Методическая статья

Процедуры выявления инфекционных прионов после прохождения через пищеварительный тракт птичьего видов

DOI:

10.3791/50853

⸱

6 ноября 2013 г.

 ,  ,  , 
1Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, USDA

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Падальщики есть потенциал, чтобы перемещать инфекционные инфекционные губчатой ​​энцефалопатии прионы в их фекалиях безрецидивному областях. Мы методов детали, используемые для определения, если мышь-адаптированные скрепи прионы остаются инфекционные после прохождения хотя пищеварительного тракта американских ворон (Corvus brachyrhynchos), общей потребителя мертвых животных.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекционные прионов (PRP Res) материал, скорее всего, причиной смертельных, нейродегенеративных передающегося губчатой ​​энцефалопатии (TSE) заболеваний 1. Передача TSE заболеваний, таких как хроническая изнуряющая болезнь (УХО), как предполагают, от животного к животному 2,3, а также от экологических источников 4-6. Падальщики и плотоядные есть потенциал, чтобы перемещать PrP Res материала через потребление и экскреции УХО загрязненных падалью. Последние работы документально прохождение PrP Res материала через пищеварительную систему американских ворон (Corvus brachyrhynchos), общей североамериканского поглотителя 7.

Мы описываем процедуры, используемые для документирования прохождения PrP Res материала через американские вороны. Вороны были через желудочный зонд с RML-деформированного мыши адаптированных скрепи и их фекалии собирают 4 ч после введения через зонд. Crow фекалии собирают и затем вводили внутрибрюшинно вC57BL / 6 мышей. Мышей контролировали ежедневно, пока они не выразили клинические признаки мыши скрепи и были впоследствии подвергнуты эвтаназии. Бессимптомные мышей не наблюдали до 365 дней после инокуляции. Вестерн-блот анализ был проведен для подтверждения статуса заболевания. Результаты показали, что прионы остаются инфекционные после путешествия через пищеварительную систему ворон и присутствуют в кале, вызывая болезни в тестовых мышей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансмиссивные губчатые энцефалопатии (TSE) смертельные инфекционные нейродегенеративные расстройства, которые влияют на диких животных, домашние животные, и люди. Возбудитель из TSE заболеваний, как представляется, неправильно уложенные или патогенные изоформы (PRP Res) прионных белков 1. Животное TSE заболевания включают хроническое заболевание атрофии (УХО) в оленя мула (Odocoileus hemionus), белохвостый олень (Odocoileus virginianus), лося (Cervus Elaphus) и лося (Alces Alces); скрепи у овец и коз; коровьей губчатой ​​энцефалопатии ( БФБ) в домашнего скота; передающийся норки энцефалопатия в выращиваемых норки; кошачий губчатая энцефалопатия у кошек; экзотические копытных губчатая энцефалопатия в экзотическом зоопарке размышляет семейного парнокопытных и губчатая энцефалопатия в приматов 8. Сингл болезнь человеческого TSE, вариант болезни Крейтцфельда-Якоба, является редким и считается, приобрел, потребляя PrP Res-разлиованные питания 9. Точно так же, BSE может инфицировать людей при загрязнении говядины расходуется 10. Из всех заболеваний TSE, скрепи и УХО являются только два с самостоятельных эпидемий и источников для инфекции, как предполагается, будет от животного к животному 2,3,11, а также от экологических источников 4-6. Исследования показывают, что большинство болезней TSE требуют заметных длительные периоды инкубации от природных явлений облучения PrP Res материала проявления клинических признаков 2-4,6,8 и очевидные видов барьеры минимизировать, но не устраняют потенциал для, передачи межвидовая 12-14 .

Выявление механизмов для распространения инфекционных прионов (PRP Res) материала является чрезвычайно важным для ответов на вопросы о том, как TSE заболевания двигаться по всему ландшафту. Экспериментальные исследования показали, что насекомые 15,16, птицы и свиней 17 и американские вороны (Corvus Брачhyrhynchos) 7,18 являются пассивными носителями или диспергаторы из PrP Res материала. Прохождение PrP Res материала через пищеварительную систему ворон недавно были задокументированы, демонстрируя роль они могут сыграть в разгоне TSE заболеваний 7. Эти результаты дают вероятно, что вороны, мусорщик, может столкнуться, потреблять и транспортировать инфекционного материала с помощью осаждения фекалий, безрецидивному областях.

Процедуры мы демонстрируем здесь были использованы для документирования прохождения PrP Res материала через системы пищеварения ворон и значительно облегчит применение этих методов к другим поглотителя и мясоеда видовой конкретных моделей в соответствующих будущих исследований. В этом исследовании обычные методы были использованы для исследования нетрадиционных средств торговли людьми, PrP Res материал, который мог бы внести вклад в распространение и общей бремени PrP Res материала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наш протокол адаптирован из одного мы ранее опубликованной 7. Все процедуры с участием животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Соединенных Штатов департамента сельского хозяйства (USDA), животных и растений инспекционной службы здравоохранения (APHIS), дикой природы служб (WS), Национального исследовательского центра дикой природы (NWRC) на.

1. Ворона Gavaging

  1. Оценка срок прохождения 'псевдо мозга материала "через пищеварительный тракт американских ворон.
    1. Смешайте 5 мл приготовленные и яичница целое яйцо с синим красителем и через желудочный зонд 1 ворона с использованием 2 в зондового иглы (рис. 1).
    2. Проверьте ворона каждые 30 мин до тех пор, синий / зеленый окрашенных фекалий не больше не выводятся из организма.
  2. Получить незараженных и неизлечимо больных RML (Чандлер штамм)-инфицированных C57BL / 6 мозги мыши.
  3. Создайте 20% вес / объем нормальный и зараженный гомогената мыши мозга в пуля блендера гомогенизатор с 1хфосфатный буферный раствор (PBS), и стеклянные бусы, то центрифуге при 3000 мкг в течение 1 мин для удаления крупных твердых частиц. Удалить супернатант и разбавляют равным объемом 1x PBS, чтобы генерировать 10% вес / объем в стерильном PBS. Замораживание при -80 ° С до использования.
  4. 17 ч до зонд удаления остатков пищи, но не воды, от ворона ручек.
  5. Случайно выделить ворон в группах лечения и в устной форме через желудочный зонд каждый ворону с 5 мл либо нормальной или зараженной гомогената мозга мыши с помощью 2 в зондового иглы.
  6. Передача вороны в индивидуальные клетки и собирать и объединять все фекалии внутри каждой клетки в течение 4 часов после кормления через желудочный зонд (рис. 2).
  7. Гомогенизируют объединенных фекалии для каждого ворона в пуля блендера гомогенизатора со стеклянными шариками до образования однородной текстуры не будет достигнута. * Crow фекалии в основном жидкости и может быть легко смешивается.
  8. Для каждого ворон, разбавленной 500 мкл гомогената фекального в 9,5 мл 1x PBS при общем объеме 10 мл.
  9. Центрифуга фекальный homogenaТе течение 15 мин при 1400 х г и извлечения супернатанта.
  10. Чтобы свести к минимуму угрозу вторичного микробной инфекции, лечения супернатант с 1 мкл 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, Нью-Йорк) в 100 мкл гомогената затем поместите под УФ-светом при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы уменьшить риск вирусного и бактериального загрязнения. После УФ-облучения, соникатные образцы в 3000 Мп для обработки ультразвуком на установке 70 в течение 30 сек, чтобы сорвать мембрану оставшихся микробов.

2. Мышь Прививка

  1. Случайно выделить мышей на следующие группы лечения (табл. 1):
    1. Группа 1 - Положительные мышей лечение прививку внутрибрюшинно (IP) 1 мл фекального гомогената из ворон устно которым вводили 5 мл заражен мозг мыши.
    2. Группа 2 - мыши лечения Отрицательный прививку IP 1 мл фекального гомогената из ворон устно которым вводили 5 мл нормальных мозгах мыши.
    3. Развести infecteг и нормальной мозга мыши гомогенат для групп 3 и 4 до 1:100 вес / объем в 1x PBS.
    4. Группа 3 - Положительные контрольные мыши прививку IP 1 мл зараженной гомогената мыши мозга.
    5. Группа 4 - Отрицательный контрольных мышей прививали IP 1 мл нормальной гомогената мыши мозга.
Группа по лечению Количество животных
Группа 1 Скрепи + Crow Фекалии 100
Группа 2 Скрепи - Crow Фекалии 25
Группа 3 Скрепи + Mouse Brain 10
Группа 4 Скрепи - мозга мыши 5

. Таблица 1 Скрепи статус посевного (положительный +, отрицательный -) и количество животных используется 7.

  1. Внутрибрюшинно прививку мышь:
    1. Scruff мыши на спинной шеи меха с большим и указательным пальцами и аккуратно поверните выставить брюшной стороне.
    2. Поднимите задний конец мыши так голова немного ниже.
    3. Вставьте 25 г иглы 1 см через кожу, 1 см латеральнее от средней линии, и 1-2 см впереди крестцово-подвздошных сочленений, используя иглы блокировки шприц.
    4. Введите 1 мл инокул медленно в полости тела мыши.

3. Мониторинг мышь

  1. Монитор мышей ежедневно, пока они не выражают клинические признаки мыши скрепи. Клинические признаки могут включать: кифоз, атаксия, ригидность хвост, отсутствие ухода, истощение, и вялость.
  2. Оценка мышей для каждого из клинических признаков 6, когда видимые признаки очевидны, где 0 = нет видимый, 1 = умеренная, и 2 = тяжелая.
  3. Усыпить мышей, когда общая суточная баллы за каждого знака достичь ≥ 8 в течение 1 дня, ≥ 6 непрерывно в течение 3-х дней, или, по крайней 365 дней после прививки (точек на дюйм).
  4. Урожай мозги сразу же после euthanАзия и хранить при температуре -70 ° С.
  5. Чтобы подтвердить диагноз скрепи, переварить образцы мозга с 3 мкл 50 мкг / мл раствора протеиназы-К (PK) разбавленных следующим образом: 3.1. PK мкл, 12,5 мкл 500 мМ ЭДТА, рН 8, 109,39 мкл 1х PBS в течение 30 мин при 45 ° С, затем инактивируют добавлением PK 8 мкл загрузочного буфера и инкубации образцов при 95 ° С в течение 5 мин. Загружают образцы на 12% SDS-PAGE гель, électrophorèse и передачи в Immobilon PVDF мембрану и блок с 5% обезжиренным молоком в 0,2% Твин 20 в ЗФР ​​в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем зонд с Bar224 анти-PRP моноклонального антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена, разведенного в Суперблок, в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыть мембрану в течение 1 часа с PBS-0.2% Tween 20. Для визуализации, инкубировать вестерн-блот 5 мин с хемилюминесцентной подложки и изображения на G-коробки системы гель документации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры, используемые продемонстрировать, что пищеварительная система ворон не исключает PrP Res инфективность 4 часа после перорального зонда скрепи гомогената мозга 7. Все двадцать вороны, которые были через желудочный зонд с PrP Res материала впоследствии передается PrP Res материал через фекалии мышам. Больные мыши были определены проявления клинических мыши-скрепи знаков и подтверждение болезнь была завершена Вестерн-блоттинга.

Исследование ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируем процедуру документирования прохождения PrP Res материала через пищеварительную систему ворон. Мы использовали традиционные методы, чтобы определить, вороны имеют возможность перемещать PrP Res материал безрецидивному географических районах. Другие оценили сопротивление PrP Res жвачным 19-21 и грызунов 22,23 пищеварительные жидкости, оба из которых не в состоянии устранить его. Будущее применение этих методов должны быть применены к другим хищников <...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить С. Вернер за предоставление ворон, используемые в этом исследовании и USDA, APHIS, WS, NWRC персонал по уходу за животными для ухода за животными и мониторинга. Упоминание или использование продукта не подразумевает USDA одобрение. Финансирование данного исследования была предоставлена ​​USDA, APHIS, ветеринарных служб.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RML Chandler штамм мыши, адаптированный скрапиRocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 мышейHilltop Lab Animals
Американские вороныдикие пойманные
Pen/StrepInvitrogen15140-122
Фосфат буферизованный физиологический растворInvitrogen70011-044
SonicatorMisonix
Proteinase-K solutionRoche3115887001
Загрузочный буферInvitrogenNP0007 и 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% гельInvitrogenNP0342
Immobilon PVDF мембранаMillipore1SEQ00010
Tween 20Sigma AldrichP2287
Bullet гомогенизатор блендераBraintree ScientificBBX24B
2,3 мм гранулы диоксида циркония/диоксидакремния BioSpec Products11079125Z
Bar224 анти-PrP моноклональное антителоCayman Chemical 10009035
SuperblockThermo Scientific37517
хемилюминесцентный субстратMilliporeWBKLS0500
G-box система документирования геляSyngene

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Miller, M. W., Williams, E. S., et al. Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming. Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).
  3. Miller, M. W., Williams, E. S. Horizontal prion transmission in mule deer. Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).
  4. Sigurdson, C. J., Adriano, A. Chronic Wasting Disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1772 (6), 610-618 (2007).
  5. Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. Environmental sources of prion transmission in mule deer. Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).
  6. Mathiason, C. K., Hays, S. A., et al. Infectious prions in pre-clinical deer and transmission of chronic wasting disease solely by environmental exposure. PLoS ONE. 4 (6), e5916(2009).
  7. VerCauteren, K. C., Pilon, J. L., Nash, P. B., Phillips, G. E., Fischer, J. W. Prion remains infectious after passage through digestive system of American crows (Corvus crachyrhunchos). PLoS ONE. 7 (10), e45774(2012).
  8. Imran, M., Mahmood, S. An overview of animal prion diseases. Virology Journal. 8 (493), (2011).
  9. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion disease. PLoS PATHOGENS. 2 (3), e26(2006).
  10. Bruce, M. E., et al. Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent. Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).
  11. Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy. Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).
  12. Collinge, J. The risk of prion zoonoses. Science. 335 (6067), 411-413 (2012).
  13. Beringue, V., Vilotte, J. L., Laude, H. Prion agent diversity and species barrier. Veterinary Research. 39 (47), (2008).
  14. Harrington, R. D., Baszler, T., et al. A species barrier limits transmission of chronic wasting disease to mink (Mustela vison). The Journal of General Virology. 89 (4), 1086-1096 (2008).
  15. Wisniewski, H. M., Sigurdarson, S., Rubenstein, R., Kascsak, R. J., Carp, R. I. Mites as vectors for scrapie. Lancet. 347 (9008), 1114(1996).
  16. Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. Fly larvae and pupae as vectors for scrapie. Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).
  17. Matthews, D., Cooke, B. C. The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish. Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).
  18. Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease. Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).
  19. Scherbel, C., Pichner, R., et al. Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle. Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).
  20. Jeffrey, M., Gonzaález, L., et al. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep. Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).
  21. Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels. Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).
  22. Motes C, M. aluquerde, Grassi, J., et al. Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models. Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).
  23. Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie. Veterinary Research. 40 (1), 4(2009).
  24. Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).
  25. Bjorndal, K. A. Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate. Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).
  26. Clark, R. G., Gentle, G. C. Estimates of grain passage time in captive mallards. Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).
  27. Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity. Primates. 33 (3), 399-405 (1992).
  28. Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer. Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).
  29. Pulford, B., Spraker, T. A., et al. Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification. Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).
  30. Hicks, R. E. Guano deposition in an Oklahoma crow roost. Condor. 81 (3), 247-250 (1979).
  31. Aldous, S. E. Winter habits of crows in Oklahoma. Journal of Wildlife Management. 73 (4), 290-295 (1944).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PrPRes

Похожие статьи