Обогащение и очистка эмбриональных стволовых клеток человека путем обнаружения поверхностных антигенов клеток с использованием моноклональных антител TG30 и GCTM-2

Краткое содержание

Мы описываем использование моноклональных антител TG30 (CD9) и GCTM-2 для комбинированного обнаружения поверхностных антигенов клеток с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) для идентификации и обогащения живых эмбриональных стволовых клеток человека (HESC) с использованием положительного отбора, а также использования отрицательного отбора для очистки гЕСК от смешанной популяции клеток.

Аннотация

Эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) могут самообновляться бесконечно in vitro,и с соответствующими сигналами могут быть вызваны дифференцироваться в потенциально все соматические линии клеток. Дифференцированные производные hESC потенциально могут быть использованы в трансплантационной терапии для лечения различных клеточных дегенеративных заболеваний. Тем не менее, протоколы дифференциации hESC обычно дают смесь дифференцированных целевых и внецелевых типов клеток, а также остаточных недифференцированных клеток. Для перевода дифференцированных hESC-производных из лаборатории в клинику, важно уметь различать недифференцированные (плюрипотентные) и дифференцированные клетки, а также генерировать методы для разъединю этих популяций. Безопасное применение гЕСК полученных соматических типов клеток может быть достигнуто только с плюрипотентными стволовыми клетками свободных популяций, как остаточные ГЕСК может вызвать опухоли, известные как тератомы после трансплантации. С этой целью мы описываем методологию обнаружения плюрипотентности связанных поверхностных антигенов клеток с моноклональными антителами TG30 (CD9) и GCTM-2 с помощью флуоресценции активированной клеточной сортировки (FACS) для идентификации плюрипотентных TG30 Hi-GCTM-2^Hi hESCs с использованием положительного отбора. Используя отрицательный отбор с нашей методологией TG30/GCTM-2 FACS, мы смогли обнаружить и очистить недифференцированные гЕСК в популяциях, проходящих очень раннюю стадию дифференциации (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). В дальнейшем исследовании, плюрипотентные стволовые клетки без образцов дифференцированных TG30^Neg-GCTM-2^{Neg клеток,} отобранных с помощью нашего TG30/GCTM-2 FACS протокол не образуют тератомы после пересадки в иммунной скомпрометированных мышей, поддерживая надежность нашего протокола. С другой стороны, TG30/GCTM-2 FACS-опосредованное последовательное протекание обогащенного плюрипотента TG30 Hi-GCTM-2^Hi hESCs не повлияло на их способность к самообновлению in vitro или их внутренней плюрипотентности. Таким образом, характеристики нашей методологии TG30/GCTM-2 FACS обеспечивают чувствительный анализ для получения высокообогащенного населения hPSC в качестве входных данных для дифференциации анализов и для избавления потенциально опухолевых (или остаточных) HESC от производных популяций клеток.

Введение

HPSC (hPSC) включают эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hIPSC). HPSC может самообновиться на неопределенный срок в соответствующих культурных условиях, не теряя своих способностей, известных как "плюрипотентность". Плюрипотенция определяется как потенциал для клетки, чтобы дифференцироваться в основном любой соматической клеточной линии, включая клетки представитель каждого из трех эмбриональных слоев зародышевых клеток. Замечательный потенциал HPSC обеспечивает средства для широкого спектра клеточных приложений, включая терапевтические варианты. Например, есть расстройства, связанные со смертью клеток и дегенерацией, где нормальная функциональность клеток в организме человека скомпрометирована, как при сердечной недостаточности, травмах позвоночника, диабете, болезни Паркинсона, некоторых видах рака и других клинических патологиях. Пациенты, страдающие этими условиями потенциально могут рассматриваться путем трансплантации здоровых и функциональных соматических клеток, которые были получены из HPSC в лаборатории. Тем не менее, текущие протоколы дифференциации HPSC не являются 100% эффективными и дают смесь дифференцированных целевых и внецелесочных типов клеток, а также остаточных HPSCs, которые не прошли дифференциацию, вместо этого продолжая^{самообновать 1-3}. Наличие даже небольшого количества hPSC в образце hPSC полученных соматических клеток, предназначенных для трансплантации пациентам, представляет собой серьезный клинический риск, поскольку эти клетки по своей присущей природе образуют ткани всех трех эмбриональных слоев микробов, потенциально могут образовывать виво тип опухоли, известный как тератома. Таким образом, только целевые популяции клеток, которые, как установлено, свободны от плюрипотентных стволовых клеток, могут считаться безопасными для трансплантации пациентам. Есть несколько подходов, как сообщается, потенциально выполнить очистки остаточного HPSCs после дифференциации, (для обзора см. Polanco и Ласлетт⁴). Ранее мы сообщали об использовании моноклональных антител TG30 (CD9) и GCTM-2 в сочетании с флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS) для выявления плюрипотентных стволовых клеток и дискриминации их от клеток, проходящих раннюю стадию дифференциации в культурах^{линий HESC 5-7}.

Одним из преимуществ использования антител для обнаружения поверхностных антигенов клеток является то, что целевые клетки, как правило, жизнеспособны после связывания антител и/или маркировки. Таким образом, целевые клетки могут быть собраны после маркировки антител и перекультуры для расширения и дальнейшего применения перед трансплантацией. Одно предостережение для антигенов поверхности клетки выраженное на hPSC что они не только к плюрипотентной стадии и in many cases re-expressed височно во время развития и поэтому будут обнаружены в некоторых продифференцированных типах клетки. Поэтому, если цель состоит в том, чтобы использовать антитела для обнаружения человеческих плюрипотентных клеток и очистить их от образца клеток, полученных из HPSC, выбранные антитела не должны также реагировать с антигенами на конкретные дифференцированные типы клеток, предназначенных для трансплантации. К сожалению, Есть ограниченное количество антител, которые обнаруживают маркеры поверхности клеток на живых HPSCs ⁴, что делает ограниченные варианты для выбора. Кроме того, несколько исследований указали, что обнаружение одного маркера поверхности клетки не является достаточным для устранения всех hPSC, предполагая, что любая попытка устранить все плюрипотентные субпопуляции hPSC должны опираться на методы, которые используют два или более антител обнаружения различных эпитопов, выраженных HPSCs ^9-10. Как упоминалось выше, только HPSC полученных клеток, которые могут быть определены как плюрипотентных стволовых клеток свободных клеток популяций подходят для трансплантации человека. Достижение этого уровня строгости не может быть достигнуто с помощью одного прохода через антитела опосредованной технологии сортировки клеток. Для окончательного получения плюрипотентных образцов стволовых клеток может потребоваться рекультура обогащенной популяции дифференцированных целевых клеток и последующие раунды сортировки клеток.

В нашей лаборатории мы широко охарактеризовали два антитела к поверхности клеток HES, TG30 (CD9) и GCTM-2, для обнаружения живых плюрипотентных клеток. Наши исследования показали, что комбинированное обнаружение как TG30, так и GCTM-2 сильно коррелирует с экспрессией канонических генов, связанных с плюрипотенцией, ^{в линиях HESC 5-7.} Иммунопрофилирование TG30/GCTM-2 FACS последовательно показывает, что культуры hESC представляют собой количественный непрерывный градиент выражения TG30/GCTM-2 ^5-7. Мы произвольно установили четыре популяции (P) ячеек в пределах этого TG30/GCTM-2 градиента: P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)и P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) ^5-7. Наша характеристика этих P4, P5, P6 и P7 популяций клеток показала, что подфракции P6 и P7 выражают большое количество генов, связанных с плюрипотенцией, и эффективно образуют стволовые колонии при перекультуре после FACS ^2-3. С другой стороны, P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) клетки выражают большое количество маркеров дифференциации и представляют собой спонтанно дифференцированные типы клеток, которые обычно встречаются в расширяющихся культурах линий ^{hESC 5-6}. Мы решили проверить потенциал нашего TG30/GCTM-2 FACS для селективной ликвидации остаточных HPSCs после ранней дифференциации стадии, а также для обогащения плюрипотентных популяций стволовых клеток. Протокол, описанный ниже, показывает, как собирать и рекультуры дифференцированных P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) клетки после FACS для выполнения очистки плюрипотентных P7 (TG30^Привет-GCTM-2^Привет). Кроме того, мы также объясняем сбор и рекультуру плюрипотентных P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)клеток для получения обогащенной культуры плюрипотентных клеток, которые впоследствии могут быть использованы в качестве определенной входной популяции для потенциального повышения эффективности и согласованности дифференциации анализов.

Протокол

Следующий протокол был выполнен с использованием стандартных массовых культур hESC-MEL1^11, предоставленных stemCore в Университете Монаша (Мельбурн). Эта линия клеток обычно культурируется на слое митотически инактивированных эмбриональных фибробластов мыши (MEF) в bFGF дополненных hESC/KOSR media^{7 и} поддерживается с энзиматической диссоциацией (коллагеназы) каждые 5-7^{дней 8}. Культуры hESC, выращенные до 80% слияния в колбы 75^{см 2} (T75), используются в качестве входных популяций для этого протокола. Все процедуры манипуляции клетками, описанные ниже, должны выполняться в асептических условиях в биобезопасности HEPA-фильтрованного класса II.

За два дня до проведения анализа TG30/GCTM-2 FACS подготовьйте культурные пластины T75 (описанные в разделе 1), которые будут использоваться для рекультуры клеток, восстановленных после FACS (описано в разделе 4).

1. Посев МЭФ и подготовка средней степени безопасности

1.1 День -2: Покрытие МЭФ в колбы T75

1. Пипетт 10 мл 0,1% ж / В желатин в каждой колбе T75 и наклона, чтобы покрыть поверхность равномерно.
2. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре в шкафу биобезопасности.
3. Аспират желатиновый раствор.
4. Добавьте 20 мл MEF-среды в колбу и предварительно эквилибрата до 37 градусов по Цельсию/5% CO_{2 в} течение 30 мин в инкубаторе культуры клеток.
5. Плита митотично инактивированных МЭФ на подготовленную колбу (ы) при следующих плотностях. Для семян плотности 1/3 МЭФ 1,4 х 10^{4 ячейки/см 2} (T75" 1 x 10⁶ МЭФ). Для полной плотности MEF семян 5,3 х 10⁴ клеток /^{см 2} (T75 и 4 х 10⁶ МЭФ).

Примечание: Мы регулярно используем МЕФ, которые были митотично инактивированы γ облучения. Протокол подготовки облученных γ можно найти в Михальске¹².

6. Инкубационный облученный MEF культур при 37 C/5% CO_{2 ночь.} 1/3 колбы можно инкубировали в течение 1-4 дней без изменения MEF-среды. Эти колбы используются для переоформляния ячеек post-FACS (как в протоколе 4). Полный MEF колбы инкубируется в одночасье для создания CM в соответствии с ниже в шаге 1.2.

1.2 День -1: Подготовка среды с состоянием МЭФ (CM)

1. Аспират MEF-средний от полных колб MEF T75.
2. Добавьте предварительно уравновешенную 25 мл HESC/KOSR среды, дополненной 5 нг/мл человеческого FGF-2 на колбу T75. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию/5% CO₂ в течение 24 часов.
3. Соберите MEF-кондиционированную среду (CM) в стерильную трубку культуры ткани, свежеприготовленную CM с 10 нг/мл человеческого FGF-2 и фильтр с помощью фильтра полиэтиленсульфона 0,22 мкм.
4. Чтобы произвести дополнительные CM, повторите шаги 1.2.2 и 1.2.3 ежедневно на той же культуре MEF в течение одной недели.

В день проведения анализа TG30/GCTM-2 замените MEF-medium в 1/3 ЦЯП T75 колбами CM и дооквилбровки в течение не менее 30 минут до посева любых hESCs или hESC-производных клеток, восстановленных в ходе процедуры, описанной ниже. CM используется свежим или хранится при 4 градусах Цельсия в течение 2 недель. CM используется в этом протоколе, так как в наших руках он повышает жизнеспособность ячеек после FACS по сравнению с неучтенными средствами массовой информации (результаты не показаны).

2. Выполнение анализа TG30/GCTM-2 FACS: Диссоциация массовых культур hESC в одиночные клетки

Примечание: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 среды при 4 C.

1. Аспирировать hESC/KOSR сми из двух колб T75 с культурной линией hESC.
2. Промыть клетки в каждом T75 с 10 мл DPBS и аспирата для удаления.
3. Добавьте 3 мл раствора диссоциации TrypLE Express в каждую колбу T75. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию/5% CO₂ в течение 5 мин.
4. Bump стороне колбы, чтобы получить полное вытеснение клеток. Проверьте под микроскопом. Если клетки не выбить легко, инкубировать еще 2-3 мин при 37 C/5% CO₂.
5. Добавьте 10 мл 20% FBS/DMEM-F12 (сохраняется при 4 градусов по Цельсию) к каждой колбе T75. Используя стерильные 10 мл пипетки аккуратно тритурировать диссоциированных клеток несколько раз против стенки колбы для достижения преимущественно одноклеточной подвески.
6. Поместите 70 мкм клеточный ситечко на 50 мл стерильной полипропиленной трубки. Используйте стерильные 10 мл пипетки, чтобы заставить HESC одноклеточных суспензий, соединенных из двух колб T75 через ситечко.
7. Откажитесь от ситечкой клеток, замените крышку трубки и центрифугайте подвеску с бассейном hESC при 1000 х г в течение 2 минут.
8. Отбросьте супернатант и промойте клетки, аккуратно повторно помеская гранулы в 10 мл 20% FBS/DMEM-F12 (предварительно при 4 градусах Цельсия).
9. Выполните вторую центрифугу при 1000 х г в течение 2 мин.
10. Откажитесь от супернатанта, добавьте 10 мл 20% FBS/DMEM-F12 (предварительно при 4 градусах Цельсия) и аккуратно тритурат для повторного перерасхода клеток. Поместите 50 мл трубки на лед. Эта трубка будет использоваться для процедуры иммуностиминга Сорта образца, описанной ниже.
11. Возьмите 20 мкл одноклеточной подвески hESC (шаг 2.10) для подсчета числа клеток с помощью гемотоцитометра. Вы должны ожидать выход 10-15 миллионов клеток на колбу T75.

Примечание: FBS используется в этой части протокола для повышения жизнеспособности ячеев после FACS.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание поверхностных антигенов TG30 и GCTM-2

1. Aliquot 150 хл (100 000 клеток) одноклеточной подвески hESC (от шага 2.11) в каждую из шести микроцентрифугных трубок по 1,5 мл. Эти шесть aliquots будут использоваться для окрашивания элементов управления, необходимых для калибровки анализа на машине FACS. Оставшаяся подвеска клетки 9 мл будет вашим Сортированным Образцом, в котором разобщенное культура будет costained для обнаружения TG30 и GCTM-2, согласно таблицам 1 и 2.
2. Выполняем связывающие реакции первичных антител в 20% FBS/DMEM-F12. Окончательные объемы реакции должны быть 9 мл для сорта образца и 200 мкл для элементов управления. Включите изотип управления в качестве основных антител. Поместите трубки горизонтально на лед и аккуратно перемешайте в течение 30 минут на платформу для качания.
3. Центрифуга первичных реакций антител на 1000 х г в течение 2 мин.
4. Отбросьте супернатант и промыть клетки путем повторного перерасхода гранул в 20 мл 20% FBS/DMEM-F12 (предварительно при 4 градусов по Цельсию) для сорта образца и 200 мкл для контроля.
5. Выполните второй спин на 1000 х г в течение 2 мин.
6. Выполняем связывающие реакции вторичных антител в 20% FBS/DMEM-F12. Окончательные объемы реакции должны быть 2,5 мл для сорта образца и 200 мкл для элементов управления. Подготовьтесь к реакционной трубке PE-антимошки CD90.2 на данном этапе. Поместите трубки горизонтально на лед и аккуратно перемешайте в течение 30 минут на платформу для качания.

Примечание: В это инкубационные время удобно собирать CM и готовить 1/3 колбы MEF T75 с CM, как в разделе 1.2.

7. Центрифуга вторичных реакций антител на 1000 х г в течение 2 мин.
8. Отбросьте супернатант и вымойте клетки TWICE путем повторного перерасхода гранул в 20 мл 20% FBS/DMEM-F12 (предварительно при 4 градусах Цельсия) для Сорта Образца и 200 мкл для элементов управления.
9. Выполните спин на 1000 х г в течение 2 минут после каждой стирки и место трубки на льду.
10. Отбросьте супернатанты и гранулы клеток resuspend в 20% FBS/DMEM-F12, дополненных йодидом пропидия (PI) при 0,3 мкг/мл. Используйте 2-3 мл для сортировки образца и 300 мкл для управления.

Примечание: НЕ добавляйте PI в контрольную трубку с необлименеными клетками.

11. Используйте микропипют P1000, чтобы заставить каждую индивидуальную подвеску клетки через 35 мкм ситечко клетки крышки, в сочетании с 5 мл трубки полистирола круглые нижние пробирки.
12. Центрифуга при 50 г/мин, чтобы заставить через остаточную подвесную клетку на крышках ситечко.
13. Resuspend каждой отдельной подвески ячейки, нажав стороны труб, и место на льду. Ваши ячейки теперь готовы к FACS. Пожалуйста, продолжайте сразу.

4. Пост-FACS Культура TG30/GCTM-2 Подфракционные клетки в 75^{см 2} (T75) Колбы

1. Ранее мы сообщали о том, как настроить машину FACS для иммунопрофилирования TG30/GCTM-2^7. Процедура позволяет восстановление жизнеспособных одиночных ХЭСК, свободных от МЭФ, и в пределах ворот P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)и P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)- см. Рисунок 1E. Настройка машины FACS для TG30/GCTM-2 FACS, как и в нашем предыдущем докладе, чтобы восстановить подфракции ячеек, которые будут использоваться в следующем.
2. Добавьте 1 мл CM, подготовленный как в шаге 1.2, к каждому из 2 5 мл полистирола круглые нижние пробирки перед собирать клетки от машины FACS. Место на льду.
3. Восстановление 400 000 ячеек каждый из дифференцированных P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) и плюрипотентных P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)клеточных подфракций с использованием TG30/GCTM-2 FACS.
4. Центрифуга коллекционых трубок по 1000 х г в течение 5 мин.
5. Аспирировать супернатантов. Добавьте 1 мл предварительно облибрированных 37 C/5% CO₂ CM для повторного использования каждой клеточной гранулы с помощью микропайптора P1000. Семя клеток для каждой фракции на предварительно equilibrated 1/3 MEF T75 колбу с CM (подготовлено в соответствии с шагом 1.2)
6. Культура при 37 градусах по Цельсию/5% CO₂ в течение 24 часов в инкубаторе клеточной культуры.
7. Аспирировать CM ежедневно и заменить свежеприготовленным CM (как в шаге 1.2) в течение примерно двух недель. Культуры плюрипотентных P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)клетки показывают человеческие стволовые колонии через неделю и достигают 80% слияния в 9-11 дней. Культуры P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) клетки в основном растут как газон фибробластов, как клетки, которые достигают слияния в 11-13 дней. На этом этапе, при необходимости, культуры клеток P4 и P7 могут быть использованы для TG30/GCTM-2 FACS опосредовано последовательной рекультуры либо P4 или P7 субфракций (см. цифры 2 и 3).

Результаты

hESC-производные, которые плюрипотентные стволовые клетки, свободные могут быть получены путем последовательного прохода клеток из P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) субфракции.

Предыдущие доклады установили, что в стандартных культурах hESC смесь субпопуляций сосуществует, демонстрировали градиент экспрессии генов, связанных^{с плюрипотенцией 5,6,13}. Комбинированное обнаружение поверхностных антигенов клеток, таких как TG30 (CD9) и GCTM-2, допускает дискриминацию ряда подмножества клеток на плюрипотентной стадии и на различных стадиях ранней дифференциации, о чем свидетельствует их экспрессия маркеров стволовых клеток^{и специфических транскрипционных факторов линии 5,6,13}. В соответствии с предыдущими докладами, мы смогли различить P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid),и P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) клетки в линии hESC-MEL1, используемой для этого исследования (Рисунок 1). С этим результатом, мы приступили к сбору дифференцированных P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) клетки и плюрипотентные P7 (TG30^Привет-GCTM-2 Привет )^клеткидля дальнейшей культуры в исследованиях, описанных ниже.

Мы исследовали, можно ли с помощью отрицательного подхода отбора мы могли бы очистить недифференцированные гЕУ от популяций клеток, проходящих очень раннюю стадию^{дифференциации}(TG30 Neg -GCTM-2^Neg). Мы использовали определенное количество ячеек P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),которые были последовательно культурны после FACS(рисунок 2A) в течение приблизительно двух недель, и повторно использовали TG30/GCTM-2 FACS до повторного покрытия на каждом проходе. Результаты показали, что P4-субфракция обогащена для TG30^Neg-GCTM-2^Neg дифференцированных типов клеток после последовательного прохождения, и незначительное присутствие P7 (TG30^Привет-GCTM-2^{Hi) клетки}на начальном проходе (Рисунок 2A, Прохождение 1) в конечном итоге исчезли после дальнейшего прохождения, став плюрипотентной стволовых клеток свободных образцов (Рисунок 2A, Прохождение 3).

Обогащение плюрипотентных клеток ХЕСК может быть достигнуто за счет сбора клеток TG30^Hi-GCTM-2^{Hi-клеток.}

Основываясь на предыдущих наблюдениях, использующих этот анализ, мы ожидаем обогащения плюрипотентных гЕСК путем сбора P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)клеток, которые должны образовывать колонии hESC. Таким образом, мы также исследовали TG30/GCTM-2 FACS-опосредованное последовательное протекание плюрипотентных P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)ячеек. В этих культурах P7 иммунопрофилирование TG30/GCTM-2 FACS проводилось до переливания клеток на каждом проходе, и только P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)клетки были перекультуры. Таким образом, мы заметили, что большинство клеток были расположены в подфракциях, связанных с плюрипотенцией (P6 и P7), что указывает на обогащение плюрипотентных клеток, которые также поддерживали способность дифференцировать и генерировать небольшой процент P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) клетки (Рисунок 3A). Кроме того, культуры клеток P7 показали большое количество hESC-как колонии во время passaging(рисунок 3B), также указывая на поддержание состояния плюрипотентности.

Рисунок 1. Стратегия сортировки представителей для получения субфракций TG30/GCTM-2 FACS. (A): Диссоциированные подвески клеток HES сортируются как одиночные клетки и потенциальные сгустки или дублеты закрыты с вперед рассеяния по высоте и области (FSC-H и FSC-A). (B): Потенциальные обломки удаляются с помощью FSC-A и SSC-A, и только нетронутые ячейки дополнительно сортируются. (C): Невекаемые клетки исключаются на основе флуоресценции пропидия йодида (PI) (FSC-A и FL3-A). (D): Ячейки фидер MEF были закрыты отрицательным отбором на основе выражения мыши CD90.2-PE (FL2-A и SSC-A). (E): Изолированная жизнеспособная фракция hESC, свободная от фидерсов MEF, наконец, фракционо в P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid),и P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)субпопуляции. Отрицательные ворота (TG30^Neg-GCTM-2 Neg ,^{названный}P4) были установлены в соответствии с фоном автофлуоресценции для необляных клеток, а также для управления изотипом. (F): Проценты различных закрытых субпопуляций, типичных для цитометрического анализа потока TG30/GCTM-2. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.

Рисунок 2. Представительные последовательные культуры спонтанно дифференцированных клеток P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)от линии hESC-MEL1. (A): Представитель TG30/GCTM-2 FACS участков, показывающих закрытые подмножества ячеек (P4, P5, P6 и P7) дискриминируется по уровню обнаруженного выражения маркеров поверхности клеток TG30 и GCTM-2. Первоначальная популяция 400 000 хЕСК-производных, выставляла иммунопрофилирование P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)из массовых культур линии hESC-MEL1. Эти P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) клетки последовательно пролетев после FACS в условиях, поддерживающих обновление HESC в колбы T75, до достижения слияния (11-13 дней). Перед каждым проходом TG30/GCTM-2 FACS выполняется для сбора и рекультуры только P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) дифференцированных типов клеток. (B): Типичная морфология газона дифференцированных клеток P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)через 14 дней. (C): Спорадические hESC-как колонии видели после 14 дней, переплетающихся с газоном P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) клетки на проходе 1 только, скорее всего, генерируется загрязняющих P7 (TG30^Привет-GCTM-2^Привет) клеток. Шкала бар 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.

Рисунок 3. P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)клетки, полученные из линий hESC, могут последовательно пройти после FACS, не теряя при этом своих внутренних плюрипотентных свойств. Представитель TG30/GCTM-2 FACS иммунопрофилирования различных последовательных проходов, показывая дискриминированную подмножества клеток (P4, P5, P6 и P7) в зависимости от уровня экспрессии TG30 и GCTM-2. (A): Стартовая популяция 400 000 ячеек, показывающих характеристики P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi),извлекается из основных культур линии hESC-MEL1. Плюрипотентные P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)клетки последовательно проносяты после FACS в условиях, поддерживающих обновление HESC в колбы T75, до достижения 80% слияния (9-11 дней). TG30/GCTM-2 FACS иммунопрофилирование выполняется до переливания клеток на каждом проходе, и только клетки TG30^Hi-GCTM-2^Hiперекультуры. Результаты показывают, что P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)клетки сохраняют свои плюрипотентные характеристики с последующим проходом, включая сохранение (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)экспрессию, формирование колоний, похожих на hESC (показано в B)и поддержание способности дифференцировать, как можно сделать вывод из перепросмотра небольшой доли дифференцированных P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) в каждом из градиентов FACS. Шкала бар 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.

Образец (объемы реакции)	Первичные антитела	Вторичные антитела	PE Крыса Антимоша CD90.2 b	Пропидий йодид c
Сортированная проба (9 мл для первичных ABs, 2,5 мл для вторичных ABs)	(TG30 и GCTM-2) a	AF 488 коза анти-мышь IgG2a и AF 647 коза анти-мышь IgM	+	+
Контроль-1: TG30 (200 мкл)	TG30	AF 488 коза анти-мышь IgG2a	-	+
Контроль-2: ГКТМ-2 (200 мкл)	ГКТМ-2	AF 647 коза анти-мышь IgM	-	+
Управление-3: Антимошашки CD90.2 (200 мкл)	-	-	+	+
Контроль-4: Фикоэритрин (PE) (200 мкл)	Мышь IgG2a изотип	R-фикоэритрин коза анти-мышь IgG2a	-	+
Контроль-5: Мышь Иммуноглобулин изотип (200 мкл)	Мышь IgG2a изотипа и изотип IgM	AF 488 коза анти-мышь IgG2a и AF 647 коза анти-мышь IgM	-	+
Контроль-6: Необлетонные клетки (200 мкл)	-	-	-	-

Таблица 1. Сортировать образец и элементы управления для сортировки FACS. ^a Сортированная проба иммунолигурирована одновременно с антителами TG30 и GCTM-2. ^б PE-анти-мышь CD90.2 используется для распознавания ячеек мыши и удаления MEFs из ГЕСК во время FACS¹⁴. ^c Незвукаемые клетки исключаются с помощью йодида пропидия при конечной концентрации 0,3 мкг/мл. Реагент добавлен (я), не добавлен (-) к трубке реакции.

антитело	хозяин	Изотип	Рабочее разбавление
TG30 (1,4 мг/мл)	мышь	IgG2a	1:1,000
GCTM-2 (супернатант гибридомы)	мышь	IgM	1:5 и 1:10 a
AF 488 коза анти-мышь IgG2a	коза	Поликлональный	1:500
AF 647 коза анти-мышь IgM	коза	Поликлональный	1:500
R-фикоэритрин (PE) коза анти-мышь IgG2a	коза	Поликлональный	1:1,000
Антимошашки CD90.2	крыса	IgG2b	1:100
Очищенная мышь IgG2a, и управление изотипом	мышь	IgG2a	1:200
Очищенная мышь IgM, и управление изотипом	мышь	IgM	1:200

Таблица 2. Детали антител и разбавления для сортировки FACS. ^a Из-за чрезвычайно очень высокой экспрессии GCTM-2 на поверхности клеток ГЕУ не может достичь насыщения этим антителом. Каждая партия супернатанта гибридомы GCTM-2 должна быть присвоена стандартному элементу управления или предыдущей партии, чтобы получить аналогичные результаты с гЕУ в масштабе и избежать чрезмерного окрашивания.

Название среды	состав
hESC/KOSR средний	Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) дополнен 20% заменой сыворотки нокаута (KOSR), 2 мМ GlutaMAX, 1% МЭМ несущественные аминокислоты, 0,1 мМ 2-Меркаптоэтанол, 10 нг/мл фактора роста фибробласта человека 2 (FGF-2) и Pen/Strep в 1x.
СРЕДА MEF	Модифицированный eagle Medium Дульбекко, высокий уровень глюкозы (DMEM) дополнен 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 2 мМ GlutaMAX, и пен / Strep в 1x.

Таблица 3. Состав культурных СМИ.

Обсуждение

В клиническом контексте дифференцированные типы соматических клеток являются конечной желаемой продукцией для трансплантации и терапевтического применения, а HPSC является самообновляемым и масштабируемым источником для генерации этих соматических клеток или их прародителей в лаборатории. Наличие остаточных недифференцированных гЕСК с присущим ему потенциалом для формирования тератомы является риском для безопасности при рассмотрении соматических клеток, полученных из HESC для трансплантации пациентам. Для рассмотрения этого и других рисков, связанных с клеточной терапии, пожалуйста, смотрите Шарп и др. ^{16 Поэтому,} чтобы реализовать такие приложения, крайне важно, чтобы исследователи стремятся генерировать целевые популяции клеток, которые также плюрипотентные стволовые клетки бесплатно. С этой целью мы демонстрируем здесь, что с помощью нашей методологии TG30/GCTM-2 FACS можно контролировать наличие плюрипотентных клеток (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)в дифференцируя популяции клеток и получить жизнеспособные производные, дифференцированные по ХЕСК, которые могут быть обогащены и перекультурированы после FACS. Хотя невозможно получить 100% плюрипотентных образцов, свободных от стволовых клеток с одним проходом нашего протокола, обогащенные hESC-производные могут быть перекультуры и после последовательного прохода 100% соматической клеточной чистоты достигается. Продемонстрирована жизнеспособность соматических клеток для расширения после FACS также потенциально позволяет для производства достаточного количества клеток, пригодных для потенциальной трансплантации терапии.

Обнадеживающие результаты этого экспериментального исследования побудили нас провести более всестороннее исследование с использованием нашего протокола TG30/GCTM-2 в сравнительном исследовании с несколькими индуцированными человеком плюрипотентными стволовыми клетками (hiPSC)^{линиями 15}. В этом исследовании мы обнаружили, что плюрипотентные образцы, свободные от стволовых клеток, полученные с помощью нашего протокола TG30/GCTM-2 FACS, не генерируют тератомы при пересадке в лишенных иммунитета мышей. Таким образом, мы можем с уверенностью сказать, что с использованием этого протокола in vitro, ранней стадии дифференциации клеточных культур определяется как свободный от плюрипотентных TG30 Привет-GCTM-2^Привет клетки не развиваются тератомы in vivo. Это решительно поддерживает надежность нашего анализа, обеспечивая потенциальный подход к устранению риска образования тератомы до использования клеток, полученных из HPSC в клинических применениях.

И наоборот, мы также показываем, что анализ TG30/GCTM-2 FACS может быть использован для извлечения плюрипотентной популяции клеток с высоким уровнем экспрессии этих двух поверхностных антигенов (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Предыдущие исследования показали, что TG30^Привет-GCTM-2^{Привет клетки} демонстрируют самую высокую корреляцию с^{выражением} OCT4 привет и образуют наибольшее количество HESC-как^{колонии 5,6,13,15}. Поэтому мы считаем, что сеть плюрипотенции активируется на максимальных уровнях в TG30^Hi-GCTM-2^Hi, выражаюющих ячейки. Мы считаем, что использование нашего протокола TG30/GCTM-2 FACS и извлечение клеток P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)может позволить провести крупномасштабную очистку обогащенных живых культур hESC, как входные данные для дифференциации анализов.

В заключение мы демонстрируем здесь потенциал наших анализов FACS на основе комбинированного выражения поверхностных антигенов TG30 и GCTM-2 как для очистки, так и для обогащения гЕСК. Будущие исследования с протоколами направленной дифференциации ГПСК, вероятно, также будут информативными в отношении этой потенциальности. Мы знаем, что в некоторых анализах, где дифференцированные hESC-производные временно выражают TG30 (CD9) или GCTM-2, эти два антитела могут быть неуместны или достаточны для очистки плюрипотентных клеток от дифференцированной популяции в определенный момент времени в^{анализе 6}. Таким образом, существует постоянная необходимость найти новые антитела, которые специально распознают живые гЕУ для преодоления возможного ограничения перекрестной реакции с некоторыми дифференцированными типами клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Полное название: Модифицированная Eagle от Dulbecco Среда: Питательная смесь F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Полное название: Нокаутирующая замена сыворотки
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	Полное название: Добавка GlutaMAX
Заменимые аминокислоты	Life Technologies	11140050	Полное название: MEM Раствор заменимых аминокислот
Меркаптоэтанол	Life Technologies	21985023	Полное название: 2-меркаптоэтанол
DPBS	Life Technologies	14190250	Полное название: Фосфатно-солевой буфер Дульбекко, без кальция, без магния
TrypLE Express Life	Technologies	12604039	Полное название: TrypLE Express (1x), без фенола
Red AF-488	Life Technologies	A21131	Полное название: Alexa Fluor 488 козий антимышиный IgG2a
AF-647	Life Technologies	A21238	Полное название: Alexa Fluor 647 козий антимышиный IgM
PE-анти IgG2a	Life Technologies	P21139	Полное название: R-phycoerythrin козий антимышиный IgG2a (γ 2a) Conjugate
DMEM	Life Technologies	11965-092	Полное название: Dulbecco's Modified Eagle Medium, с высоким содержанием глюкозы
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Полное название: Пенициллин-стрептомицин, жидкая
дистиллированная вода	Life Technologies	15230-089.	Полное название: Стерильная дистиллированная вода
PI	SIGMA	P4864	Полное название: Раствор йодида пропидиума
FBS	SIGMA	12203C	Полное название: Фетальная бычья сыворотка
Желатин	SIGMA	G-1890	Полное название: Желатин из свиной кожи
Человек FGF-2	Millipore	GF003AF-100UG	Полное название: Фибробласты Фактор роста основной, человеческий рекомбинантный, без животного происхождения
Фильтр 0,22 μ m	Millipore	SCGPU02RE	Полное название: Stericup-GP, 0.22 μ m, полиэфирсульфон, 250 мл, радиостерилизованный
70 мкм; m Клеточный фильтр	Becton Dickinson	352350	Длинное название: Клеточный фильтр с 70 μ m Нейлоновая сетка
35 μ m Крышка клеточного ситечка, 5 мл туба	Becton Dickinson	352235	Длинное название: 5 мл полистирольная пробирка с круглым дном, с крышкой клеточного фильтра (35 μ m)
5 мл пробирка из полистирола с круглым дном	Becton Dickinson	352054	Полное название: 5 мл пробирка с круглым дном из полистирола, стерильная
IgG2a Контроль изотипа	Becton Dickinson	554126	Длинное название: очищенная мышь IgG2a, κ контроль изотипа
IgM контроль изотипа	Бектон Дикинсон	553472	длинное название: Очищенная мышь IgM, κ Контроль изотипа
PE-CD90.2	Becton Dickinson	553014	Полное название: PE Rat Anti-Mouse CD90.2
8-пиковая калибровка	Becton Dickinson	559123	Полное название: Радужные калибровочные частицы (8 пиков)
50 мл стерильная полипропиленовая туба	Greiner Bio-One	227261	Длинное название: 50 мл Полипропиленовая туба с коническим дном, стерильная
колба T75	Greiner Bio-One	658175	Полное название: CELLSTAR Filter Cap Клеточная культура 75 см2 колбы
TG30	Merck Millipore	MAB4427	Полное название: TG30 Антитело, клон TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	Длинное название: GCTM-2 коммерчески недоступен, но TG343 и эквивалентное моноклональное антитело есть
Table 4. Список материалов и реагентов
Аппарат FACS	Becton Dickinson		FACSVantage SE с опцией FACSDiva
Инвертированный микроскоп	Olympus		IX71
Таблица 5. Список оборудования.