Методическая статья

Трехмерная Tissue Culture моделью для изучения первичного костного мозга человека и его злокачественных новообразований

DOI:

10.3791/50947

⸱

8 марта 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Oncology, University of Alberta, 3Cross Cancer Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В стандартных методов культивирования клетки берут из их физиологической среде и выращивают на пластиковой поверхности блюдо. Для изучения поведения первичных клеток костного мозга человека, мы создали систему культуры 3-D, где клетки выращиваются в условиях Резюмируя родной микросреду ткани.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культура ткани был бесценным инструментом для изучения многих аспектов функционирования клеток, от нормального развития болезни. Обычные способы культивирования клеток основаны на способности клеток либо присоединить к твердой субстрата тканевой культуральной чашке или расти в суспензии в жидкой среде. Несколько бессмертные линии клеток были созданы и выращенных с использованием таких подходов, однако, эти методы часто не когда первичные клетки должны быть выращены экс виво. Такой отказ был приписан отсутствии соответствующих внеклеточных матричных компонентов ткани микросреды от стандартных систем, в которых тканевой культуры пластик используется как поверхность для роста клеток. Внеклеточной матрицы является неотъемлемой составной частью тканей микросреды и его присутствие имеет решающее значение для поддержания физиологических функций, таких как поляризации клеток, выживание, и пролиферации. Здесь мы представляем тканей метод 3-мерное культуры, где чел первичного костного мозгаLs выращивают в внеклеточного матрикса сформулированной резюмировать на микроокружение человеческой кости (система УОР). Встроенный во внеклеточном матриксе, клетки снабжены питательных веществ через среде с добавлением человеческой плазмы, тем самым обеспечивая комплексную систему, где выживаемость клеток и пролиферацию можно поддерживать в течение до 30 дней при сохранении клеточного состава первичного ткани. Использование системы RBM мы успешно выращивают первичные клетки костного мозга от здоровых доноров и пациентов с амилоидозом, а также различные гемобластозами. Система RBM позволяет прямое, в-матрицы в реальном времени визуализации поведения клеток и оценки доклинических эффективность новой терапии. Кроме того, клетки могут быть выделены из RBM и впоследствии используется для трансплантации в живом организме, сортировки клеток, проточной цитометрии и нуклеиновой кислоты и анализа белка. Взятые вместе, метод УКР предоставляет надежную систему для роста первичного Marro костиW клетки в физиологических условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культура ткани была разработана, чтобы изучить поведение клеток в контролируемой среде, чтобы минимизировать системную изменчивость при сравнении различных процессов в интактных организмов. Этот метод был впервые создан в начале 1900 1,2 и относится к технике, где тканевые эксплантаты культивируют экс естественных в стеклянной посуде. В середине 1900-х годов система была адаптирована расти несмежных ячеек, а не фрагментами здоровых тканей, а термины «тканевой культуры» и «клеточная культура" стало синонимом 3. В таких обычных системах клеточных культур клетки выращивают на поверхности тканевой культуры пластика с наложением ростовой среде, дополненной различными факторами роста. Два типа культур появились на основе адгезии мощности различных клеток: приверженцем культуры клеток, где клетки придают и распространения на пластике культуры ткани и прилипших культур, где клетки распространяются в виде суспензии. С первых дней клеткикультура, несколько бессмертные линии клеток были созданы, например, HeLa 4, первая линия клеток рака у человека. Эти клеточные линии имеют способности к пролиферации на неопределенный срок в культуре клеток, и большинство из них не требует никакого специального лечения для поддержания жизнеспособности.

