В естественных условиях 19 F МРТ для отслеживания сотовых

Краткое содержание

Мы опишем общую протокол для естественных отслеживания клеток при помощи МРТ в мышиной модели с бывших естественных условиях меченых клеток. Типичный протокол для маркировки клеток, обработки захвата изображений и количественного включен.

Аннотация

В естественных условиях ¹⁹ F МРТ позволяет отслеживать количественные клеток без использования ионизирующего излучения. Это неинвазивный метод, который может быть применен для человека. Здесь мы описываем общий протокол для маркировки клеток, работы с изображениями, и обработки изображений. Методика применима к различным типам клеток и животных моделях, хотя и здесь мы ориентируемся на типовой модели мыши для отслеживания мышиных иммунных клеток. Наиболее важные вопросы для маркировки клеток описаны, так как они относятся ко всем моделям. Аналогичным образом, основные параметры изображений перечислены, хотя подробности будут изменяться в зависимости от системы МРТ и индивидуальной настройки. Наконец, мы включили протокол обработки изображений для количественного определения. Вариации для этого, и другие части протокола, оцениваются в разделе обсуждения. На основе детального процедурой, описанной здесь, пользователю нужно будет адаптировать протокол для каждого конкретного типа клеток, этикетки клеток, животной модели, и настройки изображения. Отметим, что рrotocol также могут быть адаптированы для использования человеком, пока клинические ограничения будут выполнены.

Введение

В отслеживания естественных клеток имеет важное значение для оптимизации и контроля сотовых терапии ^1. Благодаря своей неинвазивной природы, изображения предлагает отличные возможности для мониторинга клетки в естественных условиях. Магнитно-резонансная томография (МРТ) не зависит от ионизирующего излучения и позволяет превосходное разрешение изображений и внутреннюю мягких тканей отличие. Отслеживание клеток МРТ на основе уже использовался клинически следовать дендритных клеток в больных меланомой ^2. Обычные клинические МРТ осуществляется на ¹ Н-ядром, присутствующих в подвижной воды в тканях. Кроме того, можно проводить МРТ в других активных ядер, например, ¹³ C, ¹⁹ F и ²³ Na. Тем не менее, только ¹⁹ F МРТ успешно применяется в естественных условиях отслеживания клеток в, как это предлагает самую высокую чувствительность после ¹ H. Отсутствие МРТ-обнаруживаемых эндогенного ¹⁹ F в тканях обеспечивает высокую селективность сигнала дляобнаружение экзогенных контрастных агентов ¹⁹ F и позволяет количественное определение концентрации фтора непосредственно из данных изображения. Для детального обсуждения на ¹⁹ F МРТ, см. ^3-5. Ключевым вопросом с ¹⁹ F МРТ является необходимость разработки и оптимизации соответствующих ¹⁹ F сотовые этикетки, хотя несколько этикеток были разработаны, с тенденцией к мультимодальных агентов ^6.

Протокол мы описываем здесь, основаны на исследованиях наших группах ^7-9, в том числе первых статей, которые, описанных естественных условиях количественного ¹⁹ F МРТ основе ячейку в отслеживания ^10,11. Общая процедура отслеживания клеток с использованием ¹⁹ F МРТ приводится на рисунке 1. Мы опишем общую протокол для маркировки и обработки изображений дендритных клеток (DC) с использованием заказных перфторуглерод контрастное вещество ^8. Протокол изображений, как правило, применяется к различных типов клеток, этикетки и животные модели.тип клеток и животных модель, описанная здесь должны быть приняты только в качестве примера, и, таким образом мы не предоставляем подробную информацию о выделения клеток и маркировки, а сосредоточиться на протоколе изображения. Модификации будут необходимы для каждой метки, типа клеток, животной модели, и настройки изображений, и их можно найти в литературе, или, возможно, должны быть оптимизированы исследователями. Некоторые общие модификации включены в обсуждении.

Протокол

Примечание: Все эксперименты и процедуры с участием животных должно проводиться в соответствии с соответствующими этическими принципами, а также соответствовать стандартным ухода за животными и гуманных требований.

1. Маркировка ячеек (Стандартный протокол с Coincubation)

1. Добавить ¹⁹ F ⁸ метку в незрелых ДК в концентрации 4 мг/10 ⁶ клеток (в 2 мл среды). Хорошо перемешать, чтобы перемешать.
2. Инкубируйте клетки с лейблом в течение 3 дней до созревания и уборки РС.
3. Соберите РС и удалить излишки этикетку промывкой по крайней мере 3-кратным в PBS. Граф клеток.
4. Ресуспендируют в небольшом объеме PBS для инъекций или дальнейшего тестирования.

Примечание: Этот протокол имеет отношение к этим конкретным ДК и этикетке. Процедура была оптимизирована в другой публикации ⁸ и включены только шаги по подготовке образца к изображению, так как в центре внимания этого протокола находится на визуализации. НENCE, протокол для изоляции, культуры и маркировки определенного типа клеток нужно будет либо найти в литературе или оптимизированы исследователем. Резюме всех других меток ¹⁹ F, которые были использованы в литературе представлен в другом месте ^6.

2. Определение ¹⁹ F / клетку с использованием ^19-F ЯМР

1. Наведите известное число меченых клеток (обычно более 0,5 х 10 ^6, или номер, что приводит к достаточной сигнала) в ЯМР трубы.
2. Добавить 10 мкл 5%-ной трифторуксусной кислоты (TFA). Если резонансная частота TFA непригоден из-за перекрывается с меткой, использовать альтернативный растворимое соединение, предпочтительно с одним ¹⁹ F резонанса.
3. Поместите образец в ЯМР-спектрометра и получить спектр ¹⁹ F. Убедитесь, что пропускная способность достаточна для обоих TFA (эталон) и агентом.

Примечание: TR должен быть достаточно длинным для FУлла релаксации ссылкой и образец вращается (около 5 раз T время ₁ релаксации самой длинной Т ₁ компонента в трубке, как правило, TR ~ 5-8 сек). Некоторые спектрометры требуют D ₂ O для сигнала частоты блокировки. Стандартный спектр ¹⁹ F является достаточным. Обширные усреднения или выше сотовые номера будут необходимы, если поглощение клеткой этикетке беден или если количество клеток являются низкими. Спектр должен быть сосредоточен между заданием и соответствующих пиков этикеток, если корректировки не были выполнены к ответственности за частичное возбуждения.

4. Рассчитать относительные площади под пиками ссылкой и образцом (или основного пика образца), а затем рассчитать среднее число ¹⁹ F в / элемент в образце.

Примечание: Весь процесс должен быть повторен и в среднем широко достаточно для достижения статистической значимости. Это также можно сделать с помощью спектроскопии непосредственно на магнитно-резонансной томографии. Нowever, отметить, что эта процедура показывает только среднюю ¹⁹ F нагрузку для большого количества клеток, а не вариабельности между клетками. Проверка однородности поглощения клеток требует присутствия флуоресцентного компонента на ¹⁹ F агента, так что поглощение клеток могут быть проанализированы с помощью микроскопии или проточной цитометрии.

3. Соображения по экспериментального проектирования - Cell инъекций

В связи с относительно бедным чувствительность ¹⁹ F ЯМР для отслеживания клеток, животной модели, где клетки будут локализации в больших количествах необходимо для успеха в естественных изображений. Типичные значения чувствительности в диапазоне от 1,000-100,000 cells/voxel/1 час времени сканирования ^6, с загрузкой клеток в диапазоне от 10 ¹¹ -10 ¹³ атомами фтора.

Количество и частота проведения сессий визуализации должно быть тщательно спланировано, так как это влияет на выбор анестетика. Следует отметить, что изофлуран может быть suitablе для ¹⁹ F ЯМР если ¹⁹ F резонансная частота изофлуран близка к этикетки используемого соединения. ИФ-прежнему могут быть пригодны если сессии визуализации достаточно коротки, чтобы предотвратить значительное наращивание. Несколько альтернативных анестетики были использованы в литературе ^10,11; пример включен в протокол изображения. Анестезия может должны быть оптимизированы для различных линий мышей и моделей заболеваний.

4. Дизайн Внешнего ¹⁹ F Reference

1. Используйте внешнюю ссылку, содержащую известное количество ¹⁹ F сигнала для количественного ^12. Выбрать интенсивность сигнала опорного быть примерно сопоставимо с ожидаемой от объекта.

Примечание: В общем, проще, если эталонное соединение такое же, как этикетке клеток, чтобы соответствовать параметры релаксации. Если спектроскопические последовательности или последовательности без пространственной локализации используются, то переменного токаompound с другим химического сдвига может быть необходимым.

2. Измените размещение, размер и форму обращения по мере необходимости, в зависимости от региона процентной (ROI). Примечание: Как правило, простой в использовании трубки с равномерным поперечным сечением по ссылке.

5. Работа с изображениями и подготовка мышь

1. Развести коммерчески доступного кетамина и ксилазина 1:10 об / об физиологическим раствором с получением исходные растворы 10 мг / мл кетамина и 2 мг / мл ксилазина.
2. Включите систему отопления в сканер (как правило, теплый воздух), чтобы обеспечить отверстие будет тепло до мышь образ.
3. Введите 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина внутрибрюшинное, чтобы инициировать анестезии. Примечание: Эти дозы были протестированы на CD1 (ICR) и НУ-Foxn1 ^ню 8-недельных самцов мышей. Другие штаммы, возможно, потребуется немного разные дозы, которые должны быть оптимизированы в отдельном эксперименте. Эта доза будет держать мышь под наркозом длябой 45 мин. Примечание: Глубину анестезии, как правило, достаточно, если животное не проявляет реакцию на ноги крайнем случае.
4. После того, как под наркозом, место животного в животной колыбели и обездвижить, чтобы предотвратить движение во время МРТ. При необходимости установите внешнюю ссылку рядом с животного. Оба опорный и ROI (ожидается расположение инъецированных клеток) должна быть в центре катушки. Животное должно быть подключено к температуре и контроля дыхания для физиологического мониторинга во время сканирования.
5. Обложка глаза мыши стерильной глазной мази для предотвращения высыхания во время длительных сеансов визуализации.
6. Если время визуализации превышает 40 мин, подготовить дополнительные катетеры для введения дополнительной кетамин / ксилазина прежде чем животное может проснуться. Статус два отдельных подкожных катетеров с рабочих растворов кетамина и ксилазина. Используйте этот катетер, чтобы дать мышью дополнительный 2,5 мг кетамина каждые 20 мин после первого 40 мин. Если необходимо, дополнительно продлить анестезии путем инъекции 0,5 мг дополнительного ксилазина через катетер, 100 мин после первой инъекции. Во всех случаях, экспериментальный время не должен превышать 3 ч, за исключением, возможно, под терминальных анестезии.
7. Убедитесь, что мышь нагревают непосредственно после первой инъекции и выдерживают при 37 ° C температуры тела. С помощью этого протокола, <80% оксигенации крови был обнаружен под дыхании воздухом атмосферы. Для предотвращения побочных эффектов от пониженной оксигенации крови, использовать 100% кислорода (0,3 л / мин). Температура тела и дыхание следует контролировать в течение всего эксперимента и до полного выздоровления животного. Обратите внимание, что скорость спонтанного дыхания под кетамином / ксилазина очень высока (200-250/min). Перебои в паттерна дыхания, а не скоростью дыхания, может означать, что более высокие дозы необходимо поддерживать подходящий состояние наркоза. Мышь пробудит спонтанно в течение 20-30 мин Afteг последняя доза анестетика.

Примечание: Для отслеживания клетки, необходимо изображением того же животного более одного раза. В этом случае, сессии визуализации должно быть запланировано с учетом времени, необходимому для оформления анестезии из системы и животных использования принципов института.

6. Изображений

¹ коррективы H и изображений

1. Расположите животное внутри сканера, так что рентабельность инвестиций в изоцентре помощью с низким разрешением, анатомическое сканирование с различной ориентацией среза (локализатор).
2. Используйте протокол регулярного прокладок на ^{1 ч,} например, глобальной прокладки по всему объему внутри катушки.
3. Отрегулируйте усиление опорного импульса (RG), то есть мощности передатчика измеряется в дБ в течение 1 мс Эрмита 90 ° радиочастотного импульса, используя сканирование регулировки, предусмотренных производителем.

Примечание: Эта настройка будетварьироваться в зависимости от типа РЧ катушкой и имеет важное значение для ¹⁹ F ЯМР поскольку сигнал на частоте F ^19, как правило, слишком низким для прямых настроек. Как следствие, оценка RG должны быть сделаны из измерений на ¹ H сигнала. Для передачи РЧ с поверхности змеевика, ^1Н RG должен быть настроен на плоскости, параллельной катушки через часть интерес, объемной катушки с однородной B ₁ профиль, точные параметры настройки менее важны.

4. Следующий протокол от ¹⁹ F отсчета импульсов регулировки усиления работает только, если оба ^1Н и ¹⁹ F РФ передача осуществляется с той же (одним или двумя-настроенной) РФ катушки. Для такого установки формирования изображения, профиль катушка (B _{1, передача} поле) ¹ H должна быть пропорциональна к профилю обмотки ¹⁹ F, когда фиксированный RG применяется, т.е. B _{1,1 H} = C * B _{1,19 F} с опоройortionality постоянной С.
   1. Чтобы подтвердить, что профили катушки пропорциональны для конкретного установки, приобрести ¹ H и ¹⁹ F флип угол карту (см. следующий раздел на B ₁ коррекции) на трубке с высокой степенью концентрации ¹⁹ F, например ТФК в воде (1:1, об / объем) с использованием идентичных поля-обзора (ПЗ), заранее (рис. 3).
   2. Используя тот же RG, убедитесь, что оба отображения одинаковы для глобального фактора С исключением
   3. После того, как ¹ Н RG определяется, обратите внимание, этот номер.
5. Провести обычный ^1Н МРТ в качестве анатомического ведения визуализации ¹⁹ F. Настройтесь систему к ¹⁹ F частоты клеток маркера и проводить ¹⁹ F MR сканирования. В идеале сканирования ¹⁹ F МРТ будет иметь то же поле-обзора и выбора среза как ¹ H МРТ, хотя обычно с более низким разрешением. Животное может быть восстановлена, как только томографовнг завершена. Обработка изображений может затем быть выполнена в автономном режиме.
6. Определить ¹⁹ F RG через отношению дБ _19F = дБ _1Н -20 * войти ₁₀ (С). Оценить частоту ¹⁹ F агента в отдельном эксперименте ин витро.

Примечание: В естественных условиях, точная частота может незначительно отличаться от эксперимента к эксперименту в силу различных условий прокладок. Для предотвращения химических сдвигов артефакты поэтому точная частота должна быть определены в каждом эксперименте на ¹⁹ F MRS, если это возможно. Типичный сканирования для сигнала очень низкая ¹⁹ F будет глобальная (пульс-продам) спектроскопии (TR = 200 мсек, NEX = 3000, ТП = 10 мин, BW = 50 кГц). NEX, таким образом Т.А., можно резко сократить для сигнала высокой ¹⁹ F. ¹⁹ F частота агент определяется из спектра после преобразования Фурье и фазовой коррекции. NEX относится к числу возбуждений, ТА время сбора и БОпропускной способности.

Примечание: Типичные параметры визуализации ⁹ на 11.7T/16 см выделенной сканера животных являются: анатомическая сканирования ^1Н визуализации с использованием турбо спинового эха (TSE) последовательности с TR / эффективным эхо времени (TE _EFF) = 2200 msec/42.8 мс, 8 отголоски в возбуждении, NEX = 2, 10 последовательных, 1 мм толщиной ломтиками, FOV = 1,92 х 1,92 см ^2, 128 х 128 матрица, т.е. разрешение 150 х 150 х 1000 мкм ^3, TA = 1 мин, BW = 50 кГц и линейная схема кодирования фазы. ¹⁹ F изображения были получены с той же последовательности и соответствующие геометрии, но в более низком разрешении в плоскости и низкой BW (NEX = 256, 48 х 48 матрица, т.е. разрешение 400 х 400 х 1000 мкм ^3, ТП = 57 мин, BW = 10 кГц).

7. B ₁ коррекция
   Использование радиочастотного катушку с неоднородной B ₁ профиль, например поверхности катушки, может помешать количественную оценку ¹⁹ F данных, так как сигнал зависитне только на ¹⁹ F концентрации, но и на расстоянии от катушки. Приобретать B ₁ карту на ¹ H канала для того, чтобы ретроспективно исправить ¹⁹ F данных. Это требует, чтобы ^один и H ¹⁹ F профили катушки идентичны, за коэффициент пропорциональности C исключением, и что достаточно ^1Н фон сигнал подается в регионах ¹⁹ F. Пример протокола для коррекции последовательности эхо ¹⁹ F спина представлен, используя один настроенный Tx / Rx поверхности катушки настраиваемого как к ¹ Н и ¹⁹ F и с пропорциональным B ₁ профилей ^13.
   1. Приобретать ¹ H флип угол карту с двумя угловыми флип метода ^14. Приобретать градиент эхо сканирования с очень долго TR (> 3 раз ¹ HT ₁₎ по оценкам, флип углом чуть ниже 90 °. Закройте на катушку. Приобретать второй градиент эхо сканирование с RG = дБ _1H -6, т.е. в два раза оборотнаяУгол при первом сканировании.
   2. Рассчитать угол флип ¹ H, α, при вокселя (х, у, г) через интенсивностей сигналов (СИ) первого и второго сканирования градиент эхо: α (х, у, г) = Аркос (СИ _{GE, 1} ( х, у, г) / 2SI _{GE, 2} (х, у, г)) ^14. Угол флип ¹⁹ F идентичен из-за пропорциональной B ₁ профилей (для коэффициента 1 / C исключением). В соответствии с принципом Фарадея взаимности ¹⁵ затухании ¹⁹ интенсивности F сигнала от спинового эха последовательности (угол флип возбуждения α, переориентации флип угол 2α) во время приема сигнала является ATT _Rx (х, у, г) ~ α (х, у , г). Затухание из-за несовершенства возбуждения АТТ _Tx (х, у, г) ~ грех ³ (α (х, у, г)) ^16. Общая затухания записывается как ATT = attRx * attTx = α * греха ³ (α) / 90 °. Следует отметить, что нормирована на 1 в случае идеального угла 90 ° / 180 ° возбуждения / переориентации флип. B ₁ исправлена19 F изображений интенсивности сигналов SI _{19F, корр} рассчитываются с помощью СИ _{19F, корр} (х, у, г) = SI _19F (х, у, г) / ATT (х, у, г).
   3. Для сравнения интенсивности сигналов от различных экспериментов, место опорного трубку с определенным ¹⁹ концентрации F в поле зрения, и нормализовать SI _{19F, корр} к среднему сигнала в ссылки.

Примечание: Другие способы ₁ / флип отображение угол ¹ НВ можно использовать и различные импульсные последовательности ¹⁹ F требуют модификации АТТ _{Tx, 19F.} Любой вид В1 схемы коррекции представит дополнительную погрешность в процедуре клеток количественного. Если точное клеток количественная является основной посыл, РФ катушка с однородной профиля B1 могут быть использованы, чтобы обойти эту часть протокола.

7. Обработка изображений

1. Оформление ¹ H и ¹⁹ F наложение изображений
   1. Экспорт данных изображениядля окончательного ¹ Н и ¹⁹ F величины изображений из сканера.
   2. Откройте файлы в программе обработки изображений, такие как ImageJ (бесплатный, NIH).
   3. Провести настройку изображения по мере необходимости (обрезки, яркость, контрастность), поддерживая коррективы то же самое для всех изображений. В ¹⁹ F изображения, как правило, должны быть широких масштабах более высокое разрешение, чтобы соответствовать соответствующие ^1Н изображения.
   4. Оказать F изображения ¹⁹ в искусственных цветах (выбрать другую справочную таблицу, в меню "изображение" в Image J), а затем наложить на соответствующих ^1Н изображений для локализации сигнала.
2. ¹⁹ F Количественное
   1. Выберите ¹⁹ F изображение (величина изображение) с соответствующими клетками и ссылки видимой.
   2. В такой программы, как Image J, рисовать трансформирования в отношении соответствующих клеток, ссылки и области вне субъекта (шума).
   3. Используйте команду Анализа затем измерить (или просто Ctrl + M), чтобы вычислить интенсивность средняя пикселя в этих регионах, а их площадь. Пусть S (ячеек) относятся к средней интенсивности пикселя в ROI по ячейкам. Умножьте это на объем (= площадь х толщина среза) для расчета общего сигнала.
   4. Вычислить SNR, например, используя формулу SNR = 0,65 х S (клеток) / σ, где σ является стандартное отклонение интенсивности пикселей в ROI вне образца, который не содержит какого-либо химического сдвига артефакт (обычно в фоновом воздухе) ^17. Если ОСШ до 5 лет, коррекция для сигнала из-за шума может быть необходимым и может быть осуществлена, как описано в другом месте ^{11 10.}
   5. В противном случае, рассчитать общую сумму ¹⁹ F, ответственного за сигналом в ROI через ссылкой путем умножения площади ссылке в срезе по толщине среза (для расчета объема) по концентрации ¹⁹ F в ссылке,который, как известно, и предполагается однородным.
   6. Умножение этого значения на общее сигнала в ROI по ячейкам, деленное на общее сигнала по ссылке, чтобы рассчитать количество ¹⁹ F в клетках.
   7. Подсчитать количество клеток путем деления это число на значение для ¹⁹ F / клетка, рассчитанная в разделе 2.

Результаты

Здесь показано типичные результаты для протокола с переносом ¹⁹ F-меченых клеток самонаводящихся к сливной лимфатического узла. Рисунок 2 показывает ¹⁹ F ЯМР-спектр 10 ⁶ меченых клеток с использованием опорного TFA. Установка изображений проводили, как описано в протоколе (рис. 3). Для естественных изображений, мы использовали ссылку, состоящий из герметичного цилиндра того же этикетке используемого для клеток, расположенных между ног мыши. Пред...

Обсуждение

Протокол изложил здесь описывается общий порядок в естественных условиях ¹⁹ отслеживания F МРТ клеток. Несмотря описанного способа совместной инкубации, существует несколько различных протоколов для мечения клеток с ¹⁹ F агента. Тем не менее, совместной инкубации наиболее часто используется и можно дополнительно оптимизировать, например, добавлением агентов трансфекции ^6. Фактическое протокол мечения клеток будет зависеть от типа клеток. Только ключевые шаги маркировки ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Кетамин (Кетавет)	Pfizer	778-551
Ксилазин (Ромпун)	Bayer	QN05 cm92
Офтосан	Produlab Pharma	2702	глазная мазь
Название материала
МРТ-сканер	Bruker Biospec
ЯМР-спектрометр	Bruker Biospec