Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Цельноклеточная MALDI-TOF масс-спектрометрии является точным и быстрым методом для анализа различных режимах активации макрофагов

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50926

⸱

26 декабря 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает использование полноклеточной масс-спектрометрии MALDI-TOF на эукариотических клетках. Здесь мы проиллюстрируем точность этого метода, проанализировав множественные состояния активации макрофагов в ответ на их микроокружение.

Аннотация

MALDI-TOF - это широко используемый метод масс-спектрометрии в химии и биохимии. Он также применяется в медицине для идентификации молекул и биомаркеров. В последнее время он используется в микробиологии для рутинной идентификации бактерий, выращенных из клинических образцов, без этапов подготовки или фракционирования. Мы и другие успешно применили этот метод масс-спектрометрии MALDI-TOF для полноклеточных клеток к эукариотическим клеткам. В настоящее время она применяется в различных областях: от идентификации типа клеток до контроля качества клеточных культур и диагностических приложений. В этой статье мы описываем его использование для изучения различных поляризационных фенотипов макрофагов в ответ на цитокины или бактерии, убитые теплом. Это позволило идентифицировать макрофагально-специфичные отпечатки пальцев, которые являются репрезентативными для разнообразия протеомных реакций макрофагов. Данное приложение иллюстрирует точность и простоту метода. Описанный нами протокол может быть полезен для изучения иммунного ответа хозяина при патологических состояниях или может быть расширен для более широкого диагностического применения.

Введение

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) - это популярный метод масс-спектрометрии для изучения биологических образцов. Использование лазерного луча и поглощающей энергию матрицы позволяет осуществить процесс мягкой ионизации: испарение и генезис крупных, в основном однозарядных биомолекул. Этот процесс называется десорбцией/ионизацией, оправдывая аббревиатуру MALDI. Затем эти ионы ускоряются под действием напряжения и поступают в анализатор TOF, который позволяет разделять эти ионы и количественно определять их соответствующие массы1.

MALDI-TOF MS широко используется в биологии, химии и медицине для идентификации молекул и биомаркеров2-4 или для мониторинга посттрансляционных изменений на proteins5,6. Недавно несколько групп применили MALDI-TOF MS для идентификации микроорганизмов из клинических образцов7,8<span style="font-size: 14px;">. Это микробиологическое применение в настоящее время регулярно используется в клинических условиях. Цельноклеточный MALDI-TOF имеет множество преимуществ по сравнению с классическим применением MALDI-TOF MS. Образцы, содержащие целые клетки, обрабатываются напрямую, что позволяет избежать трудоемких этапов фракционирования или отделения большого количества материала. Более того, нет необходимости в характеризации различных пиков: весь спектр рассматривается как отпечаток образца, а алгоритмы сопоставления сравнивают исследуемый спектр с базой данных референсных спектров.

Мы и другие применили этот метод анализа целых клеток к эукариотическим клеткам. Этот метод может иметь множество применений: (1) определение основных типов клеток из смешанной выборки9-11; (2) оценка жизнеспособности клеточных культур с течением времени (включая контроль качества в промышленных целях)12; (3) мониторинг состояний активации одиночной ячейки типа13; (4) Оценка злокачественной трансформации клинической выборки14,15.

Здесь мы описываем использование цельноклеточного MALDI-TOF MS для изучения различных поляризационных фенотипов макрофагов в ответ на цитокины или бактерии, убитые теплом. Макрофаги играют ключевую роль в иммунном ответе на микробные патогены. Они обнаруживают инфекционные агенты в тканях с помощью рецепторов распознавания образов, способных обнаруживать консервативные микробные паттерны, такие как липополисахарид (ЛПС)16. Макрофаги — это профессиональные антигенпрезентирующие клетки, которые взаимодействуют с Т-клетками для формирования адаптивного иммунного ответа. Т-клетки влияют на макрофаги, высвобождая цитокины, которые либо усиливают, либо регулируют микробицидную активность макрофагов. По аналогии с поляризацией Th1/Th2 лимфоцитов, воспалительные, микробицидные и опухолевые макрофаги были классифицированы в М1-макрофаги, а иммунорегуляторные макрофаги — в М2-макрофаги17-19. Термин М1 относится к классической активации макрофагов цитокинами I типа, такими как интерферон (ИФН)-γ и фактор некроза опухоли (ФНО), или бактериальными продуктами, такими как ЛПС18,20-23, в то время как макрофаги, активируемые альтернативными путями (интерлейкин (ИЛ)-4, ИЛ-10, трансформирующий фактор роста-β1, считаются макрофагами М219,24,25. Высокая фенотипическая и функциональная пластичность макрофагов в ответ на их микроокружение делает эти макрофаги полезными для анализа тонких изменений с помощью подхода MALDI-TOF MS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В настоящем протоколе метод MALDI-TOF для цельных клеток используется для получения масс-спектра, рассматриваемого как отпечаток пальца образца. Биоинформатический анализ позволил сравнить и классифицировать эти отпечатки пальцев. В этом протоколе было три основные части:

  1. Подготовка биологических образцов: контрольные макрофаги и макрофаги стимулируются различными агонистами.
  2. Анализ каждого типа образца с техническими репликациями с помощью цельноклеточного MALDI-TOF MS.
  3. Биоинформатический анализ исходных данных.

Готовьте стерильные растворы для выделения и культивирования клеток. Готовьте и храните все реагенты при температуре 4 °C

1. Получение моноцитов человека

  1. Приготовьте среду для культивирования клеток. Добавьте 55 мл сыворотки крови человека AB+ или фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 мл раствора антибиотика (пенициллин в дозе 10 000 ЕД/мл и стрептомицин в дозе 10 000 мкг/мл; конечная концентрация 100 ЕД/мл для пенициллина и 100 мкг/мл для стрептомицина) в среду RPMI 1640 (500 мл).
    1. Выделите мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) из лейкопаков (концентратов лейкоцитов).
      1. Приготовьте пробирки объемом 50 мл, содержащие 15 мл Ficoll. Разведите кровь в физрастворе (vol/vol, 1/10). Нанесите 30 мл разведенных PBMCs на Ficoll, как описано ранее26.
      2. Центрифугируйте при давлении 700 x g в течение 20 мин. Восстановите PBMC на границе раздела между Ficoll (плотность 1,077 г/мл) и разбавленной плазмой. Разведите PBMC в питательной среде и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут.
    2. Получить моноциты CD14+ из PBMC с помощью магнитных шариков, покрытых анти-CD14 антителами.
      Примечание: Хранить продукты и клетки при температуре 4 °C до образования моноцитов.
      1. Приготовьте проточный буфер, состоящий из фосфатно-солевого буфера (PBS) pH 7,2, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
      2. Аккуратно диссоциируйте гранулированные PBMC (10-7 клеток на анализ) в 80 мкл протекающего буфера.
      3. Добавьте 20 мкл CD14 MicroBeads в PBMC. Перемешайте и инкубируйте PBMC в течение 15 минут. Промойте PBMC 5 мл проточного буфера и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут. Аккуратно диссоциируйте гранулированные PBMC в 500 μл рабочего буфера для 108 PBMC.
        Примечание: используйте 500 мкл рабочего буфера при концентрациях PBMC ниже10-8 PBMC.
      4. Приступаем к магнитной сепарации.
        Примечание: для менее чем 2 x 108 PBMC используйте колонку MS; для более чем 2 x 108 PBMC и менее чем 2 x 109 PBMC используйте столбец LS.
      5. Промыть предварительную колонку и колонку с рабочим буфером (500 мкл для колонки MS или 3 мл для колонки LS). Добавьте PBMC в предстолбец (подождите, пока непомеченные ячейки пройдут через столбец). Промойте 3 раза проработанным буфером (500 мкл для колонки MS или 3 мл для колонки LS). Удалите предварительную колонку.
      6. Поместите колонку на пробирки объемом 15 мл. Добавьте беговой буфер (1 мл для колонки MS или 5 мл для колонки LS) на колонку и элюируйте ячейки CD14+, оказывая давление на колонку.
      7. Центрифугируйте элюат при 300 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость. Промойте моноцитарную гранулу 10 мл питательной среды.<бр/> Примечание: Анализируйте чистоту моноцитарного препарата с помощью антител к CD14 и проточной цитометрии (классически выше 95%).
  2. Дифференцировка моноцитов в макрофаги.
    1. Моноциты инкубируют (10-6 моноцитов на лунку в 6-луночных планшетах) в 3 мл питательной среды, содержащей 10% АВ+ сыворотки крови человека, при 37 °С. Через 4 дня замените питательную среду, содержащую человеческую сыворотку, на 3 мл питательной среды, содержащей 10% FBS, еще на 3 дня.
    2. Идентификация полученной клеточной популяции как моноцитарных макрофагов (МДМ) с помощью проточной цитометрии (см. рис. 1).
      1. Замените питательную среду на 3 мл PBS. Соскребите МДМ резиновым полицейским и соберите подвески МДМ. Центрифугируйте при 400 х г в течение 5 мин. Добавьте PBS, содержащую 2% BSA, в гранулированные MDM и осторожно перемешайте клеточную суспензию. Отрегулируйте концентрацию клеток (106 MDM в 200 мл PBS) и инкубируйте при 4 °C.
      2. Добавить 10 мл антител к CD14 и 10 мл антител к CD68 к суспензии MDM и инкубировать при температуре 4 °C в течение 20 мин в темноте.
        Примечание: эти антитела должны быть помечены двумя различными флуорохромами, соответствующими анализу проточной цитометрии. Например, анти-CD14 антитела могут быть конъюгированы с фикоэритрином в паре (для окрашивания моноцитов) и анти-CD68 антителами с Alexa Fluor 647 в паре (для окрашивания макрофагов).
      3. Центрифугируйте МДМ при давлении 400 х г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость. Аккуратно диссоциируйте клеточную гранулу и инкубируйте МДМ в 250 мл 3% параформальдегида (PFA) в течение 15 минут при комнатной температуре. Центрифугируйте МДМ с фиксированным PFA при давлении 400 x g в течение 5 мин. Промойте МДМ 3 мл PBS и центрифугируйте МДМ при 400 х г в течение 5 минут. Аккуратно диссоциируйте гранулу MDM в 400 мл PBS.
      4. Проанализируйте дифференцировку моноцитов (экспрессирующих CD14, но не CD68) в моноциты (экспрессирующих CD68, но не экспрессирующих CD14). Примечание: классически более 95% клеток являются MDM.
  3. 18-часовая стимуляция МДМ.
    1. Замените питательную среду адгезивных МДМ свежей питательной средой объемом 3 мл (содержащей 10% FBS).
    2. Чтобы индуцировать М1 или М2 поляризацию, используют следующие человеческие рекомбинантные цитокины: ИФН-γ и ФНО для М1 поляризации и ИЛ-4 для М2 поляризации. Макрофаги М1 также получают путем стимуляции ЛПС. Следует отметить, что стоковые растворы цитокинов консервируются при -80 °С, а стоковый раствор ЛПС консервируется при -20 °С.
      1. Разведите исходный раствор ИФН-gγ (1 мг/мл) в дозе 1/100 в питательной среде до получения разведения 10 нг/мл. Добавьте 6 мкл этого разведения ИФН-γ в МДМ для получения конечной концентрации ИФН-γ 20 нг/мл.
      2. Разведите исходный раствор TNF (1 мг/мл) в дозе 1/100 в питательной среде до получения разведения 10 нг/мл. Добавьте 6 мкл этого раствора TNF в MDM, чтобы получить конечную концентрацию TNF 20 нг/мл.
      3. Разведите исходный раствор IL-4 (1 мг/мл) в дозе 1/100 в питательной среде до получения разведения 10 нг/мл. Добавьте 6 мкл этого разведения IL-4 в MDM, чтобы получить конечную концентрацию IL-4 20 нг/мл.
      4. Добавьте 3 мкл исходного раствора ЛПС (1 мг/мл) в МДМ для получения конечной концентрации ЛПС 1 мкг/мл.
    3. Чтобы стимулировать МДМ бактериями, используйте бактерии, убитые теплом. Промойте живые бактерии PBS и нагрейте их при температуре 95 °C в течение 1 часа. Использование Orientia tsutsugamushi (штамм Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, штамм BCG CIP 671203) и Coxiella burnetii (Nine Mile в фазе I) было связано с тем, что эти патогены, как известно, инфицируют макрофаги. Таким образом, приготовьте суспензию O. tsutsugamushi в концентрации 10:9 бактерий/мл. Добавьте 50 μл в MDM. Повторите тот же шаг для M. bovis и C. burnetii.
  4. Подготовка биологических образцов для MALDI-TOF MS.
    1. Промывайте стимулированные МДМ PBS без Ca2+ или Mg2+ (клетки могут агглютинироваться в присутствии Ca2+ или Mg2+). Соскребите МДМ резиновым полицейским и соберите подвески МДМ. Центрифугируйте MDM. Промойте MDM в PBS без Ca+ или Mg2+ при 400 x g в течение 5 минут, чтобы удалить загрязнение FBS.
    2. Отрегулируйте концентрацию клеток (2 x 10,6 MDM на анализ). Центрифугируйте МДМ при 400 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Соберите гранулы клеток в 20 мкл PBS без Ca2+ или Mg2+.
    3. Перед анализом проанализируйте образцы сразу или храните их в PBS при температуре -80 °C.

2. Анализ макрофагов с помощью цельноклеточного МС Maldi-TOF

  1. Подготовка матрицы CHCA.
    1. Добавьте во флакон 500 мкл ацетонитрила, 250 мкл 10% трифторуксусной кислоты и 250 мкл высокоэффективной воды для жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Разведите в этом растворе 10 мг CHCA до конечной концентрации 10 мг/мл. Перемешивайте и обрабатывайте ультразвуком не менее 20 мин.<бр/> Примечание: ультразвуковая обработка улучшит насыщенность матрицы, но этот шаг не является обязательным.
    2. Центрифугируйте при 13 000 x g в течение 5 мин. Выбросьте гранулу и оставьте надосадочную жидкость><. Примечание: готовьте матричный раствор непосредственно перед использованием. Матричный раствор, содержащий кристаллы, не позволяет обеспечить хорошую ионизацию молекул образца, и это может повлиять на качество спектров.
  2. Подготовка стальной мишени MALDI.
    1. Смочите полированную стальную мишень горячей водой из-под крана. Протрите прецизионной бумагой. Добавьте 70% этанол и разотрите. Смойте водой путем растирания. Добавьте 70% этанола и протрите прецизионной бумагой.
    2. Погрузите мишень в 70% этанол и обработайте ультразвуком не менее чем на 15 мин. Нанесите на мишень от 500 мкл до 1 мл трифторуксусной кислоты в концентрации 80%. Потрите и протрите прецизионной бумагой. Смойте водой ВЭЖХ, не втирая. Высушите мишень при комнатной температуре.
      Примечание: неправильно очищенная мишень может повлиять на качество спектров.
  3. Подготовка депозитов.
    1. Поместите чистую мишень на горизонтальную и ровную опору, чтобы получить равномерные отложения.
    2. Аккуратно разморозьте образцы MDM на льду. Примечание: быстрое и энергичное размораживание может изменить образцы, что повлияет на качество спектров. Гомогенизируйте MDM (путем пипетирования клеточной суспензии вперед и назад) перед осаждением 1 мкл (содержащего примерно 1 x 105 клеток) на мишень MALDI. Добавьте 1 мкл матричного раствора MALDI на образец. Избегайте смешивания с помощью пипетки. Смешивание пятен с помощью пипеток изменяет качество спектров. Депонирование 12-16 образцов/проб (технические повторы).
    3. Самопроизвольно испаряются при комнатной температуре. Примечание: испарение происходит постепенно и приводит к образованию кристаллов матрицы/образца. Депозиты могут быть немедленно проанализированы или храниться в темноте в течение нескольких дней перед анализом (до 2 недель).
    4. Пользователь должен контролировать, чтобы цитокины или убитые теплом бактерии, используемые в эксперименте, не давали пиков в диапазоне спектров стимулированных макрофагов. Здесь мы проверили, что цитокины и бактерии, убитые теплом, сами по себе не дают никакого сигнала в пределах исследуемого диапазона (0-20 кДа).
  4. Настройка масс-спектрометра и сбор данных.
    1. Вставьте стальную мишень с образцами в масс-спектрометр.
    2. Настройте масс-спектрометр и запустите сбор данных. Используйте конфигурацию по умолчанию для автоматического сбора данных.
    3. Примечание: подробный обзор конфигурации программного обеспечения flexControl приведен в приложении/Таблица 1. Это может варьироваться в зависимости от масс-спектрометра и используемого программного обеспечения.

3. Биоинформатический анализ

Примечание: биоинформатический анализ был выполнен с использованием бесплатного программного обеспечения для статистического анализа R с открытым исходным кодом, а также специальных библиотек анализа (MALDIquant). R можно бесплатно скачать с его веб-сайта http://cran.r-project.org/. Подробное описание скрипта представлено в виде дополнительный материал.

  1. Загрузка и предварительная обработка исходных данных.
    1. Храните необработанные данные на компьютере, связанном с масс-спектрометром, в нескольких файлах и папках. Извлеките корневую папку эксперимента со всеми вложенными папками. Скопируйте корневую папку на персональный компьютер для анализа.
    2. Используйте библиотеки readBrukerFlexData и MALDIquant для загрузки и анализа необработанных данных.
      Примечание: readBrukerFlexData позволяет загружать необработанные данные с масс-спектрометра в определенный объект в R для дальнейшего анализа. Для получения дополнительной информации см. описание MALDIquant 27.
    3. Анализируем сгенерированные spectra.
      Примечание: каждый спектр состоит из списка пиков с соответствующими массами и интенсивностями (относительной распространенностью). Используйте квадратный корень из интенсивностей для улучшения графической визуализации спектров. Коррекция фона с помощью статистически чувствительного нелинейного алгоритма обрезания пиков для базовой оценки27. Используйте отношение сигнал/шум 6 для обнаружения пиков. Учтите, что обнаруженные пики одинаковы во всех спектрах, когда значения масса/заряд (м/z) находятся в пределах окна 2000 ppm.
  2. Определение и вычисление баллов. Классификация спектров с помощью иерархической кластеризации с помощью алгоритма Уорда для агломерации и матрицы несходства на основе расстояния Жаккара.
    Примечание: индекс Жаккара измеряет сходство между наборами булевых выборок (т.е. наличие/отсутствие списка пиков).
  3. Сравнение спектров и просмотр.
    1. Анализируйте необработанные графики спектров. Примечание: ось x представляет собой отношение m/z (в дальтонах), а ось y представляет интенсивность (относительное распространение).
    2. Оценка сходства между спектрами с помощью иерархической кластеризации. Представьте сходство (или дивергенцию) в виде древовидной схемы.
    3. Оцените воспроизводимость с помощью виртуального представления в виде геля. Примечание: виртуальное представление в виде геля - это модифицированный график тепловой карты, на котором относительная распространенность обозначена цветом с возрастающей интенсивностью синего.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Целью настоящего протокола является демонстрация точности метода MALDI-TOF MS целых клеток для оценки реакции макрофагов на их микроокружение.

Рисунок 1 описывает подготовку стимулированных макрофагов из образцов крови. Рисунок 2 представляет анализ моноцитов и MDM с помощью проточной цитометрии. Обратите внимание, что моноциты экспрессировали CD14, но не CD68 (Рисунок 1A). Напротив, MDM экспрессировали CD68, но не CD14 (Рисунок 1B

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает применение MALDI-TOF-MS на эукариотических цельных клетках. Здесь мы проиллюстрируем точность метода, проанализировав множественные состояния активации макрофагов в ответ на их микроокружение.

Успех протокола зависит от нескольких критически важных шагов. Во-первых, любой раствор загрязнителя может изменить спектры. Например, важно промывать клетки в PBS для удаления питательных сред и сывороточных белков перед осаждением на мишень. Концентрация клеток 1 x 105 клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не могут заявить о конфликте интересов. RO, JLM и CC являются изобретателями международного патента WO 2011/154650 под названием «Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF».

Благодарности

Richard Ouedraogo получает грант от Ministère de la Santé (PHRC 2010). Мы благодарим Лорана Горвеля, Кристофа Флодроса и Николя Амстронга за техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Ссылки

  1. Mass Gross, J. Spectrometry: A Textbook. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).
  2. Villanueva, J., et al. Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry. Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).
  3. Diamandis, E. P. Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations. Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
  4. Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic. 11 (20), 2577-2591 (2005).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Mass Spectrometry and Protein Analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  7. Carbonnelle, E., et al. Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification. J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).
  8. Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains. J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).
  9. Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).
  10. Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. PloS One. 5 (10), 13691 (2010).
  11. Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping. Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).
  12. Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).
  13. Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages. J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).
  14. Amann, J. M., et al. Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).
  15. Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis. Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).
  16. Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections. Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).
  17. Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).
  18. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  19. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  20. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
  21. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).
  22. Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms. J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).
  23. Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. Macrophage polarization in health and disease. Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).
  24. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  25. Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).
  26. Delaby, A., Gorvel, L., et al. Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency. J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).
  27. Gibb, S., Strimmer, K. MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data. Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение моноцитовCD14-положительные клеткипроточная цитометрияподготовка мишени MALDIматрица CHCAспектральный анализдифференциация M1 и M2
Цельноклеточная MALDI-TOF масс-спектрометрии является точным и быстрым методом для анализа различных режимах активации макрофагов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.