Редукционистский подход из оригинальных методов культивирования клеток было разработано, чтобы упростить систему как можно больше, включив только голых компонентов минимальных, необходимых для поддержания жизнеспособности клеток и пролиферацию. Однако упрощенные подходы клеточных культур не поддержать Экс Vivo большинство основных типа клеток человека с конечной продолжительности жизни. Таким образом, новые системы культуры в настоящее время разрабатываются, чтобы приблизить ткани микросреду, насколько это возможно, таким образом позволяя сотовые экспланты расти в физиологических условиях. В отличие от обычных подходов / редукционистских клеточной культуры, 3-мерной (3-D) системы культуры в настоящее время становится предпочтительным способом для эффективного культура различныеклеточные линии человека и первичные клетки, чтобы впоследствии изучать механизмы, участвующие в здоровье и болезни, в контексте благоприятной микросреды. Такие 3-D системы обычно созданы с использованием восстановленных матриц и / или среде с добавлением факторов роста, для того, чтобы повторять тканевое микроокружение для изучения типов клеток, представляющих интерес. Первый из этих 3-мерной (3-D) моделей культуры была разработана для изучения развития молочных желез. Для обеспечения клеток с нативных условиях эпителиальные клетки молочной железы были встроены в Матригель, коллагена IV и ламинином богатых источника внеклеточного матрикса (ECM), и обложил ростовой среды. При таких условиях, эпителиальные клетки молочной железы сформированы кластеры, напоминающие молочную ацинусов, и после стимуляции лактогенных гормонов, эти ацинусов секретируется казеин и другие белки молока, в полую LUMENA ​​из ацинусами-подобных структур. Секреции казеином, не наблюдалось в стандартных культур даже после того пролактина 5, Далее подчеркивая роль микроокружения в сохранении морфологические и фенотипические характеристики клеток. Это еще одно доказательство потери нормальной клеточной функции, когда клетки берутся из контекста их физиологического микросреды является демонстрация того, что без поддержки микросреды, кератиноциты не способны формировать слоистые эпидермис 6. Ряд других моделей 3-D были созданы, чтобы позволить Экс Vivo распространение первичных клеток 7,8.

Решающая роль микроокружения в поведении клеток был элегантно продемонстрировано в исследовании, где эпителиальные клетки молочной железы образуется "наизнанку" ацинусы при культивировании в коллагена я матрица, по сравнению с правильно поляризованного ацинусов, которые формировались в Матригель. Эта потеря правильной морфологии был возвращен когда ламинина-продуцирующие миоэпителиальные клеток добавляли к культурам коллаген I 9. Кроме того, правильно микросреда требуется для точнойгенотип проявление. Выращенный в чашке, раковые клетки молочной железы MCF7, трансфицированные CEACAM1 молекулы адгезии с клетка-клетка ведут себя точно так же, как и нетрансфицированных CEACAM негативных клетках. Тем не менее, при культивировании в Матригель, в контакте с ECM, образуют дикого типа опухолевых MCF7-подобных структур в то время как MCF7 клетки, трансфицированные CEACAM1 вернуться к нормальному фенотипу и формы ацинусов с полым LUMENA, как было установлено с доброкачественной эпителия молочной железы 10. Точно так же, блокируя β1-интегрина в клетках рака молочной железы не изменить свое поведение в стандартных условиях культивирования, но тот же самый эксперимент выполняется в 3-D культур показывает, что блокирование β1-интегрина возвращается злокачественные клетки к нормальному фенотипу 11. Таким образом, ткань микроокружение не требуется только для поддержания жизнеспособности клеток, но и сохранить правильное функционирование клеток.

В дополнение к предоставлению систему, в которой поведение клеток можно изучать под физиологического состоянияс, 3-D культур функционировать как прочная и надежная среда для доклинических испытаний новых терапии 8,12,13. Культивирование клеток в 3-D позволяет скрининг исследуемых соединений в условиях окружающей среды опосредованного лекарственной устойчивости 14, где вклад клетка-клетка и клетка-ЕСМ адгезии могли быть оценены. Кроме того, проходит мимо токсичность новых соединений может быть установлено путем включения нескольких клеточных компартментах различных тканей. Такие экраны могут быть выполнены более быстро и более экономически эффективным, чем сравнимые исследований в естественных условиях 8.

Здесь мы представляем установку 3-D модели реконструированного костного мозга (УКР), где нормальных и злокачественных костного мозга (BM) клетки размножаться экс естественных в системе тесно подражая микросреды человеческого BM. Предыдущие попытки растет первичные BM-клеток человека в 2-D культур, жидкости или адгезивных совместных культурах с различными компонентами БМ стромы, Или 3-D, полутвердые агар культуры имели ограниченный успех из-за их неспособности поставлять клетки с компонентами ткани микросреды 15-18. В этих системах первичные элементы BM было плохое жизнеспособность и не размножаются экс естественных. Другая система, где клетки-предшественники BM человека выращивают в сфероида совместных культурах с BM стромальных клеток находится в 3-D система, где был поддержан жизнеспособность гемопоэтических стволовых клеток и пролиферации, по крайней мере 96 часов 19. Однако, несмотря на весьма полезным для понимания кроветворной биологии предшественников, эта система не верно воспроизводят на микроокружение BM из-за отсутствия компонентов ECM, поэтому, ограничивая его полезность. УКР модель, описанная здесь представляет собой целостную систему, где оба клеточные и внеклеточные отсеки человеческого BM реконструируются в пробирке. Мы покажем, что RBM культуры может поддерживать Экс Vivo рост нормальных клеток человека BM, как мыLL как клетки, выделенные от пациентов с различными гематологическими нарушениями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Предварительная подготовка

