Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Субретинальная трансплантация macS Очищенные клетки-предшественники фоторецептора в сетчатку взрослой мыши

10.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50932

⸱

22 февраля 2014 г.

 ,  ,  , 
1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Трансплантация клеток представляет собой стратегию лечения дегенерации сетчатки, характеризующуюся потерей фоторецептора. Здесь мы описываем метод обогащения трансплантируемых фоторецепторов и их субретинального прививки взрослым мышам.

Аннотация

Ухудшение зрения и слепота в связи с потерей светочувствия клеток сетчатки, т.е. фоторецепторов, является основной причиной инвалидности в промышленно развитых странах. Замена вырожденных фоторецепторов путем трансплантации клеток представляет собой возможный вариант лечения в будущих клинических применениях. Действительно, недавние доклинарические исследования показали, что незрелые фоторецепторы, изолированные от сетчатки неонатальной мыши в послеродовой день 4, имеют потенциал для интеграции во взрослую сетчатку мыши после субретинальной трансплантации. Донорские клетки создали зрелую морфологию фоторецептора, включая внутренние и внешние сегменты, круглое клеточное тело, расположенное на внешнем ядерном слое, и синаптические терминалы в непосредственной близости от эндогенных биполярных клеток. Действительно, последние сообщения показали, что донорские фоторецепторы функционально интегрируются в нейронную схему мышей-хозяйцев. Для будущего клинического применения такого клеточного подхода очищенные суспензии клеток по выбору должны быть сгенерированы и помещены в правильное положение для правильной интеграции в глаз. Для обогащения прекурсоров фоторецептора сортировка должна основываться на специфических поверхностных антигенах клеток, чтобы избежать генетической модификации донорских клеток. Здесь мы показываем магнитно-ассоциированную сортировку клеток (MACS) - обогащение трансплантируемых прекурсоров фоторецептора стержня, изолированных от неонатальной сетчатки мышей-репортеров, специфичных для фоторецепторов, на основе маркера поверхности клетки CD73. Инкубация с антителами anti-CD73 последуха за micro-бисером конъюгированные вторичные антитела позволили обогащение прекурсоров фоторецептора стержня MACS до приблизительно 90%. По сравнению с цитометрией потока, MACS имеет то преимущество, что он может быть легче применяться к стандартам GMP и что большое количество клеток может быть отсортировано в относительно короткие периоды времени. Инъекция обогащенных клеточных суспензий в подретинарное пространство взрослых мышей дикого типа привела к в 3-кратной более высокой скорости интеграции по сравнению с несортированной клеточной подвеской.

Введение

Видение является одним из основных чувств людей. Нарушение этого чувства и слепота являются одной из основных причин инвалидности в промышленно развитых странах. Основной причиной нарушения зрения или слепоты является дегенерация сетчатки, характеризующаяся потерей фоторецепторных клеток, так как она может наблюдаться при макулярной дегенерации, пигменте ретинита, дистрофии конусообразного стержня и других условиях. На сегодняшний день эффективной терапии для восстановления утраченной зрения нет. В 2006 и 2008 годах две различные лаборатории сообщили, независимо друг от друга, успешная трансплантация стержневых фоторецепторов клеток-предшественников в взрослых дикихмышей сетчатки 1,2. Таким образом, возникает возможность пересадки клеток-предшественников фоторецептора также в вырожденную сетчатку, чтобы заменить вырожденные фоторецепторы и восстановить зрение. Действительно, недавно было продемонстрировано, что такие пересаженные клетки-предшественники фоторецептора вызывают морфологические критерии зрелых фоторецепторов дикого типа,таких как правильно разработанные внешние сегменты 3, синаптическиетерминалы в непосредственной близости от эндогенных биполярных клеток и круглого клеточного тела, расположенного во внешнем ядерном слое2-4,а такжевозможность функционально интегрироваться в нейроцепа 5-7. Одним из основных принципов этой стратегии является использование послеродового дня 4 (PN 4, PN0 определяется как день рождения) молодых мышей сетчатки, в результате чего смесь различных типов клеток для трансплантации. На фоне будущего терапевтического применения, эта смесь должна быть очищена для клеток-предшественников фоторецептора. CD73 был описан как первый маркер поверхности клетки, специфичный для молодых фоторецепторов всетчатке 8-10. Здесь мы демонстрируем метод очистки клеток-предшественников фоторецептора, основанный на этом маркере поверхности клетки и с использованием метода сортировки клеток, связанных с магнитным покрытием (MACS). MACS может иметь преимущества по сравнению с флуоресцентными методами сортировки клеток, из-за быстрого времени сортировки и более легкой адаптации к условиям GMP. Мы могли бы продемонстрировать обогащение на 90% и более высокий уровень интеграции в 3 раза при пересадке обогащенной популяции в подретинальный космос в сетчатке взрослого дикого типа. Таким образом, фоторецептор на основе MACS-прекурсоров и субретинальной трансплантации являются надежными и перспективными методами разработки регенеративной терапевтической стратегии лечения дегенерации сетчатки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этическое использование и уход за животными заявление:

Все эксперименты на животных проводились в строгом соответствии с законами Европейского союза и Германии (Tierschutzgesetz) и соответствовали Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по этике животных ТУ Дрездена и Landesdirektion Дрезден (номер утверждения: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. Перед началом диссоциации клеток и сортировки клеток

  1. Этикетка три 15 мл реакционной трубки с: Мытье (W), Положительная фракция (я) и Отрицательная фракция (-).

2. Диссоциация сетчатки

  1. Обезглавить PN 4 щенков с помощью ножниц.
  2. Промыть голову щенков в ближайшее время в 70% этанола следуют стирки в PBS.
  3. Перенесите голову на холодный HBSS и окуттете глаз (повторите этот шаг для всех голов). Чтобы приутупляться, откройте веки и зафиксировать глаз изогнутыми миппами в области зрительного нерва. Затем осторожно вытащите глаз с орбиты.
  4. После enucleating все глаза, изолировать сетчатку: ввести закрытые ножницы в зрительный нерв и открыть лезвия. Peal RPE / хорид из. Удалите линзы и кровеносные сосуды с помощью изогнутых типсов.
  5. Перенесите изолированную сетчатку в реакционной трубке 1,5 мл, содержащей раствор папаина (предоставленный комплектом диссоциации папаина).
  6. Инкубировать сетчатку в растворе папаина в течение 30-60 мин в водяной бане или шейкере (400 об/мин) при 37 градусах Цельсия.
    1. В то время как сетчатка инкубируют в растворе папаина, пипетка 1 мл раствора овомукоида в 15 мл реакционной трубки (метка "1").
    2. Добавьте 60 мкл DNase I (10 мг/мл) и 60 мкл раствора овомукоида (предоставленный комплектом) и 520 мкл ЭБС в 15 мл реакционной трубки (метка "2").
  7. После инкубации папаина перенесите раствор папаина, содержащий частично переваренную сетчатку, в реакционной трубке "2".
  8. Используя отполированную огнем пипетку, выполняйте механическую диссоциацию (10x вверх и вниз).
  9. Пипетт одноклеточной подвески для реакции трубки "1". Попробуйте создать 2 слоя, аккуратно наслоения клеточной подвески на верхней части раствора овомукоида.
  10. Центрифуга в течение 5 мин при 300 x g (примерно 1300 об/мин).
  11. Отбросьте супернатант и ассизент клетки в 500 мкл буфера MACS.

3. Сортировка клеток с использованием магнитной сортировки связанных клеток (MACS)

  1. Добавьте антитела крысы X и х 73 к 500 л для достижения окончательной концентрации 10 мкг/мл.
  2. Инкубация 5 мин на льду.
  3. Заполните 15 мл реакционной трубки до 10 мл буфером MACS и центрифуга его в течение 5 минут со скоростью 300 х г.
  4. Удалите супернатант.
  5. Перепробись гранулы в буфере MACS в 480 йл и добавьте 120 мкл козьих анти-крыс IgG микробусов.
  6. Инкубация 15 мин на льду; не агитировать, встряхнуть или смешать его.
  7. Заполните 15 мл реакционной трубки до 5 мл буфером MACS и центрифуга его в течение 5 мин при 300 х г.
  8. Как реакция трубки центрифугирована:
    1. Отрегулируйте колонку LS в магнитную подсюх.
    2. Поместите предсепарацию фильтра поверх колонки LS.
    3. Гидратировать фильтр преспарации и LS колонку с 3 мл буфера MACS и собирать буфер MACS в стиральную (W) трубку.
  9. Удалите супернатант.
  10. Повторное производство гранул в буфере MACS в 500 йл.
  11. Загрузите 500 мкл клеточной подвески к фильтру, затем добавьте 1 мл буфера MACS в фильтр и соберите отрицательную фракцию в отрицательную фракцию (-) реакционной трубки.
  12. Затем добавьте 3 x 3 мл буфера MACS в столбец, чтобы смыть ячейки, которые не привязаны к столбецу
  13. После того, как эти 9 мл через LS колонки, удалить столбец из магнитного стенда и установить его на верхней части положительной фракции (я) реакционной трубки.
  14. Быстро загрузите 5 мл буфера MACS в колонку LS и поместите поршень в колонку LS и нажмите его вниз, пока весь буфер не будет через столбец.
  15. Центрифуга реакционной трубки, содержащей положительную фракцию в течение 5 мин при 300 x g.
  16. Удалите супернатант, повторное течение 500 мл буфера MACS и держите при 4 градусах Цельсия.
  17. Подсчитайте общее количество ячеек с помощью общего устройства подсчета ячеек.
  18. Подготовьте подвеску клетки от положительной отсортированной фракции, содержащей2 x 10 5 ячеек/хл в буфере MACS, и держитесь на уровне 4 градусов по Цельсию

4. Трансплантация MAC-сортированы фоторецептора Прекурсор клетки в мышь сетчатки

  1. Убедитесь в том, чтобы все следующие решения готовы: 1 мл стерильных PBS или HBSS, 10 мкл DNAse I, 1-2 мл стерильных деионизированных H2O, aliquots фракций клеточной подвески при 4 градусов по Цельсию.
  2. Анестезия взрослой мыши(т.е. 2-4 месяца) с внутриперитонеальной инъекцией гидрохлорида медетомидина (0,01 мг/10 г массы тела), кетамина (0,75 мг/10 г массы тела). Затем сделайте подкожное введение бупренорфина (0,05 мг/кг массы тела) для облегчения боли.
  3. Расширяют зрачки с падением фенилэфрина 2,5%-Тропикамид 0,5%.
  4. Зафиксните мышь в держателе головы мыши и поместите под стерео микроскопом.
  5. Нанесите каплю visidic геля, чтобы предотвратить высыхание глаза.
  6. Сделайте небольшое отверстие на границе между склерой и роговицей (соответственно ora serrata)с помощью стерильной 30 G 1/2 в игле.
  7. Вырезать общий слайд крышки на небольшие (примерно 5 мм х 5 мм) штук с помощью алмазной ручки, место одного из этих частей на верхней части роговицы, что позволяет прямой визуализации сетчатки.
  8. Промыть предстерилизированный микролитер шприц несколько раз с деионизированной водой.
  9. Загрузите микролитерный шприц с 1 л клеточной подвески, прямой иглой касательно через конъюнктиву и склеру и поместите под визуальный контроль в носовой половине сетчатки.
  10. Удар осторожно отверстие в сетчатке до достижения подретинального пространства, вводить подвеску клетки в подтритеинное пространство.
  11. Наблюдайте бычье отслоение сетчатки, которое должно быть однородным, покрывая приблизительно 1/4 пространства сетчатки без каких-либо кровотечений.
  12. Свяйте шприц осторожно, отверстие сетчатки уплотняет автоматически.
  13. Промыть микролитер шприц несколько раз с деионизированной водой.
  14. Отпустите мышь из держателя головы.
  15. Проснитесь мыши путем введения атипамозола гидрохлорида для разворота медетомидина гидрохлоридного эффекта.
  16. Поместите мышь для пробуждения в теплой темной камере (примерно 25 градусов по Цельсию).
  17. Следующие 2 дня после трансплантации бупренорфин (0,05 мг/кг массы тела) следует вводить подкожной инъекцией утром и днем для облегчения боли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для того, чтобы оценить способность стержня фоторецепторов для интеграции в сетчатке мыши, мышь репортер линия была использована, в которой GFP управляется нервной сетчатки лейцина молнии (Nrl, Nrl-GFP) промоутер11. Nrl является самым ранним маркером фоторецепторов стержня, начиная свое выражение на E12.5 на протяжении всей взрослой жизни, что позволяет конкретной маркировки донорского стержня фоторецептор клеток.

PN 4 Детеныши Nrl-GFP были обезглавлены, а глаза были обучены. Сетчат...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Субретинальная трансплантация клеток-предшественников фоторецептора представляет собой надежный инструмент для достижения интеграции этих светочувствительных клеток в сетчатку хозяина взначительных количествах 1,2. Это может позволить создать клеточную терапию для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки вбудущем 6. Донорская популяция клеток, в настоящее время изолированная от сетчатки PN 4, представляет собой смесь различных типов клеток, из которых только клетки-предшественники фоторецептора интегрируются после су...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Ананд Сваруп за предоставление мышей Nrl-GFP, Иохена Хааса за техническую поддержку, а Синди Бёме и Эмели Месман для животноводства.

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): ФЗТ 111 - Центр регенеративной терапии Дрездена, CRTD Семенной Грант программы, SFB 655, и ProRetina e.V. фонд, программа выпускников DIGS-BB Дрездена и Фонд пара Сиенсия электронной Текноологии (SFRH/BD/60787/2009)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система диссоциации папаинаWorthington Biochemical CorporationLK003150поставляемая ДНКаза I не используется в методе
Очищенный крысиный антимышиный CD73, клон TY/23BD Pharmingen550738Исходная концентрация 0,5 мг/мл Козий
антикрысиный IgG МикрогранулыMiltenyi130-048-501Общий объем 2 мл
PBSGibco10010-015Используется для подсчета общего количества клеток
DNase ISigmaD5025-150KU
HBSSGibco14025050Используется для диссоциации сетчатки
Trypan blueSigmaFluka93595Используется для подсчета общего количества клеток
VidisicDr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
DomitorPfizer76579
Кетамин 10%Ратиофарм7538843
антиседанPfizer76590
Фенилэфрин 2,5%-тропикамид 0,5%Университетские клиники Дрезденская аптека Фильтры
предварительного разделенияMiltenyi130-041-407
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303
Сепаратор QuadroMACSMiltenyi130-090-976
Пипетка Пастера для полировки огневоймарки74777 20Пипетка Наконечники должны быть отполированы огнем и автоклавированы.
Штатив для туб MACS 15 млMiltenyi130-091-052
Камера для подсчета клетокCarl RothT728.1
Стерильные пробирки 15 млGreiner Bio-One188271
Leica M651 MSDLeicaM651 MSDможно использовать вместо Olympus SZX10
Olympus SZX10OlympusSZX10можно использовать вместо Leica M651 MSD
Инвертированный стереомикроскоп Olympus CKX41OlympusCKX41
Колпак для клеточных культур Thermo Scientific MSC-AdvanceThermo Scientific51025411
1,5 мл Реакционная пробиркаSarstedt727706400
2 мл Реакционная пробиркаSarstedt72695
Eppendorf Centrifuge 5702VWR (Eppendorf)521-0733
Держатель головки мышиmyNeurolab471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 inBD Pharmingen304000
Hamilton microlitere шприц 5 &; l, 75RNHamilton065-7634-01поставляется без игл
Hamilton RN специальная игла 34 GHamilton065-207434Blunt, длина 12 мм
Vannas-Tü Пружинные ножницы bingen - 5 мм Лезвия ПрямыеИнструменты для тонкой науки15003-08
Dumont #7 Щипцы - Титан BiologieFine Science Инструменты11272-40
Алмазная ручкаИнструменты-tech
15 мм x 15 мм Защитные слипыИскрыMIC3366
полировки

Ссылки

  1. Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
  2. MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
  3. Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
  4. Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
  5. Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
  6. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
  7. Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
  8. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
  9. Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
  10. Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
  11. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
  12. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  14. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  15. Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MACSCD73
Субретинальная трансплантация macS Очищенные клетки-предшественники фоторецептора в сетчатку взрослой мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.