Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ in vitro для оценки влияния иммунорегуляторных Пути на ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток эффекторной функцией

13.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50821

⸱

15 октября 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали анализ в пробирке, чтобы исследовать роль иммунорегуляторных путей в регуляции секреции цитокинов ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток.

Аннотация

Т-клеток истощение является основным фактором в неудачной возбудителя оформления во время хронических вирусных инфекций. Иммунорегуляторных пути, такие как PD-1 и IL-10, которые активируется после этого постоянного воздействия антигена и способствуют потере пролиферации, снижение цитолитического функции, и нарушение продукции цитокинов CD4 и CD8 Т-клеток. В мышиной модели инфекции LCMV, введение блокирующих антител против этих двух путей дополненной Т-клеточные реакции. Тем не менее, в настоящее время нет анализа в пробирке, чтобы измерить влияние такой блокады на секрецию цитокинов в клетках из образцов человека. Наш протокол и экспериментальный подход дает нам возможность точно и эффективно количественно восстановление продукции цитокинов по ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток из ВИЧ-инфицированных субъектов.

Здесь мы изображают экспериментальный дизайн в пробирке, который позволяет измерять секреции цитокинов ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток и их влияние на другой челл подмножеств. CD8 T-клетки истощались из цельной крови и остальные РВМС выделяли с помощью метода разделения Ficoll. CD8 обедненного РВМС затем инкубировали с блокирующие антитела против PD-L1 и / или IL-10Rα и, после стимуляции ВИЧ-1 Gag пула пептидов, клетки инкубировали при 37 ° С, 5% СО 2. После 48 часов, супернатант собирали для анализа цитокинов бисера массивы и клеточные осадки собирали для любого фенотипического анализа с помощью проточной цитометрии или транскрипционный анализ с использованием Qrt-PCR. Для более детального анализа, различные клеточные популяции были получены путем селективного истощения подмножества из МНПК или путем сортировки с использованием проточной цитометрии, прежде чем оценивать в тех же анализов. Эти методы обеспечивают высокую чувствительность и специфичность подход для определения модуляцию продукции цитокинов на антиген-специфических Т-хелперов и для определения функциональных взаимодействий между различными популяций иммунных клеток.

Введение

Во стойких вирусных инфекций, вирусов конкретных-Т-клетки приобретают функциональные дефекты в процессе, известном как Т-клеток истощения. В начале естественных условиях исследования в мышиной LCMV модели хроническим вирусным инфекции установлено, что измученные вирус-специфических Т-клеток сократили цитолитическую функцию против инфицированных вирусом клеток, теряют способность к пролиферации и сократили способность производить цитокины, такие как IL-2, TNF- α и ИФН-γ 1,2. Сложная сеть иммунорегуляторных путей, таких как PD-1 и IL-10, которые активируется во время хронических инфекций и способствуют T дисфункции клеток (обзор в 3,4). В естественных введения блокирующих антител против этих ингибирующих путей в LCMV мыши модель восстановлен функцию истощенных вирус-специфических Т-клеток и повышенную вирусной зазор, указывая, что истощение Т-клеток представляет собой частично обратимый феномен (обзор в 5).

Выводы по гоэ LCMV модель быстро распространяется на человека хронических вирусных инфекций, таких как ВГВ, ВГС и ВИЧ 5. При хроническом инфекции ВИЧ-1, ПД-1 и IL-10 Тропы активируется в инфицированных субъектов и коррелируют с параметрами прогрессирования заболевания, непосредственно с вирусной нагрузки и обратно с CD4, 6-8. Антитело блокада PD-1 или IL-10 пролиферации путей в пробирке восстановлен ВИЧ-специфических CD4 и CD8 Т-клеток, указывающих, что, подобно модели LCMV мыши, истощение Т-клеток у человека является частично обратимым явлением. Однако, в связи с деликатным характером экспериментов на образцах человека, а также ограничений в чувствительности анализов в лабораторных условиях, тщательного расследования функциональных профилей реставрационных достичь за счет этих мер поразительно отсутствует. Пролиферации анализы были, до сих пор, единственным надежным анализа в пробирке испытания в большинстве исследований, но есть замечательный отсутствие доказательств о влиянии этих Интерконвенций на: 1) убийство мощностью цитотоксических Т-клеток, 2) противовирусное действие Т-клеток на вирусную репликацию, 3) профиль секреции цитокинов и 4) воздействие на CD4 Т-клеток на других подмножеств клеток.

Внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS) является очень полезным и широко используется проточной цитометрии на основе анализа, который используется для обнаружения продукцию цитокинов в клетках различных типов в обоих мышей и человека. Кроме того, было исследовано влияние антител блокады ингибирующих путей. В ICS анализов, секрецию цитокинов блокируется путем добавления брефельдин и / или монензин. Цитокины ловушке внутри клеток затем обнаружены с флуоресцентными антителами на полихроматическое проточной цитометрии. Продолжительность анализа обычно ограничивается 6 или 12 ч после антигенной стимуляции, так как оба брефелдин и Монензин, который обычно добавляют в течение 2 часов антиген того, являются токсичными к клеткам. ICS анализ является мощная техника, которая была полезна ян исследование влияния в естественных условиях введения блокировки вмешательства антител у мышей, где клетки были извлечены после определенного периода времени после воздействия антител 9. Тем не менее, есть несколько ограничений для применения этого экспериментального подхода для оценки влияния блокады ингибирующих рецепторов в образцах человека. При выполнении антител вмешательства ингибирующих путей в час стимуляции 6 или 12 в пробирке (обычно в случае с образцами человека), блокада ингибирующих рецепторы в большинстве случаев не изменяет частоту реагирования антиген-специфические Т-клетки, как измерить стандартными ICS анализов 6, 7. Измерения продукции в ячейке цитокинов по результатам теста средней или средней интенсивности флуоресценции дали противоречивые результаты 6, 7, 10. С другой стороны, когда ICS проводят при поздно момент времени после стимуляции (то есть шесть дней), изменения количества цитокинов, секретирующих слоктей можно наблюдать. Различия Совокупный эффект измененного пролиферации, выживания, и изменения в эффекторной функции, которые накапливаются в течение определенного периода времени 6. Один из способов частично преодолеть эти ограничения, чтобы инкубировать в течение более длительных периодов времени (например, 36 ч, 60 ч, и т.д..) С антигеном перед добавлением секреции цитокинов блокатор, не дожидаясь распространение произойти. Мы успешно использовали этот метод для определения кинетики секреции цитокинов ВИЧ-специфических CD4 и CD8 Т-клеток 11,12, однако, такой подход не в состоянии обнаружить небольшие ответов и не даст комплексный результат общая секреция цитокинов происходит так стимуляции. Таким образом, ICS не достаточно чувствительный метод для обнаружения воздействия блокады ингибирующих путей на количество цитокинов, продуцируемых активированными Т-клетками по сравнению с мРНК цитокинов количественного измерения или секреции цитокинов в supernatanт в тех же точках времени. Кроме того, большинство из цитокинов, продуцируемых активированными Т-клетками действовать в аутокринного моды, внося вклад в положительный или отрицательный обратной связи через взаимодействие с антиген-представляющих клеток. Таким образом, добавление брефельдин или монензин в ICS тесте предотвращает секрецию цитокинов и, таким образом, стимуляция Т-клеток не является оптимальным. Наконец, обнаружение нескольких цитокинов с ICS ограничена доступностью и чувствительностью антител для детекции цитокинов с проточной цитометрии, а также из-за ограниченности в количестве флуорохромов, которые могут быть использованы одновременно в любом данном панели.

Мы разработали высокочувствительный в пробирке экспериментальный подход для оценки воздействия иммунорегуляторных путей в регуляции секреции цитокинов ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток, а затем CD4 помощь антиген представляющих клеток (АПК) и естественных клеток-киллеров (NK-клетки). Этот метод также может быть использован для оценки ИТПМКТ блокады ингибирующих молекул на функции CD8 Т-клеток, разрушая лимфоциты CD4 от МНПК или путем стимулирования с оптимальными пептидов, которые признаны только CD8 Т-клеток. В отличие от внутриклеточного окрашивания цитокинов анализов, мы решили, чтобы не мешать секреции цитокинов ВИЧ-специфических Т-клеток CD4 для того, чтобы иметь возможность: 1) выполнить более точное количественное определение уровней цитокинов, производимых; 2) исследовать более широкий панель цитокинов или эффекторных молекул, и 3) оценить влияние цитокинов, произведенных ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток на других подмножеств клеток. Мы стимулируют CD8 истощенных РВМС с ВИЧ-1 Gag пула пептидов в присутствии блокирующих антител для иммунорегуляторного пути интереса. По истечении заданного времени инкубации, обычно 48 часов, мы собираем супернатанты для измерения секрецию цитокинов с массивами бортовых и собирать ячейки гранул либо для фенотипического анализа различных подмножеств клеток или для транскрипции анализа. Следует отметить, что при Тего 48 раз час точка, мы не обнаружить значительное население пролиферирующих Т-клеток 12. Это гибкий подход и несколько адаптации этой конструкции могут быть применены для решения различных гипотез. Например, отдельные подмножества клеток (например, ВИЧ-специфических Т-клеток CD4 или PD-1 высоких CD4 Т-клеток и т.д.). Могут быть отсортированы после 12 ч инкубации до дальнейшей инкубации в течение 36 ч с последующим сбором и супернатантах клеточных осадков исследовать более конкретно воздействие мероприятий блокады на секрецию цитокинов, определенных субпопуляций МНПК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Истощение и Выделение РВМС с помощью Ficoll разъединении

  1. Разрушающим CD8 + Т-клеток путем добавления человека CD8 + Истощения Коктейль на 50 мкл / мл цельной крови.
  2. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре (18-25 ° C).
  3. После инкубации, смешать цельную кровь с HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнка без Ca 2 + или Mg 2 +) и слой над Histopaque. Отжим при 340 RCF в течение 30 мин (без тормоза, медленно ускорения).
  4. Сбор МНПК и переход к новой 50 мл конической. Wash 2x с 45 мл RPMI 1640, дополненной 50 МЕ пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 1% HEPES вращением в течение 10 мин при 340 RCF.

2. Блокада антител и антиген-специфические стимуляции клеток

  1. Ресуспендируют клеток в 2x10 6 в состоянии в среде RPMI 1640, содержащей 10% человеческой сыворотки, дополненной 50 МЕ пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 1% Hepes,что составляет 500 мкл на каждое условие.
  2. Аликвоты 500 мкл клеточной суспензии в FACS трубы.
  3. В зависимости от пути исследуемого добавить PD-L1, IL-10Rα блокирующие антитела и / или управления изотипа при 10 мкг / мл и инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
  4. Стимулируют клетки с пула пептидов ВИЧ-1 Gag при 1 мкг / мл / до конечной концентрации пептида. Кроме того, включать контроль "никакое стимулирование" для каждого блокирующего состоянии. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 48 часов.

3. Сбор и анализ супернатанта

  1. Через 48 ч спин вниз FACS труб в течение 7 минут при 340 RCF.
  2. Осторожно собрать 2 х 225 мкл супернатанта в Эппендорф труб для Luminex массивов бортов, не нарушая гранул.
  3. Деактивировать вирус в собранном супернатанта с 25 мкл 0,5% PBS-Tween, чтобы получить конечную концентрацию 0,05% PBS-Tween.
  4. Хранить собранные супернатанты, которые не IMMEDiately используется в -80 ° C морозильник.
  5. Измерьте желаемых концентраций цитокинов, используя Millipore Luminex комплект в соответствии с протоколом производителя.

4. Сбор и Фенотипическая Анализ клеток с помощью проточной цитометрии

  1. После сбора супернатанта, мыть клетки в 3 мл PBS. Спин клетки в течение 7 минут при 340 RCF и сцеживать излишки стирки.
  2. Пятно на жизнеспособность с реального / DEAD поправимо Dead Kit сотовый Stain в соответствии с протоколом производителя.
  3. Промыть клеток в PBS в течение 7 мин при 340 RCF и при 4 ° С. Ресуспендируют в 100 мкл PBS 1% FBS.
  4. Если окрашивания для моноцитов и других антиген представляющих клеток, блок Fc рецепторов, добавив 1,4 мкл FcR блокирования реагент и вихрь смешивать.
  5. Инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С.
  6. Добавить поверхностные антитела, вихрь, и инкубируют в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
  7. Вымойте клеток с PBS 1% FBS, сцеживать излишки мыть, и добавить 200 мкл 4% параформальдегида. Высиживатьпри комнатной температуре в течение 20 мин в темноте.
  8. Вымойте клеток с PBS 1% FBS, ресуспендируют в 250 мкл PBS 1% FBS, и приобрести на multilaser проточного цитометра (например BD LSRII или Fortessa).

5. Анализ клеток через Qrt-PCR

  1. Для клеток, не анализировали с помощью проточной цитометрии: после сбора супернатанта, лизируют клетки в 300 мкл буфера RLT Qiagen, содержащем 1% бета-меркаптоэтанол. Если не продолжается с протоколом, клетки могут быть заморожены при -80 ° С после этого момента.
  2. Изолировать РНК с использованием набора для выделения РНК в соответствии с протоколом производителя.
  3. Синтеза кДНК из РНК с использованием набора для синтеза кДНК в соответствии с протоколом производителя.
  4. Выполните количественный ПЦР с использованием SYBR Green технологии.
  5. Создание смесь праймеров для каждого праймера, используемого в том числе генов домашнего хозяйства (например, IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) путем добавления праймеров для нуклеазы без воды с получением конечной концентрации 10мкМ. Держите на льду.
  6. Создайте основной смеси для каждого праймера, добавив 10,5 мкл нуклеазы без воды, 12,5 мкл SYBR зеленый, и 1 мкл праймера смесь по тарелке хорошо. Держите на льду.
  7. Пипетка 24 мкл Master Mix в каждую лунку планшета, который будет использоваться.
  8. Добавить 1 мкл кДНК в каждую лунку в соответствии с шаблоном.
  9. Закройте скважин и центрифуги пластину в течение 3 мин при 800 RCF.
  10. Запустите пластину на машине Qrt-PCR, например приборной Stratagene MX3005P.

6. Адаптация для внутриклеточного окрашивание цитокинов в 48 часов

Добавить брефельдин и монензин 6 ч до внутриклеточного окрашивания цитокинов. Брефелдин добавляется в концентрации 10 мкг / мл в то время как Монензин добавляется в соответствии с инструкциями изготовителя. Для удобства брефелдин могут быть добавлены 12 ч до окрасить в концентрации 5 мкг / мл.

  1. После поверхностного пятна, мыть клетки с PBS 1% FBS и пятна на ввнеклеточного цитокины, такие как IL-12, IFN-γ и TNF-α с использованием набора Фиксация / Пермеабилизации решения и протокол.
  2. Вымойте клетки, ресуспендируют в 250 мкл PBS 1% FBS, и работать на multilaser проточного цитометра (например BD ЛСР II или Fortessa).

7. Адаптация для сортировки клеток

  1. 16 ч после стимуляции, пятно для жизнеспособности с помощью LIVE / DEAD поправимо Dead Kit сотовый Stain в соответствии с протоколом производителя. Держите клетки на льду во время всей процедуры.
  2. Промыть клетки с PBS в течение 7 мин при 340 RCF и при 4 ° С. Ресуспендируют в 100 мкл PBS 1% FBS.
  3. Добавить поверхностные антитела, вихрь смешивать, и инкубировать клетки на льду в темноте в течение 20 мин.
  4. Промыть клетки с PBS 1% FBS при 340 RCF и при 4 ° С и ресуспендируют в 500 мкл холодной RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, дополненной 50 МЕ пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 1% HEPES.
  5. Фильтровать клетки с использованием 5 мл PolystyРене круглым дном трубки с Cell-Пробка фильтра.
  6. Подготовка трубы для сбора рода путем добавления 200 мкл RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, дополненной 50 МЕ пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 1% HEPES в каждую пробирку. Храните все пробирки на лед во время сортировки.
  7. Онлайн сортировать клетки подмножества процентов по инструмент (например, BD FACS Aria II), расположенный в учреждении, оборудованном для биологически опасными материалами.
  8. После клетки были отсортированы, место клетки обратно в инкубатор для нужное количество времени и последующих с анализом коллекция супернатант / Luminex и анализа коллекция осадок клеток / ПЦР.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При выполнении измерений цитокинов с помощью этой системы в пробирке, важно, чтобы иметь возможность различать антиген-специфические реакции по сравнению с без контроля стимуляции. В общем, мы рассмотрели положительные отзывы как любых значениях антигенной стимуляции, которые дают по крайней мере три-кратное увеличение уровней цитокинов по сравнению с без контроля и которые стимуляции были в пределах линейного диапазона анализа. Мы используем высокую чувствительность шарик массива анализов, которые могут обнару...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Коллекция Супернатант является императивом частью этого эксперимента. При заготовке супернатантов для анализа Luminex аликвоты были сделаны и выдерживают при -80 ° С, чтобы предотвратить деградацию белков из-за циклов замерзания-оттаивания. Замораживания и оттаивания могут быть резкие процессы для белков, и за счет минимизации Freeze-оттепели, сигнал будет максимальным в анализах. Таким образом, это легче получить воспроизводимую и более точные данные при работе с аликвоты, которые были вымораживанием размороженных один...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Мы благодарим Гордона Фримена для обеспечения блокирующей антитела против PD-L1. Мы благодарим клиническое и лабораторное персонал на Массачусетского общего госпиталя и всех участников исследования за их неоценимую роль в этом проекте.

Работа выполнена при поддержке Национального института аллергии и инфекционных заболеваний Национального института здоровья (PO1 АИ-080192; ДЭК), Национальный легочное сердце и крови Института Национальных Институтов Здоровья (РВЫХ1 HL-092565; ДЭК). ДЭК поддерживается исследовательский Scholar Карьера премии Фонда исследований в области здравоохранения Квебека (FRQS). FP поддерживается стипендий гранта Massachusetts General Hospital Исполнительного комитета по научным исследованиям и Гарвардской Глобального института здравоохранения (HGHI).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ или Mg2+SigmaH9394
RPMI 1640SigmaR0883
Histopaque-1077Sigma10771
Сыворотка крови человека ABGemini BioProducts100-512
Пенициллин/стрептомицинMediatech30 001 CI
L-глутаминMediatech25 005 CI
HEPES буферMediatech25060CI
FcR блокирующий реагент, человеческийMiltenyi130-059-901
RosetteSep Коктейль CD8+ Истощение крови человека 15663
LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания мертвых клеток, для возбуждения ультрафиолетаInvitrogenL23105
Rneasy Mini KitQiagen74104
Improm-II Система обратной транскрипцииPromegaA3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master MixAgilent600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permabiliization Solution KitBD554714
Tween-20FisherBP337100
IFN-γ праймерInvitrogenДЛЯ: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH праймерInvitrogenДЛЯ: TCATCATCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG

Ссылки

  1. Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
  2. Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
  3. Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
  4. Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
  5. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
  6. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
  7. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
  8. Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
  9. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  10. Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
  11. Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
  12. Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
  13. Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD4PD 1IL 10RFicollLuminex bead arrayqRT PCRGag
Анализ in vitro для оценки влияния иммунорегуляторных Пути на ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток эффекторной функцией
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.