточные линии, такие как HEp-2 и A549, широко используются для изучения инфекции HRSV in vitro. Эпителиальные клетки являются основными мишенями инфекции HRSV5, поэтому большое внимание уделяется этим типам клеток. Однако ситуация in vivo гораздо сложнее и не ограничивается одним типом клеток. Для изучения этих сложных взаимодействий было разработано несколько моделей инфекций животных для изучения патогенеза HRSV. До сих пор использовались две различные стратегии, сосредоточенные либо на гетерологичных (нечеловеческих) моделях, либо на родственных моделях пневмовируса хозяина. Примеры гетерологичных моделей HRSV включают шимпанзе, овец, хлопковых крыс и мышей. РСВ-инфекция в ее естественном хозяине была изучена на крупном рогатом скоте и мышах с использованием РСВ крупного рогатого скота и пневмовируса соответственно.

Хотя каждая из этих моделей предоставила важные сведения о патогенезе заболевания, HRSV хорошо адаптирована к людям. Поэтому, в качестве дополнения к используемым в настоящее время клеточным линиям и животным моделям, мы предлагаем использовать первичные PBMC человека в качестве модели для стимуляции HRSV. МПМП человека могут быть получены у различных лиц для решения конкретных исследовательских вопросов, включая детеймладшего возраста 6, лиц с ослабленным иммунитетом, а также здоровых взрослых7 или пожилых людей8. PBMC можно использовать для изучения врожденных аспектов инфекции, а также адаптивного ответа на вирус. Активные воспалительные пути, важные для патогенеза заболевания HRSV, могут быть изучены на уровне мРНК и белка. Кроме того, вирусная инфекция (подмножеств) иммунных клеток может быть определена с помощью проточной цитометрии. Ранее мы использовали эту модель для определения синергетических эффектов инфекции HRSV вместе с бактериальным лигандом мурамилдипептидом (MDP) на индукцию провоспалительных цитокинов7. Мы предлагаем использовать стимуляцию HRSV первичных PBMC человека в качестве надежной, простой и быстрой модели in vitro для изучения воспалительных путей, участвующих в патогенезе заболевания HRSV.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание:

Эксперименты с HRSV должны проводиться в шкафу биологической безопасности в лаборатории 2-го уровня биобезопасности. Все вирусные отходы и материалы, контактировавшие с вирусом, следует собирать для надлежащей утилизации в связи с биологической опасностью.

При использовании потенциально инфицированной человеческой крови необходимо соблюдать особые меры предосторожности.

Крайне важно использовать реагенты, свободные от эндотоксинов, на протяжении всех протоколов.