  1. Держите стерильные серологические пипетки и наконечники при 4 ° С.
    Поиск и устранение неисправностей: Matrigel гели при комнатной температуре (RT); используя холодные пипеток и советы помешает Матригель от гелеобразования во время установки культуры.
  2. Оттепель бутылку Матригель при 4 ° С в течение ночи.

2. Подготовка реагентов

  1. Получение исходного раствора фибронектин: Создать 1 мг / мл исходного раствора фибронектина растворением 100 мг человеческого фибронектина в 100 мл дистиллированной воды. После того, как фибронектин растворится, стерильный фильтр, аликвоту, и хранить при температуре 4 ° С в течение до 6 месяцев.
    Устранение неполадок: Если фибронектин не растворяется быстро инкубировать решение в течение нескольких минут в наборе водяной бане при 37 ° С
  2. Подготовка 10x PBS: Растворите 80 г хлорида натрия NaCl, 14,4 г Na 2 HPO 4, 2 г KCl и 2,4 г KH 2 PO 4 в 1 л дистиллированной воды. Установка рН до 7,4, стерильный фильтр, и хранить при температуре 4 ° С в течение до 6 месяцев.
  3. Подготовка нейтрализации буфера 20: Марка раствора, содержащего 100 мМ HEPES в 2 раза фосфатным буферным раствором (PBS) с использованием 1М HEPES и 10-кратное PBS растворы. Доводят рН раствора до 7,0. Хранить при температуре 4 ° С в течение 2-3 месяцев.
  4. Получение 2 мг / мл раствора хвоста крысы коллагена типа I: Сделать 2 мг / мл коллагена I раствор в буфере нейтрализации (шаг 2,3). Vortex раствора при низкой скорости и аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Как это коллаген очень вязкими, избежать образования воздушных пузырьков в то время как пипетки. Рекомендуется подготовить коллагена I решение свежий каждый раз. Хранить раствор на льду до использования.
  5. Подготовка эндостальной покрытием (раздирать): Смешайте 1 мг / мл фибронектина акции с 2 мг / мл коллагена I складе (шаги 2.1 и 2.4) в конечной концентрации 77 мкг / мл и 29 мкг / мл соответственно, в 1х &# 160; стерильной PBS. Смешивать и хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 месяца.
  6. Подготовка реконструированной костной матрицы (УКР):
    1. Предварительного охлаждения 1,5 мл микроцентрифужных пробирок на льду. Храните все матричные решения на льду во все времена.
    2. Смешать 4 части Матригель (концентрация Матригель варьируется от партии к партии, но вариации оказались незначительны), 2,5 части 1 мг / мл фибронектина и 1 часть 2 мг / мл коллагена I на льду по первым пипетки Матригель в трубка используя холодные наконечники, а затем добавить фибронектин и коллаген I. Матригель начнет твердеть при температуре выше 4 ° С, так что работать быстро, а пипетки Матригель. Смешайте матрицу очень мягко с помощью пипетки вверх и вниз, избежать введения пузырьков. Держите пробирки на лед во время смешивания УОР.
  7. Подготовка среды для роста костного мозга (BMGM): Сделайте 500 мл BMGM содержащие 6,2 х 10 -4 М CaCl 2, 10 -6 М сукцинат натрия, 10 -6 м гидрокортизон, 20% человеческой плазмы (нормальной или злокачественная собраны у здоровых доноров или больных), и 1% пенициллина / стрептомицина в RPMI-1640. CaCl 2, сукцинат натрия и гидрокортизон добавки можно хранить при -80 ° С в течение> 6 мес как 1000 х маточных растворов. При выращивании клеточных линий, фетальной бычьей сыворотки (FBS) может быть заменен на человеческой плазмы.
  8. Подготовка 10% нейтральном буферном растворе формалина (НСБ): Добавить 37% формальдегида маточного раствора, чтобы 1x PBS при 10% об / об Хорошо перемешать и хранить при комнатной температуре в течение 2-3 недель, защищенных от света.
  9. Получение 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA): Взвешивают необходимое количество BSA и растворить его в 1х PBS. Хранить при 4 ° С и использовать в течение 1 недели. Решение БСА имеет тенденцию быть зараженным, если хранить в холодильнике в течение более длительных периодов времени. Альтернативно, раствор BSA может быть аликвоты и замораживали при -20 ° С в течение длительного хранения. Избегайте циклов замораживания-оттаивания.
  10. Приготовление раствора для восстановления клеток (CRS): Сделайте 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ванадата натрия (Na <суб> 3 VO 4) и 1,5 мМ фторид натрия (NaF) решение в 1x PBS. Стерильный фильтр и хранить при температуре 4 ° С до 6 месяцев.

3. Встроенный 3-D Культура доброкачественных и злокачественных клеток человека BM

  1. Очищают первичные мононуклеарных клеток BM на Ficoll-Налет градиентного центрифугирования в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Необязательный шаг: клетки могут быть помечены 0,25 мкм карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидиловым эфиром (CFSE) в соответствии с инструкциями изготовителя следовать пролиферацию клеток в течение всего периода культуры.
    Устранение неполадок: Если клетки умирают после окрашивания CFSE, титрование количество CFSE как концентрация зависит от типа клеток; 0,25 мкм хорошо работает для первичных мононуклеаров BM.
  2. Добавить 65 мкл раствора REND в каждую лунку тканевой культуры обрабатывали пластины 48-луночного. Распространение решение равномерно покрыть всю поверхность колодца и инкубировать> 30мин при комнатной температуре.
  3. Подготовка суспензии клеток при плотности 0,5 × 10 6 клеток в 10 мкл 1х PBS на лунку 48-луночного планшета. В 1,5 мл трубки микроцентрифужных смешать клеточной суспензии с 100 мкл УКР матрицы на лунку. Смешайте клетки и УОР матрицу, осторожно пипеткой вверх и вниз; избежать введения пузырьков. Хранить клеток / матрицу смесь на лед, чтобы избежать гелеобразования матрицы.
    Примечание: система УОР полностью масштабируемым, чтобы настроить систему в формате не-48-а, корректировать суммы всех реагентов (матриц и средних) на основе площади поверхности пластины, используемой. Шкала количество клеток в быть покрыты соответствующим образом.
  4. Аспирируйте оставшиеся Ренд и добавьте клеток / матричную смесь, в центре хорошо. Быстро, распространять клеток / матричную смесь, чтобы покрыть всю поверхность скважины равномерно. Место пластины в течение 30-60 мин в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе культуры ткани, чтобы матрица затвердеть. Не трясите и не расTurb пластину во время инкубации.
    Поиск и устранение неисправностей: Для предотвращения неравномерного распределения клеток в УОР, хорошо перемешать до посева. Смешайте после каждого 5-й и покрытием, чтобы избежать клеток располагающиеся на дне пробирки. После покрытием, клетки не опускаются на дно скважины благодаря поверхностному натяжению в матрице.
    Поиск и устранение неисправностей: Для предотвращения неравномерного распределения клеток в УОР, хорошо перемешать до посева. Смешайте после каждого 5-й и покрытием, чтобы избежать клеток располагающиеся на дне пробирки. После покрытием, клетки не опускаются на дно скважины благодаря поверхностному натяжению в матрице.
  5. Prewarm BMGM на водяную баню устанавливается на 37 ° С
  6. Через 30 мин, проверьте, что матрица установил правильно; он образует мягкий гель, как слой, который не перемещается, когда пластина наклонена. Наложение клеток / матричный слой 1 мл теплой BMGM. Чтобы избежать образования трещин на матрицы пипетки среднего очень мягко (дозирования падение за каплей), используясерологические пипетки. Поместите собранный УКР культуры в 37 ° С, 5% СО 2 культуре ткани инкубатора и культуры для требуемого периода времени.
    Примечание: жизнеспособность клеток сохраняется в течение не менее 30 дней, не меняя среду; если требуется среда изменение изменить только 50% от среды каждый раз.
    Критический шаг: Очень важно, чтобы среда не холодно, как холодная температура может нарушить уже установленный матрицу. Будьте осторожны, не шприц среды в верхней части матрицы в это может нарушить мягкую матричного слоя.
    Устранение неполадок: Если жизнеспособность клеток в системе УКР низкий, плотность клеток, возможно, придется быть определена экспериментально при работе с другими, чем первичные мононуклеарных клеток из BM аспиратов клеток. При работе с клеточными линиями, уменьшение числа клеток в 10 раз, как иммортализованных клеточных линий размножаться быстрее, чем первичные клетки.

4. 'В-матрицы' изображений

  1. Световая микроскопия
    1. Изображение культивируемые клетки непосредственно в УОР, используя яркий поле, дифференциальный интерференционный контраст (DIC), конфокальной или любые другие методы визуализации, которые позволяют дальней изображений как матрица имеет толщину около 1 мм. Используйте функцию Z-Stack доступны на многих из микроскопов к изображению всю культуру сверху донизу.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
    Совет: Для протокол иммуноокрашивание ниже избежать аспирации окрашивание / моющих растворов, а наклонять тарелку и снимите решения с помощью пипетки.
    1. Снимите BMGM с помощью пипетки и мыть 2-3x 100 мкл / стирки / а РТ 1x PBS. Убедитесь, что достаточно PBS используется, чтобы покрыть всю поверхность скважины.
    2. Исправить клетки в матрице путем добавления 100 мкл / лунку (для 48-луночного планшета) 10% NBF в течение 15 мин при комнатной температуре. Удалить НСБ и промыть клетки дважды 100 мкл / стирки / а РТ 1x PBS.
      Примечание: Избегайте использования холодной НСБ, как это может разжижения матрицу.
    3. Удаление PBS, добавляют 1% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре или при 4 ° С в течение ночи, чтобы блокировать неспецифического связывания антител.
    4. Подготовка основной раствор антител в 1% BSA при требуемой разбавления. Разведение будет разным для каждого антитела, обратитесь к производителю или титрование для определения оптимальной концентрации антител. Добавить 100 мкл / лунку раствора первичного антитела и инкубировать в соответствии с инструкциями изготовителя.
      Критический шаг: Все инкубации с участием антител, конъюгированных с флуорофорами или флуоресцентных красителей должны быть выполнены в темноте.
    5. Удаление раствора первичного антитела и промыть 3 раза с 1x PBS в течение 5 мин.
    6. Для непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания, инкубировать с вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцентного зонда в течение 1 ч при комнатной температуре. Развести антител в 1% BSA в концентрации, предложенным производителем.
    7. Снимите вторичный Antibody решение и промыть 3 раза с 1x PBS в течение 5 мин.
      Поиск и устранение неисправностей Во избежание высокий фон во время съемки, титрование флуоресцентно сопряженных вторичными антителами и использовать самую низкую концентрацию, обеспечивающей должную сигнал. Если высокий фон по-прежнему является проблемой, увеличить количество и продолжительность стадий промывки, или использовать непосредственно сопряженных первичных антител, и пропустите шаг 4.2.6.
    8. Чтобы окрасить ядра добавьте 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) ядерного красящего раствора, при разведении, предложенном производителем, и выдержать в течение 7-10 минут при комнатной температуре.
    9. Удалить решение ядерной окрашивания и мыть 2 раза с 1x PBS в течение 5 мин.
    10. Снимите PBS от последней промывки и добавить каплю монтажной среды (регулярное множество), по образцу сохранить флуоресценции. Изображение с помощью соответствующих настроек возбуждения / эмиссии на флуоресцентной или конфокальной микроскопии.
      Примечание: изображений должно быть сделано в течение 2 дней окрашивания, чтобы избежать деградации матрицы и потери целостности RBM и потери флуоресцентного сигнала. Если не отображены немедленно, окрашенные образцы не должны храниться при температуре 4 ° С в защищенном от света, пока визуализации.

5. Выделение клеток из RBM

  1. Удалите среду осторожно, не нарушая матричного слоя. Не аспирации.
  2. Вымойте клетки 2x стерильной 1x PBS. Не аспирации.
  3. Добавить 0,5 мл ледяной CRS в каждую лунку и удалить весь матричный слой вместе с клетками, энергично пипетки вверх и вниз. Соберите клетки, матрицу и CRS в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Поместите на льду.
  4. Добавить еще 0,5 мл CRS в той же скважине и собрать все оставшийся материал. Переезд в то же трубки микроцентрифужных.
  5. Vortex смесь клеток, матрицы и CRS и инкубировать на льду в течение 1 часа. Вихревые клетки каждые 15 мин, чтобы облегчить освобождение от матрицы.
  6. Проверьте смеси после 1 часа, без видимых комковматрицы должны присутствовать.
    Устранение: если комки матрицы все еще ​​видимы через 1 час, передача клеток / матрица / CRS смесь в большую пробирку, добавить дополнительные 2-5 мл CRS, и инкубируют в течение дополнительного 30-60 мин.
  7. Центрифуга клетки в CRS в 1000 оборотов в минуту в течение 5-10 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл холодного PBS 1x.
  8. Центрифуга при 1000 оборотов в минуту в течение 5-10 минут и удалите супернатант. Повторите стирке PBS еще раз.
  9. Второй PBS мыть завершения восстановления клеток из матрицы и изолированных клеток могут быть использованы в любых последующих приложений, таких как выделения ДНК / РНК / белок, проточной цитометрии, виво трансплантации, и т.д..

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поскольку клетки первичной костного мозга не в состоянии размножаться в стандартных условиях культивирования тканей, система УОР был создан, чтобы точно имитировать костную микросреду, обеспечивая систему культуры и расширить BM клетки экс естественных. Основными компонентами внеклеточного матрикса, BM, фибронектин, коллаген I, коллаген IV, ламинин и 21, были включены в УОР матрицы, чтобы обеспечить структурную каркас в этом 3-D культуры. Эндосте, интерфейс между костью и Б.М., богатой коллагеном I и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель RBM представляет собой завершенную систему, где клеточный состав БМ поддерживается Экс Vivo на срок до 30 дней. BM клетки, выращенные в RBM само-стратификации в соответствии с их функция тесно имитируя архитектуру BM найдено в естественных условиях. Кроме того, это первая система, которая позволяет для расширения множественной миеломой клона 8. Наиболее важные шаги для обеспечения устойчивого роста БМ клеток и общий успех культуры являются: 1) для получения здорового населения клеток ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют никакого конкурирующие интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась за счет грантов от Национального института здравоохранения, Национальный институт рака (1R21CA141039), BD Biosciences Research выдаче гранта, Американское общество рака институциональных исследований Грант (IRG # 58-006-53), в Purdue University Центра Рака Исследования и канадские Институты Исследования Здоровья и научно-исследовательских инициатив Программы Альберта совета Рак. Депутат при поддержке Национального института здравоохранения, Национальный институт рака, профилактики рака программе стажировки (R25CA128770; PI: Д. Teegarden) в ведении онкологического Центра Наук и Научно-исследовательский центр Discovery обучения в Университете Пердью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для пролиферации CellTrace CFSE для проточной цитометрииInvitrogen/Life TechnologiesC34554
Фибронектин из плазмы человекаMilliporeNG1884448
Ficoll-Paque PLUSGE Lifesciences17-1440-02
Матрикс базальной мембраны MatrigelBD Biosciences354234
Коллаген крысиного хвоста типа IBD Biosciences354249Коллаген I из Millipore не полимеризуется должным образом при использовании этого протокола
VECTASHIELD монтажная среда для флуоресценции (обычный набор)Vector LaboratoriesH-1000
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX таблеткиSigma-AldrichF4648Для окрашивания TRAP
SigmaFast BCIP/NBT таблеткиSigma-AldrichB5655Для окрашивания щелочной фосфатазой
Конфокальный микроскоп Zeiss LSM 510 Программное обеспечение Carl Zeiss
Zeiss 510Carl ZeissПрограммное обеспечение для конфокального анализа
Zeiss Axiovert 200M инвертированный микроскоп Программное обеспечение Carl Zeiss
MetaMorphМолекулярные приборыПрограммное обеспечение для анализа изображений для Axiovert 200M
FACSort проточный цитометр Программное обеспечение BD Biosciences
CellQuest Pro BD BiosciencesПрограммное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии
Программное обеспечение для анализа изображений

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
  2. Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
  3. Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
  4. Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
  5. Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
  6. Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
  7. Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
  8. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
  9. Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
  10. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
  11. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
  12. Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
  13. Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
  14. Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
  15. Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
  16. Gartner, S., Kaplan, H. S. Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).
  17. Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
  18. Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
  19. Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
  20. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
  21. Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи