Методическая статья

Ковалентного связывания БМП-2 на поверхностях Использование самоорганизующихся монослоя подход

DOI:

10.3791/50842

⸱

26 августа 2013 г.

 ,  , 
1Department of Biophysical Chemistry, Institute for Physical Chemistry, University of Heidelberg, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems at Stuttgart

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы опишем метод достижения эффективной иммобилизации БМП-2 на поверхностях. Наш подход основан на формировании самостоятельного монослоем, чтобы достичь ковалентное связывание BMP-2 при помощи своих свободных остатков аминосоединений. Этот метод является полезным инструментом для изучения сигналов на клеточной мембране.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Костного морфогенетического белка 2 (BMP-2) является фактором роста встроен в внеклеточного матрикса костной ткани. БМП-2 действует как триггер мезенхимальных дифференцировки клеток в остеобласты, стимулируя тем самым заживление и образование De Novo кости. Клиническое использование рекомбинантного человеческого БМП-2 (rhBMP-2) в сочетании с лесов вызвало недавние споры, в зависимости от режима представления и количество должны быть доставлены. Протокол, представленные здесь обеспечивает простой и эффективный способ доставки БМП-2 для исследований в пробирке на клетки. Мы опишем, как сформировать самоорганизующуюся монослой, состоящий из гетеробифункциональным линкера, и перейти на следующий обязательный шаг для получения ковалентной иммобилизации rhBMP-2. При таком подходе можно достичь устойчивого представление BMP-2 при сохранении биологической активности белка. В самом деле, поверхность иммобилизации BMP-2 позволяет целевых исследований по предотвращению неспецифических объявленияorption, в то время как уменьшение количества фактора роста и, прежде всего, препятствуя неконтролируемый выброс с поверхности. Оба краткосрочные и долгосрочные мероприятия сигнализацию, БМП-2 происходят, когда клетки подвергаются воздействию поверхностей, представляющих ковалентно иммобилизованного rhBMP-2, что делает этот подход подходит для исследований в пробирке на клеточный ответ на БМП-2 стимуляции.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кость морфогенетический белок 2 (БМП-2) является членом трансформирующий фактор роста (TGF-β) семьи и действует как индуктор образования процессов нового костного а также регулятора нескольких тканей во время эмбрионального развития и взрослого гомеостаза 1-3. Каждый мономер биологически активного гомодимерной БМП-2 белка содержит "цистеин узел" мотив, который высоко сохраняется во всех БМП 4. Шесть из семи остатков цистеина образуют внутримолекулярные дисульфидные связи, которые стабилизируют каждого мономера, тогда как седьмой цистеин участвует в димеризации, образуя межмолекулярное соединение между двух мономеров 5,6. Это высоко консервативны цистеин узел определяет трехмерную структуру белка BMP-2 и определяет его уникальные свойства, такие как устойчивость к высокой температуре, и денатурирующих кислом рН 7-9. BMP-2 связывается с серин / треонин киназа трансмембранных рецепторов, тем самым вызывая сигнальную трансдукцию 10-12. В зависимости от способа олигомеризации рецепторов, различные сигнальные пути активируются: Smad-независимый сигнальный каскад приводит к щелочной фосфатазы индукции через р38 сигналов, в то время как Smad-зависимый путь активации результатов фосфорилирование рецептора в Smad сложной ядерной транслокации и активации транскрипции специфических генов-мишеней, таких как ингибитор дифференцировки (Id) 12-14.

В кости, БМП-2 индуцирует дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты, таким образом стимулируя заживление и De Novo формирование кости. В настоящее время, рекомбинантно экспрессировали BMP-2 применяется в клинике для повышения заживление трещиноватых сайтов. Общая стратегия в инженерии костной ткани является использование инъекций факторы роста, что является менее инвазивным по сравнению с местными систем доставки. Тем не менее, естественных условиях исследования в и клинические применения показали, что короткие биологического полураспада, неспецифическая осанонимизации и быстрый локальный оформление БМП-2 может привести к несколько местных, внематочной и системных проблем 15. Следовательно, чтобы получить эффективное представление, на захват или иммобилизацию BMP-2 в или на материалах необходимо для его местной и длительной доставки в сайте-мишени. Длительной доставки может быть достигнуто с нековалентных подходы удержания, такие как физический захват, адсорбции или ионного комплексообразования 16. Тем не менее, известно, что неспецифическое адсорбции протеинов на поверхности могут приводит к денатурации молекулы 17. Для ковалентного связывания факторов роста, различные типы опор были разработаны в течение последнего десятилетия. Использование бифункциональных молекул связующих, которые нацелены на аминокислоты или карбоксильные группы белка, например, является одним из видов подхода, который не обязательно требует модификации белка для достижения своей иммобилизации. В самом деле, в то время как модификация белок имеет то преимущество управлени ориентацией белка,введение искусственных пептидных областей, теги и сайт-специфических цепей может изменить биологическую активность факторов роста 17. Таким образом, чтобы обойти денатурации за счет взаимодействия с опорной материала, поверхности могут быть функциональными заранее, например, с самоорганизующейся монослоя (SAM) молекулы ссылки, за которой следует соединение требуемого коэффициента 18. Мы использовали подход SAM на основе ковалентно иммобилизации БМП-2 на поверхность путем охвата свои свободные остатки аминов и показали, что иммобилизованные белок сохраняет как свою краткосрочные и долгосрочные биологическую активность 19. Этот протокол обеспечивает простой и эффективный способ доставки BMP-2 в клетках для исследований в пробирке о механизмах, которые происходят на клеточной мембране и регулируют внутриклеточную передачу сигнала, ответственного за остеогенной сигнализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Синтез 11-Mercaptoundecanoyl-N-гидроксисукцинимида (NHS-MU)

  1. Добавляют по каплям раствор 500 мг N-гидроксисукцинимида и 30 мг 4 - (диметиламино) пиридина в 10 мл ацетона (PA) до 1 г 11-mercaptoundecanoic кислоты в 40 мл дихлорметана (Па) при комнатной температуре (RT).
  2. Реакционную смесь охлаждают до 0 ° С и добавляют по каплям 1,1 г N, N '-дициклогексилкарбодиимид в 10 мл дихлорметана (в атмосфере азота). Хранить реакцию при низкой температуре в течение 1 часа и затем перемешивали при КТ в течение ночи.
  3. Отфильтровывают осадок и высушить при пониженном давлении. Очищают продукт флэш-хроматографией с петролейным бензола и этилацетата (ПА) в соотношении 1:1.

2. Подготовка однородных слоев золота

  1. Чистые покровные стекла с точностью салфеток и обрабатывают ультразвуком их в течение 5 мин в растворе, содержащем смесь 1:1 этилацетата (ПА) и метанол (PA). Rinsе подложки с метанолом и высушить в токе азота.
  2. Поместите чистые субстраты в устройстве покрыти распылением. Вакуумировать камеру. Извлеките верхний слой оксида хрома от цели хрома путем распыления в течение 60 сек. Поместите образцы под металлической балки и пальто их с хромом слой 10 нм, с последующим покрытием слоем золота 40 нм.

3. Поверхность Иммобилизация БМП-2

  1. Растворить MU-NHS в N, N-dimethlyformamide (ДМФ) до конечной концентрации приблизительно 1 мМ и инкубируют золотых подложек в растворе MU-NHS при комнатной температуре в течение 4 часов в атмосфере азота.
  2. Разрушать ультразвуком поверхности в DMF в течение 2 мин, смойте DMF и метанола и высушить в токе азота.
  3. Подготовка исходного раствора rhBMP-2 в стерильной 4 мМ HCl с концентрацией 100 мкг / мл (магазин аликвотах при -80 ° С). Для рабочих разведений (3,5 мкг / мл), разбавляют маточного раствора в PBS / NaCl (PBS, содержащим 1 М NaCl) иdjust до рН 8,5 непосредственно перед использованием.
  4. Инкубировать поверхности функционализированные MU-NHS в рабочем растворе rhBMP-2 при 4 ° С в течение ночи. Удалить инкубационный супернатант. Соникатные поверхности в PBS / NaCl в течение 2 мин и промыть 3 раза стерильной PBS / NaCl.

4. Поверхность Характеристика

  1. Чтобы блокировать неспецифическую адсорбцию антител, инкубировать поверхности с 5% BSA (вес / объем) в PBS растворе в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим инкубированием с анти-BMP-2 антитела (1:100 в 1% (вес / объем ) раствор BSA / PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыть поверхности дважды PBS и ультразвуком в течение 30 сек.
  2. Инкубировать субстраты с HRP-конъюгированного вторичного антитела (1:1000 в 1% (вес / объем) раствора BSA / PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем дважды промывали PBS.
  3. Используйте Ampliflu Red анализа для измерения ферментативной активности HRP при 570 нм с ридере.

5. Анализ биологической активности

  1. Семенной 1 х 10 5 мыши C2C12 миобласты на лунку в 6-и плТочные в ростовой среде, состоящие из DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей пируват с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и инкубируют их в течение 24 часов при 37 ° C / 5% CO 2.
  2. Голодать клетки в бессывороточной DMEM в течение 3-5 часов перед посевом на поверхностях, украшенный иммобилизованным БМП-2.
  3. Для исследования краткосрочного индукции сигнализации, замените носитель на 200 мкл свежей сыворотки DMEM и поместите иммобилизованные БМП-2 поверхности выше клеток. Поверхность должна быть обработаны с тонким наконечником пинцетом, чтобы не поцарапать.
  4. Удалить мягко поверхностей и аспирации среды с помощью пипетки, промыть клетки дважды PBS. Перейдите к анализу клеточных ответов.
  5. Для анализа долгосрочного биологической активности, пластинчатых клеток на поверхности и культура их при 37 ° C / 5% CO 2 в условиях низкой сыворотки (2% FBS) в течение шести дней.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нашей установке, золото был выбран в качестве наполнителя, так как это относится к биологически неспецифическую но химически перестраиваемый систему. Кроме того, применение самоорганизующихся монослоев влечет за собой множество преимуществ: ЗРК спонтанно адсорбировать через их «штаб-групп" на металлы и форм монослоев с нескольких дефектов, в то время как их функциональные концевые группы может быть изменен. Таким образом они создают платформу адаптировать свойства интерфейса в контролируемой, но очень адаптации образо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы описывают получение поверхностей с функционализированных биоактивного rhBMP-2. Этот подход включает в себя два этапа: 1) начальное формирование самостоятельной сборки монослоя (SAM) бифункционального линкера на поверхности золота, 2) ковалентной иммобилизации белка rhBMP-2. В предыдущей работе, мы подтверждено эффективное связывание бифункционального линкера и фактора роста, и показали, что поверхность с иммобилизованным rhBMP-2 сохраняет свою биологическую активность 19. Биологическая акт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим профессора JP Spatz (Департамент биофизической химии, Университет Гейдельберга и Департамент новых материалов и биосистем, Института Макса Планка по интеллектуальным системам, Stuttgart) за его любезное поддержки. Финансовая поддержка от Макса Планка-Gesellschaft и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 для ВАС-А.), Также значительно признал.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
N-гидроксисукцинимидSigma-Aldrich130672 
4-(диметиламино)пиридинСигма-Олдрич522805 
АцетонAppliChemA2282 
11-меркаптундекановая кислотаSigma-Aldrich674427 
ДихлорметанMerck106050 
N,N'-дициклогексилкарбодиимидSigma-AldrichD80002 
Бензол нефтянойMerck 
Стеклянные покровные стеклаCarl RothM 875 
ЭтилацетатAppliChemA3550 
МетанолCarl Roth4627 
N,N-диметилформамидCarl RothT921 
rhBMP-2НИР D Systems355-BMБез носителей; выражено в E.coli
PBSPAAH15-002 
NaClКарл РотHN00.2 
Поли(диметилсилоксан) (PDMS)Dow Corning 
Sylgard 184 комплект силиконовых эластомеровDow Corning 
Анти-rhBMP-2SigmaB9553 
Козий антимышиный IgG-HRPSanta Cruzsc-2005Вторичное антитело
Амплифлю Красный анализSigma90101 
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) (1x), жидкаяGibco41966
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота с высоким содержанием глюкозы (FBS)SigmaF7524Стерильная фильтрованная, проверенная на клеточной культуре
Pen/StrepGibco15140 
Трипсин 0,05% (1x) с ЭДТА 4NaGibco25300 
Глицин (0,1 М)Riedel-de Haë N33226 
IGEPAL CA-630 (1%)SigmaI8896Лизисный буфер (анализ ЩФ)19
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM)Carl RothHNO3.2 
Хлорид цинка (ZnCl2) (1 mM)Carl Roth3533.1 
-нитрофенилфосфат (pNPP)SigmaS0942Фосфатазный субстрат
Анти-мизин тяжелая цепь (MHC)Исследования развития Hybridoma Bank, Университет АйовыMF20Моноклональное антитело
Alexa Fluor 488 Козий антимышиный IgGInvitrogenA11001 
DAPISigmaD9542 
Оборудование
Ванна Ultrsonic (Sonorex Super RK 102H), частота 35 кГцBANDELIN electronic GmbH Co. KG 
MED 020 Система напыленияBAL-TEC AGУсловия нанесения покрытия<чел/> Кр: 120 мА, 1,3 x 10<суп>-2 мбар, 30 сек<бр/> Au: 60 мА, 5,0 x 10<суп>-2 мбар, 45 сек
Считыватель пластин Tecan Infinite M200 Tecan 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9(2002).
  2. Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
  3. Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
  4. Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
  5. Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
  6. Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
  7. Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
  8. Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26(1998).
  9. Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
  10. Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
  11. Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
  12. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
  13. Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
  14. Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  15. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  16. Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
  17. Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
  18. Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
  19. Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
  20. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
  21. Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
  22. Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
  23. Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
  24. Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
  25. Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
  26. Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
  27. Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
  28. Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
  29. Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
  30. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
  31. Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
  32. Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
  33. Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
  34. Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
  35. Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
  36. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  37. Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
  38. Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BMP 2 Covalent BindingSelf assembled MonolayerGold Substrate PreparationM U N H S LinkerBMP 2 ImmobilizationAntibody Binding AssaySMAD 1 5 8 PhosphorylationAlkaline Phosphatase ActivityMyosin Heavy Chain StainingFluorescence Microscopy

Похожие статьи