1. Культивирование HRSV A2

  1. Культивируйте клетки HeLa или HEp-2 в среде DMEM + 10% фекальной сыворотки теленка (FCS) + 1% пенициллина/стрептомицина (P/S) в культуральном флаконе объемом 175 cm2 до достижения примерно 50% конфлюэнтности.
  2. Трижды промойте клетки фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) комнатной температуры.
  3. Разморозьте флакон с исходным стоком вируса HRSV в водяной бане при 37 °C. Разведите сток вируса так, чтобы MOI составлял 0,1 или ниже. Это предотвратит образование дефектных интерферирующих частиц (DIPs). Разведите сток вируса в 4 мл/флакона инфекционной среды (DMEM + 1% P/S) и добавьте к клеткам HeLa или HEp-2. Старайтесь поддерживать этот объем минимальным, чтобы клетки не пересыхали. Чем меньше объем, тем выше будет скорость инфицирования.
  4. Инкубируйте 2–4 ч при 37 °C, 5% CO2. Каждые 15 мин аккуратно встряхивайте флакон для перераспределения среды.
  5. Удалите инокулят и однократно промойте клетки раствором PBS.
  6. Добавьте 15 мл культуральной среды (DMEM + 10% FCS + 1% P/S) и инкубируйте в течение 3–5 дней при 37 °C, 5% CO2. Наблюдайте за клетками с помощью обычной светлопольной микроскопии для выявления индуцированных вирусом цитопатологических изменений, например, образования синцитиев, гибели и появления плавающих клеток.
  7. При появлении цитопатологии соберите HRSV путем соскабливания клеток и поместите вирусную суспензию в стерильную пробирку объемом 50 мл. Перемешайте клеточную суспензию на вортексе. Соскабливание и вортекс клеток способствуют высвобождению большего количества вирусных частиц.
  8. Центрифугируйте вирусную суспензию в течение 10 мин при комнатной температуре при 1 800 x g для осаждения клеточного дебриса. HRSV в супернатанте не осаждается при такой скорости; супернатант можно использовать непосредственно для инфицирования нескольких флаконов объемом 175 cm2 или хранить при -80 °C в виде исходного стока в аликвотах по 1 мл для последующего использования. Всегда подвергайте HRSV мгновенной заморозке в жидком азоте, чтобы предотвратить потерю инфекционных вирусных частиц.
  9. Как указано выше, исходный сток, приготовленный по данному протоколу, используется для инфицирования нескольких культуральных флаконов объемом 175 cm2. Повторите точно этот же протокол для получения большего количества вируса для очистки. За один цикл ультрацентрифугирования можно очистить до 180 мл вирусной суспензии.
  10. При появлении цитопатологии соберите HRSV путем соскабливания клеток и соберите супернатант. Перемешайте вирусную суспензию на вортексе. Центрифугируйте в течение 10 мин при комнатной температуре при 1 800 x g для осаждения клеточного дебриса. HRSV в супернатанте не осаждается при такой скорости; супернатант разлейте по аликвотам по 15 мл в пробирки объемом 50 мл. Заморозьте мгновенно и храните при -80 °C до очистки.

2. Очистка HRSV

Примечание: Перед использованием ультрацентрифуги помните, что это потенциально опасное оборудование. Ознакомьтесь с руководством по эксплуатации и проведите первый цикл ультрацентрифугирования под наблюдением опытного специалиста.

  1. Очистите стаканы для ультрацентрифугирования 70% этанолом и высушите их в шкафу биологической безопасности.
  2. Поместите стерильную центрифужную пробирку в каждый стакан.
  3. Приготовьте 30% (масс./об.) раствор сахарозы в PBS, стерилизуйте путем фильтрации (фильтр 0,2 μm) и добавьте по 5 ml на дно каждой центрифужной пробирки. Для ускорения протокола пробирки с раствором сахарозы можно заморозить. Обязательно соблюдайте стерильность.
  4. Если раствор сахарозы не был заморожен, очень осторожно добавьте 30 ml раствора HRSV поверх этого раствора сахарозы. Пипетируйте медленно, чтобы не нарушить слой сахарозы. Сохраняйте четкую границу раздела фаз. Если пробирки были заморожены, налейте вирусную суспензию на замороженный раствор сахарозы, а затем дайте ей оттаять.
  5. Очень осторожно сбалансируйте шесть стаканов для ультрацентрифугирования с помощью стерильного PBS. Поместите весы в ламинарный шкаф для поддержания стерильности. Заполняйте пробирки до уровня 3-5 mm ниже края, иначе центрифужные пробирки могут деформироваться. Сбалансируйте стаканы с точностью до 0,1 g, учитывая завинчивающуюся крышку на случай, если крышки имеют разную массу.
  6. Центрифугируйте в ультрацентрифуге в течение 1,5 hr при 4 °C и 20,000 rcf.
  7. Осторожно извлеките центрифужную пробирку из стакана с помощью стерильного пинцета. Вирусные частицы пройдут через слой сахарозы и образуют осадок. Напротив, растворимые факторы, секретируемые клетками (например, цитокины), останутся в растворе. Наклоните центрифужную пробирку, чтобы слить всю жидкость. Оставьте её перевернутой на стерильной поверхности, например, на культуральной чашке, для просушки, но не допускайте полного высыхания осадка.
  8. Осторожно добавьте 1 ml сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) к осадку и наклоните центрифужную пробирку, чтобы слить HBSS. Снова просушите пробирку в перевернутом виде на стерильной поверхности. Не допускайте полного высыхания осадка.
  9. Ресуспендируйте осадок в 1 ml HBSS, пропипетировав 40 раз. Старайтесь избегать образования пузырьков воздуха, так как это может разрушить вирус.
  10. Разделите вирус на аликвоты, подвергните мгновенной заморозке в жидком азоте и храните при -80 °C до дальнейшего использования. Для каждого эксперимента используйте новую аликвоту вируса, так как повторные циклы замораживания-оттаивания снизят инфекционный титр. При оттаивании всегда делайте это при 37 °C, так как HRSV менее стабилен в диапазоне от -20 до 15 °C.

