Мы опишем метод достижения эффективной иммобилизации БМП-2 на поверхностях. Наш подход основан на формировании самостоятельного монослоем, чтобы достичь ковалентное связывание BMP-2 при помощи своих свободных остатков аминосоединений. Этот метод является полезным инструментом для изучения сигналов на клеточной мембране.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ковалентного связывания БМП-2 на поверхностях Использование самоорганизующихся монослоя подход
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Костного морфогенетического белка 2 (BMP-2) является фактором роста встроен в внеклеточного матрикса костной ткани. БМП-2 действует как триггер мезенхимальных дифференцировки клеток в остеобласты, стимулируя тем самым заживление и образование De Novo кости. Клиническое использование рекомбинантного человеческого БМП-2 (rhBMP-2) в сочетании с лесов вызвало недавние споры, в зависимости от режима представления и количество должны быть доставлены. Протокол, представленные здесь обеспечивает простой и эффективный способ доставки БМП-2 для исследований в пробирке на клетки. Мы опишем, как сформировать самоорганизующуюся монослой, состоящий из гетеробифункциональным линкера, и перейти на следующий обязательный шаг для получения ковалентной иммобилизации rhBMP-2. При таком подходе можно достичь устойчивого представление BMP-2 при сохранении биологической активности белка. В самом деле, поверхность иммобилизации BMP-2 позволяет целевых исследований по предотвращению неспецифических объявленияorption, в то время как уменьшение количества фактора роста и, прежде всего, препятствуя неконтролируемый выброс с поверхности. Оба краткосрочные и долгосрочные мероприятия сигнализацию, БМП-2 происходят, когда клетки подвергаются воздействию поверхностей, представляющих ковалентно иммобилизованного rhBMP-2, что делает этот подход подходит для исследований в пробирке на клеточный ответ на БМП-2 стимуляции.
Введение
Кость морфогенетический белок 2 (БМП-2) является членом трансформирующий фактор роста (TGF-β) семьи и действует как индуктор образования процессов нового костного а также регулятора нескольких тканей во время эмбрионального развития и взрослого гомеостаза 1-3. Каждый мономер биологически активного гомодимерной БМП-2 белка содержит "цистеин узел" мотив, который высоко сохраняется во всех БМП 4. Шесть из семи остатков цистеина образуют внутримолекулярные дисульфидные связи, которые стабилизируют каждого мономера, тогда как седьмой цистеин участвует в димеризации, образуя межмолекулярное соединение между двух мономеров 5,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Синтез 11-Mercaptoundecanoyl-N-гидроксисукцинимида (NHS-MU)
- Добавляют по каплям раствор 500 мг N-гидроксисукцинимида и 30 мг 4 - (диметиламино) пиридина в 10 мл ацетона (PA) до 1 г 11-mercaptoundecanoic кислоты в 40 мл дихлорметана (Па) при комнатной температуре (RT).
- Реакционную смесь охлаждают до 0 ° С и добавляют по каплям 1,1 г N, N '-дициклогексилкарбодиимид в 10 мл дихлорметана (в атмосфере азота). Хранить реакцию при низкой температуре в течение 1 часа и затем перемешивали при КТ в течение ночи.
- Отфильтровывают осадок и высушить при пониженном давлении. Очищают продукт флэш-хроматографией с петро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В нашей установке, золото был выбран в качестве наполнителя, так как это относится к биологически неспецифическую но химически перестраиваемый систему. Кроме того, применение самоорганизующихся монослоев влечет за собой множество преимуществ: ЗРК спонтанно адсорбировать через их «штаб-групп" на металлы и форм монослоев с нескольких дефектов, в то время как их функциональные концевые группы может быть изменен. Таким образом они создают платформу адаптировать свойства интерфейса в контролируемой, но очень адаптации образо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе мы описывают получение поверхностей с функционализированных биоактивного rhBMP-2. Этот подход включает в себя два этапа: 1) начальное формирование самостоятельной сборки монослоя (SAM) бифункционального линкера на поверхности золота, 2) ковалентной иммобилизации белка rhBMP-2. В предыдущей работе, мы подтверждено эффективное связывание бифункционального линкера и фактора роста, и показали, что поверхность с иммобилизованным rhBMP-2 сохраняет свою биологическую активность 19. Биологическая акт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим профессора JP Spatz (Департамент биофизической химии, Университет Гейдельберга и Департамент новых материалов и биосистем, Института Макса Планка по интеллектуальным системам, Stuttgart) за его любезное поддержки. Финансовая поддержка от Макса Планка-Gesellschaft и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 для ВАС-А.), Также значительно признал.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| N-гидроксисукцинимид | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(диметиламино)пиридин | Сигма-Олдрич | 522805 | |
| Ацетон | AppliChem | A2282 | |
| 11-меркаптундекановая кислота | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Дихлорметан | Merck | 106050 | |
| N,N'-дициклогексилкарбодиимид | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Бензол нефтяной | Merck | ||
| Стеклянные покровные стекла | Carl Roth | M 875 | |
| Этилацетат | AppliChem | A3550 | |
| Метанол | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-диметилформамид | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | НИР D Systems | 355-BM | Без носителей; выражено в E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Карл Рот | HN00.2 | |
| Поли(диметилсилоксан) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 комплект силиконовых эластомеров | Dow Corning | ||
| Анти-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Козий антимышиный IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Вторичное антитело |
| Амплифлю Красный анализ | Sigma | 90101 | |
| Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) (1x), жидкая | Gibco | 41966 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота с высоким содержанием глюкозы (FBS) | Sigma | F7524 | Стерильная фильтрованная, проверенная на клеточной культуре |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Трипсин 0,05% (1x) с ЭДТА 4Na | Gibco | 25300 | |
| Глицин (0,1 М) | Riedel-de Haë N | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Лизисный буфер (анализ ЩФ)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Хлорид цинка (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| -нитрофенилфосфат (pNPP) | Sigma | S0942 | Фосфатазный субстрат |
| Анти-мизин тяжелая цепь (MHC) | Исследования развития Hybridoma Bank, Университет Айовы | MF20 | Моноклональное антитело |
| Alexa Fluor 488 Козий антимышиный IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Оборудование | |||
| Ванна Ultrsonic (Sonorex Super RK 102H), частота 35 кГц | BANDELIN electronic GmbH Co. KG | ||
| MED 020 Система напыления | BAL-TEC AG | Условия нанесения покрытия<чел/> Кр: 120 мА, 1,3 x 10<суп>-2 мбар, 30 сек<бр/> Au: 60 мА, 5,0 x 10<суп>-2 мбар, 45 сек | |
| Считыватель пластин Tecan Infinite M200 Tecan |
Ссылки
- Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9(2002).
- Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