3. Количественное определение HRSV

Примечание: для обеспечения воспроизводимости данных повторите количественный анализ не менее 3 раз в дубликатах.

3.1. Инфицирование клеток A549

  1. Культивируйте клетки A549 в 24-луночном планшете до достижения конфлюэнтности.
  2. Дважды промойте клетки A549 1 мл PBS при комнатной температуре.
  3. Приготовьте пятикратные серийные разведения HRSV в среде с пониженным содержанием сыворотки (Reduced Serum Medium). Добавьте по 100 μl разведенного вируса в каждую лунку. Сделайте минимум 4 разведения (например, 4-, 20-, 100- и 500-кратные). Включите две дополнительные лунки, инфицированные максимальной дозой вируса (они будут использоваться для изотипического контроля), а также две лунки с имитацией инфекции (mock-infected).
  4. Инкубируйте клетки в течение 2 ч при 5% CO2, 37 °C. Каждые 15 мин аккуратно встряхивайте 24-луночные планшеты, чтобы предотвратить высыхание среды.
  5. Удалите вирусную суспензию и один раз промойте клетки 1 мл PBS при комнатной температуре.
  6. Приготовьте 4% (w/v) раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) в среде с пониженным содержанием сыворотки. Стерилизуйте раствор путем фильтрации (фильтр 0.2 μm) и добавьте по 500 μl в каждую лунку.
  7. Инкубируйте при 5% CO2, 37 °C в течение 22 ч.

3.2. Подготовка к FACS

  1. Удалите среду и однократно промойте клетки 1 ml PBS комнатной температуры.
  2. Добавьте по 200 μl предварительно нагретого трипсина (37 °C) в каждую лунку и инкубируйте в течение 10 min при 37 °C и 5% CO2.
  3. Проверьте отделение клеток под микроскопом. Если клетки отделились, добавьте 800 μl DMEM + 10% FCS + 1% P/S для нейтрализации трипсина. Ресуспендируйте клетки.
  4. Перенесите клетки в конический 96-луночный планшет, не обработанный для культивирования тканей. Центрифугируйте 5 min при 400 x g при комнатной температуре. Ресуспендируйте осадки в 200 μl холодного PBS.
  5. Центрифугируйте 5 min при 400 x g при 4 °C. Слейте супернатант и ресуспендируйте в 200 μl холодного PBS.
  6. Центрифугируйте 5 min при 400 x g при 4 °C. Слейте супернатант и ресуспендируйте в 150 μl 80% ледяного ацетона.
  7. Фиксируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 min.
  8. Центрифугируйте 5 min при 400 x g при 4 °C. Слейте супернатант и ресуспендируйте в 200 μl холодного PBS + 0.1 % BSA.
  9. Центрифугируйте 5 min при 400 x g при 4 °C. Слейте супернатант и ресуспендируйте в 50 μl anti-NP-RSV-FITC (разведение 1:50 в PBS + 1% BSA) или в 50 μl IgG2 anti mouse-FITC (в качестве изотипического контроля; используйте ту же концентрацию антител).
  10. В течение всего оставшегося протокола держите пробирки в темноте. Инкубируйте не менее 1 hr при 4 °C; время инкубации можно увеличить до ночи.
  11. Добавьте 150 μl холодного PBS + 0.1% BSA.
  12. Центрифугируйте 5 min при 400 x g при 4 °C. Слейте супернатант и ресуспендируйте в 200 μl холодного PBS + 0.1% BSA.
  13. Центрифугируйте 5 min при 400 x g при 4 °C. Слейте супернатант и ресуспендируйте в 200 μl холодного PBS + 0.1% BSA. Держите планшет на льду и в темноте до проведения FACS-анализа.
  14. Проанализируйте инфицированные клетки на проточном цитометре.

3.3. Расчет FITC-50

  1. Используйте программу для анализа данных проточной цитометрии, чтобы установить пороговое значение (cutoff) по отрицательному контролю (изотипическому контролю). Выберите тип графика Pseudocolor. Постройте квадрантный гейт так, чтобы положительные клетки находились в поле Q3. Процент ложноположительных результатов в обоих изотипических контролях должен быть ниже 0.2%.
  2. Экспортируйте данные в программу для работы с электронными таблицами и подготовьте таблицу с процентом FITC+ клеток для каждого разведения. Для каждого значения в каждом эксперименте вычтите среднее значение ложноположительных результатов (определенное по изотипическому контролю).
  3. Откройте новый файл (XY scatter, один столбец X и несколько столбцов Y) в статистической программе. Скопируйте данные в программу: X = разведение, Y = % инфицированных клеток, n = 3; используйте среднее значение двух измерений для каждого разведения. Выполните статистический анализ с помощью нелинейной регрессии (однофазный экспоненциальный распад). Проверьте, соответствует ли кривая точкам данных; если нет, выберите другой метод статистического анализа.
  4. Скопируйте уравнение кривой и значения параметров уравнения в программу для работы с электронными таблицами. Рассчитайте значение X для Y = 50%. Соответственно определите значение FITC-50, рассчитав количество инфицирующих частиц/мл, определяемых по FITC (FIP/ml), при разведении, при котором наблюдается 50% инфицирования, используя следующее уравнение:
    Формула расчета FITC50; диаграмма, иллюстрирующая уравнение измерения интенсивности флуоресценции.
    A = среднее количество клеток A549 на лунку
    B = μl вируса на лунку, использованного для инфицирования
    C = разведение, при котором наблюдается 50% инфицирования

4. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) из крови здорового добровольца

  1. Заберите венозную кровь в пробирки с 10 мл ЭДТА у здоровых добровольцев после получения информированного согласия. Объем крови 10 мл позволит получить примерно 107 PBMC.
  2. С этого момента все манипуляции следует проводить в стерильных условиях в ламинарном шкафу.
  3. Разведите кровь в 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS) комнатной температуры в пробирке объемом 50 мл. На одну пробирку объемом 50 мл можно использовать максимальный общий объем разведенной крови 35 мл.
  4. Возьмите стерильный шприц объемом 50 мл и установите стерильную иглу с Luer-lock. Наберите в шприц среду для центрифугирования в градиенте плотности. Поместите иглу на дно пробирки с разведенной кровью и осторожно внесите 15 мл среды для градиента плотности под слой разведенной крови. Сохраняйте четкую границу между средой для градиента плотности и кровью.
  5. Центрифугируйте при 800 x g при комнатной температуре в течение 20 мин с ускорением 9 (макс.) и выключенным тормозом. После использования установите температуру центрифуги на 4 °C.
  6. В результате центрифугирования в градиенте плотности образуется несколько слоев. На дне находится осадок эритроцитов с серебристым слоем сверху, содержащим нейтрофилы. Прозрачный слой над этим осадком содержит среду для градиента плотности. Тонкий слой между средой для градиента плотности и слоем плазмы крови сверху содержит PBMC.
  7. Осторожно соберите PBMC с помощью пастеровской пипетки и перенесите клетки в новую пробирку объемом 50 мл. С этого момента держите PBMC на льду и используйте ледяной PBS. Добавьте ледяной PBS до объема 50 мл и центрифугируйте при 400 x g в течение 10 мин при 4 °C (с тормозом, установленным на 9).
  8. Удалите супернатант путем аспирации, ресуспендируйте осадок в 50 мл ледяного PBS и центрифугируйте при 400 x g в течение 10 мин при 4 °C; повторите процедуру 2 раза.
  9. После удаления супернатанта добавьте 1 мл ледяной среды (RPMI + 1% P/S) и подсчитайте количество клеток с помощью камеры Гориши.
  10. Доведите концентрацию клеток до 5 x 106 PBMC/ml.

5. Стимуляция PBMC живым HRSV

  1. Подготовьте установку для эксперимента; включите экспериментальные дубликаты для каждого условия.
  2. Разведите все необходимые стимулы в среде (RPMI + 1% P/S). Учитывайте, что конечный объем на лунку составит 200 μl. Поскольку будет добавлено 50 μl стимулов, приготовьте стоки стимуляции с 4-кратной концентрацией.
  3. Добавьте по 100 μl вышеупомянутой клеточной суспензии в каждую лунку круглодонного 96-луночного планшета (5 x 105 PBMC/лунку).
  4. Добавьте по 50 μl разведенных стимулов в каждую лунку. Можно добавить два разных стимула, что в сумме даст объем 200 μl. Если требуется только один стимул, доведите объем до 200 μl с помощью среды.
  5. Инкубируйте 96-луночный планшет в течение необходимого периода при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2. Для большинства цитокинов будет достаточно 24 ч инкубации.

6. Анализ результатов стимуляции

  1. По истечении периода инкубации центрифугируйте 96-луночный планшет в течение 5 min при комнатной температуре при 450 x g для осаждения клеток на дно.
  2. Соберите супернатант (максимальный объем 180 μl) и храните его для последующего анализа цитокинов (-20 °C) или для получения вируса (-80 °C).
  3. Стимулированные PBMC, находящиеся в осадке, можно проанализировать с помощью qPCR/Western blot, добавив лизирующий буфер, или, в качестве альтернативы, окрасить для анализа методом проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанный здесь метод культивирования и очистки HRSV A2 обеспечит выход от 2 x 107 до 2 x 108 инфекционных вирусных частиц/мл, количественно определенных с помощью FITC-50. Результаты микроскопического анализа, при котором подсчитывали инфицированные клетки, окрашенные FITC (результаты не представлены), сравнивали с результатами количественного анализа методом FACS (Рисунок 1). Оба метода дали схожие титры, однако метод FACS характеризовался гораздо меньшим стандартным отклонением м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы демонстрируем, что инфицирование PBMC HRSV является быстрой и надежной модельной системой, в которой можно изучать воспалительные пути. Для стимулирования PBMC необходимо подготовить и количественно оценить запас HRSV.

Множественные клеточные линии восприимчивы к HRSV-инфекции. Клеточными линиями, наиболее часто используемыми для культивирования HRSV, являются клетки HEp-2, HeLa и Vero. Тем не менее, мы не рекомендуем использовать клетки Vero для культивирования HRSV, по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

RSV A2 любезно предоставлен доктором Р. де Свартом (Erasmus MC, Роттердам, Нидерланды). MV и GF поддерживаются консорциумом Virgo, финансируемым проектом правительства Нидерландов No FES0908, и проектом Нидерландской инициативы по геномике (NGI) No 050-060-452. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagent
PBSLonzaBE17-516FPBS без Ca2+ Mg2+ или феноловый красный
HBSSInvitrogen14025-100HBSS, кальций, магний, без фенола красный
DMEMInvitrogen31966-047DMEM, высокий уровень глюкозы, GlutaMAX, пируват
RPMIInvitrogen72400054RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES
Reduced Serum Medium (Opti-MEM)Invitrogen51985-026Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX
FCSGreiner Bio-oneFBS (фетальная бычья сыворотка)
BSASigma AldrichA7030Альбумин из бычьей сыворотки
P/SInvitrogen15140-122Пенициллин-стрептомицин, жидкий
трипсинИнвитроген25300-0540,05% трипсин-ЭДТА (1x), фенол Красная
HeLa клеткиATCCCCL-2
A549 клеткиATCCCCL-185
сахарозаSigma AldrichS7903Sucrose BioXtra, ≥ 99,5%
IgG2 антимышиный-FITCBD Pharmingen555057Ms IgG2b K FITC контроль изотипа
Anti-NP-RSV-FITCAbcamAB25849Антитела к респираторно-синцитиальному вирусу [671] (FITC)
Градиентная среда плотности (Lymphoprep)Axis-Shield1114545
трубки ЭДТАBDBiosciences 367525
Ацетон Merck Millipore1000141000Ацетон для анализа
Material
Centrifuge TubesBeckman Coulter326823тонкостенный, полиалломер, 38,5 мл, 25 мм x 89 мм
SureSpin 630 Ротор с ведрами 36 млSorvall79368Качающееся ведро титановый ротор
Sorvall WX80 УльтрацентрифугаSorvall46900
CB 150л CO2 Binder
для инкубатора

Ссылки

  1. Nair, H., Nokes, D. J., et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet. 375, 1545-1555 (2010).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults. N. Eng. J. Med. , 352-1749 (2005).
  3. Openshaw, P. J. Antiviral Immune Responses and Lung Inflammation after Respiratory Syncytial Virus Infection. Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (2), 121-125 (2005).
  4. Openshaw, P. J., Tregoning, J. S. Immune responses and disease enhancement during respiratory syncytial virus infection. Clin. Microbio. Rev. 18 (3), 541-555 (2005).
  5. Villenave, R., Thavagnanam, S., et al. In vitro modeling of respiratory syncytial virus infection of pediatric bronchial epithelium, the primary target of infection in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 5040-5045 (2012).
  6. Tulic, M. K., Hurrelbrink, R. J., Prêle, C. M., Laing, I. A., Upham, J. W., Le Souef, P., Sly, P. D., Holt, P. G. TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory syncytial virus and lipopolysaccharide. J. Immunol. 179 (1), 132-140 (2007).
  7. Vissers, M., Remijn, T., et al. Respiratory syncytial virus infection augments NOD2 signaling in an IFN-β-dependent manner in human primary cells. Eur. J. Immunol. 42 (10), 2727-2735 (2012).
  8. Cherukuri, A., Patton, K., Gasser, R. A. Jr, Zuo, F., Woo, J., Esser, M. T., Tang, R. S. Adults 65 years old and older have reduced number of functional memory T cells to respiratory syncytial virus fusion protein. Clin. Vacc. Immunol. 20 (2), 239-247 (2013).
  9. Shafique, M., Wilschut, J., de Haan, A. Induction of mucosal and systemic immunity against respiratory syncytial virus by inactivated virus supplemented with TLR9 and NOD2 ligands. Vaccine. 30, 597-606 (2012).
  10. Kwilas, S., Liesman, R. M., Zhang, L., Walsh, E., Pickles, R. J., Peeples, M. E. Respiratory syncytial virus grown in Vero cells contains a truncated attachment protein that alters its infectivity and dependence on glycosaminoglycans. J. Virol. 83 (20), 10710-10718 (2009).
  11. Treuhaft, M. W., Beem, M. O. Defective interfering particles of respiratory syncytial virus. Infect. Immun. 37 (2), 439-444 (1982).
  12. Korns Johnson, D., Homann, D. Accelerated and improved quantification of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) titers by flow cytometry. PLoS One. 7 (5), e37337(2012).
  13. Wurfel, M. M., Park, W. Y., et al. Identification of high and low responders to lipopolysaccharide in normal subjects: an unbiased approach to identify modulators of innate immunity. J. Immunol. 175 (4), 2570-2578 (2005).
  14. Kimpen, J. L. Respiratory syncytial virus and asthma. The role of monocytes. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 7-9 (2001).
  15. Wang, S. Z., Forsyth, K. D. The interaction of neutrophils with respiratory epithelial cells in viral infection. Respirology. 5 (1), 1-10 (2000).
  16. San-Juan-Vergara, H., Sampayo-Escobar, V., Reyes, N., Cha, B., Pacheco-Lugo, L., Wong, T., Peeples, M. E., Collins, P. L., Castano, M. E., Mohapatra, S. S. Cholesterol-rich microdomains as docking platforms for respiratory syncytial virus in normal human bronchial epithelial cells. J. Virol. 86 (3), 1832-1843 (2012).
  17. Davidson, D., Zaytseva, A., Miskolci, V., Castro-Alcaraz, S., Vancurova, I., Patel, H. Gene expression profile of endotoxin-stimulated leukocytes of term new born: control of cytokine gene expression by interleukin-10. Plos One. 8 (1), e53641(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи