Использование Microfluidics фишки для живых изображений и изучения ответов травм в Дрозофилы Личинки

Краткое содержание

Личинок дрозофилы являются привлекательным модельной системой для живого изображения из-за их полупрозрачной кожицей и мощных генетики. Этот протокол описывает, как использовать в PDMS устройство однослойный, называемый 'личинка чип "для живого изображения клеточных процессов в нейронах ^3-й возрастной стадии личинок дрозофилы.

Аннотация

Онлайн изображений является важным методом для изучения биологических процессов клеток, хотя это может быть сложным в живых животных. Полупрозрачный кутикула личинки дрозофилы делает его привлекательным модельным организмом для живых визуальных исследований. Тем не менее, важной задачей для живых методов визуализации является неинвазивным иммобилизации и позиционировать животное на микроскоп. Этот протокол представляет собой простой и легкий в использовании метод иммобилизации и отображения личинок дрозофилы на полидиметилсилоксана (PDMS) микрофлюидных устройства, которое мы называем "чип личинка". Чип личинка состоит из плотного облегающие PDMS микрокамере, который прилагается к тонкой покровного стекла, которое, по заявлению вакууме с помощью шприца, обездвиживает животное и приносит брюшной структуры, такие как нервной цепочки, сегментных нервов и тела стены мышцы, в непосредственной близости от покровного стекла. Это позволяет для изображений с высоким разрешением, а главное, позволяет избежать использования ЭНАsthetics и химических веществ, что облегчает изучение широкого круга физиологических процессов. Так как личинки восстановить легко от иммобилизации, они могут быть легко подвергнуты нескольких сеансов обработки изображений. Это позволяет продольных исследований с течением времени курсов колеблется от нескольких часов до нескольких дней. Этот протокол описывает шаг за шагом, как подготовить чипа и, как использовать микросхему для живого изображения нейронных событий в ^3-й возрастной стадии личинок. Эти мероприятия включают в себя быстрое продвижение транспортов с органелл в аксонов, ответов кальция травмы, а покадровой исследований торговле фото-кабриолет белков на большие расстояния и временных масштабах. Другое применение чипа является изучение регенеративные и дегенеративные ответов на аксонов травмы, так что вторая часть этого протокола описывает новый и простой процедуры за причинение вреда аксоны в пределах периферических нервов с помощью сегментной нерва давки.

Введение

Плодовая муха, дрозофилы, была использована в качестве модельного организма для более чем 100 лет, и доказал важную роль в определении фундаментальной сигнализации и путей развития, которые являются консервативными от беспозвоночных к человеку. Онлайн изображений является важным подход к изучению клеточных механизмов, а также простой план тело и полупрозрачные кутикула личинки дрозофилы делает его привлекательным система для живого изображения, особенно, так как есть много генетических инструментов, доступных для выражения дневно с тегом белков в специфические типы клеток.

Важной задачей для живых методов визуализации является неинвазивным иммобилизации и позиционировать животное для микроскопии. Традиционные подходы включают иммобилизации рассечение ^1,2 или использование хлороформа, оба из которых убить животное. В анестетики эфир ⁴ и изофлуораном ^5-8 также использовались. В то время как анестетики имеют много преимуществ, Они также тормозят нервную деятельность и важную физиологию (включая сердцебиение) ^9-11, следовательно, может повлиять на процесс изучал и создать нагрузку на животных. Есть также проблемы безопасности человека для работы с эфиром и изофлуораном.

Мы разработали метод, свободного от наркотиков, чтобы обездвижить личинок дрозофилы в один слой PDMS микрожидкостных устройств, который мы называем «личинка чип ^'12. Этот протокол описывает, как получить или сделать чип личинка, и как использовать его для живого изображения в ранней постановке ^3-м возрастной стадии личинок. Чип состоит из плотного облегающие микрокамеры, который при приложении вакуума с помощью шприца, удерживающую животное через нежной механической силы. Метод иммобилизации приносит брюшной структуры, такие как нервной цепочки, сегментных нервов и тела стены мышц, в непосредственной близости от покровным стеклом. Это позволяет высоким разрешением таких структур с высокой числовой апертурыамплитуды (большом увеличении) цели.

Преимущества чип личинки над другими традиционными методами, включают следующее: (я) использование чипа личинки заменяет использование химических веществ, что позволяет в естественных изображений наркозу животных. (II) Личинки восстановить сразу после освобождения из чипа (в отличие от периода восстановления с 2 часами для изофлуораном ^8,13). Это позволяет для работы с изображениями с широким охватом временных масштабах, начиная от миллисекунд до нескольких минут, до нескольких часов и дней. (III) Использование PDMS, который представляет собой проницаемый материал газа, дает возможность для непрерывного диффузии кислорода / воздуха из окружающей среды в организм личинки. (IV) чип просто и удобно в использовании, и (V) его можно использовать повторно, и может быть изготовлен при минимальных затратах.

В дополнение к инструкции по использованию чипа личинка, этот протокол приведу несколько примеров ее использования для изучения нейронных событий в ^3-й возрастной стадии личинок. К ним относятся Живая съемка Axonaл транспорт, ответы кальция травмы, а покадровой исследования торговле фото-кабриолет белков на большие расстояния и временных масштабах.

Другое применение чипа является изучение нейронных ответов на аксонов травмы. Для этого дополнительный процедура описана (в части 3) за причинение вреда аксоны в пределах периферических нервов с помощью сегментной нерва давки. Этот простой анализ может выполняться как быстро и воспроизводимо при стандартной диссекции стереомикроскопа, что позволяет в течение многих животных, чтобы быть обработаны одновременно. Сотовые ответы на травмы могут быть изучены живого изображения в чипе личинки.

Протокол

1. Создание PDMS Чип

Чтобы сделать чип PDMS от SU-8 плесени, выполните шаги 1.1-1.7. Если чип под рукой, но нуждается в собранном для использования, перейдите к шагу 1.8.

1. Смешайте 45 г PDMS базы и 4,5 г отвердителя (соотношение 10:1) из комплекта PDMS в небольшой пластиковый контейнер одноразового и смешивать их тщательно с помощью пластикового перемешать палочкой.
2. Поместите контейнер в вакуумном контейнере (например эксикаторе) в течение 10 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха.
3. Поместите СУ-8 плесень в нижней части 150 мм в диаметре пластиковую чашку и медленно вылейте смесь PDMS на форме. Будьте осторожны, не для образования пузырьков в то время заливки PDMS.
4. Вылечить PDMS в духовке (или инкубатор) при 650 ° С в течение 4 часов.
5. Снимите вылечить PDMS/SU-8 формы из духовки и дайте ему остыть в течение нескольких минут.
6. Использование лезвие, вырезать вылечить PDMS вдоль края СУ-8 формы и отсоедините его от СУ-8 плесени.
7. Разделите PDMS плитув отдельных PDMS чипов с использованием лезвия бритвы.
8. Использование дозирования иглы 21 G, ткнуть отверстие в вакуумной порт (изображенный на рисунке 1а) чипа PDMS.
9. Возьмите дозирования иглу 23 G и крутить кончик иглы из своей базы несколько раз сломать иглу предупреждать от ступицы блокировки.
10. Вставьте кончик иглы 23 G в небольшой кусок полиэтиленовой трубкой, так что трубка охватывает по меньшей мере на миллиметр иглы. Затем используйте лезвие, чтобы сократить избыток трубки от иглы. Это создает пластиковое кольцо вокруг одного конца иглы, который будет создавать уплотнение, когда вставляется во впускной порт вакуум.
11. Для использования с инвертированным микроскопом (фиг.1В и 2A-B): вставить кончик иглы 23 G в отверстие вакуумного порта. Для использования с использованием вертикального микроскопа (рис. 1C и 2C-D): совать второе отверстие на боковой стороне чипа PDMS с 21 г dispensing иглу; это отверстие будет предоставлять доступ к первой лунке со стороны. Затем вставьте кончик иглы 23 G с трубки кольца в боковое отверстие. Место кусок двухсторонней ленты на верхней части чипа PDMS, чтобы запечатать верхнее отверстие (рис. 1в).
12. Возьмите кусок полиэтиленовой трубки, которая составляет примерно 20 см в длину. Подключение одну сторону трубки с наконечником, который вставляется в вакуумное отверстие иглы.
13. Подключите другую сторону трубки к одному из портов на 3-ходового клапана (см. '3-ходовой кран "в списке материалов)
14. Присоединить 20 мл шприц в одну из двух остальных портов. Последний порт открыт для окружающей среды.

2. Использование личинка Chip для живых изображений

1. Очистите чип PDMS с прозрачным скотчем. Присоединить кусок ленты в нижней части чипа. Убедитесь, что лента трогает всю поверхность PDMS, а затем снимите пленку.
2. Повторить операцию 2-3x, чтобы убедиться,нет частиц или масло (нераспределенная из предыдущих экспериментов) на поверхности чипа PDMS. Поскольку чип PDMS можно использовать повторно, то очень важно, чтобы удалить остатки масла, поскольку это может повлиять на адгезию к стеклу PDMS и привести к недостаточной герметизации.
3. Трансфер рано (т.е. нагула) ^3-й стадии личинок в чашку Петри, содержащей воду. (Фуражировка ^3-й возрастной стадии стадии личинки находятся в пище, а не на стороне флакона культура). Промыть личинок в воде для удаления культуральной среды.
4. Возьмите чистую стеклянную покровное и поместите небольшую каплю Галокарбоновое 700 нефти в его центре.
5. Использование щипцов, мягко забрать чистый, раннего поставил ^3-й возрастной стадии личинки из воды (личинка должна быть ~ 3,5-4 мм в длину). Место животное кратко на легкий уничтожить или бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю воду, а затем поместить его на падение нефти. Падение должно быть достаточно малым, чтобы трахеи личинок не покрыты. Пусть личинка STAу на падение нефти в течение 10 сек.
6. Снимите личинку из выпадающего нефти, а затем поместить его на чистую покровного стекла.
7. Трансфер личинку в другую чистую стеклянную покровное. Этот шаг снимает излишки масла.
8. Обратите внимание на ориентации личинки. Для визуализации нейронных мозга и сегментарные нервы, брюшная сторона личинки должны сидеть на покровное. Его спинной стороны, характеризуется двумя продольными трахеи труб, должна быть обращена вверх. Примечание: это ориентация личинка предпочитает естественно.
9. Аккуратно поместите чип PDMS поверх личинки. Личинка должны быть приведены в соответствие центральной середине микрокамере, с его хвостом, ориентированной на вакуумной порт. Будьте осторожны, что личинка не прикасайтесь к краям камеры. Это особенно важно для передней и задней трахеи терминалов. Примечание: этот шаг лучше всего делать под стереомикроскопом.
10. Нажмите на чип PDMS против покровным стеклом, чтобы добиться хорошего уплотнения. Убедитесь, что личинка полностьюзаключены микрокамере когда чип PDMS соприкасается стеклянную покровное.
11. Переключите 3-ходовой клапан на такие, что шприц можно сделать воздух из микрокамере PDMS (через трубопровод), чтобы создать вакуум.
12. С одной стороны, провести чип PDMS / стекло покровное твердо. Используйте другую руку, чтобы вытащить поршень шприца. Вывод 2-2,5 мл воздуха, пока не почувствуете сопротивление в ручке шприца, чтобы создать вакуум. Вакуум создает герметичное уплотнение между чипом PDMS, нефти и покровное интерфейсов и ограничивает подвижность личинки.
13. Переключатель клапана с такой, что чип PDMS изолирован от шприца и от окружающей среды. В результате, относительно стабильный уровень вакуума поддерживается в микрокамеры без необходимости проведения поршень шприца.
14. Проверьте личинку под стереоскоп, чтобы убедиться, что все тело животного помещается внутри микрокамере, и что животное неподвижным. Трахеи должны быть видны. ОстальныеЧип PDMS должны быть в контакте с покровным. Примечание: см. рисунки 2E и 2F примеры животных правильно, иммобилизованных на чипе. Некоторые неправильные ориентации показаны на рисунках 2G и 2H.
15. Поместите личинка чип (чип PDMS + стекло покровное) на микроскопе. Чип личинка, насосно-компрессорные и шприц следует обращаться осторожно, чтобы избежать отряд чипа PDMS от покровного стекла. Для прямой микроскоп, исправить "главного" сторону чипа к столике микроскопа с двухсторонней ленты (рис. 1в).
16. Используйте с большим увеличением цель (масло-погружение, 40-63X рекомендуется), чтобы найти структуру (ы) животного интереса и выполнить визуализацию. В некоторых случаях более низком увеличении могут быть необходимы, чтобы определить нужную область для визуализации перед переключением на более высоком увеличении.
17. При визуализации завершена, отпустите вакуум путем переключения клапан в положение, которая открыта для окружающей среды.
18. Снять чип PDMS от покровного стекла. Личинка должны быть немедленно подвижны.
19. Используйте пинцет, чтобы удалить личинку от микрокамере и осторожно положите личинку на виноградных соков агаром для восстановления.

3. Склонение нерв раздавить повреждение личинок Сегментные Нервы

1. Выполните шаг 2,3 выше, чтобы изолировать рано поставил ^3-е стадии личинок нужного генотипа. Как описано в шаге 2,3 ванну личинок в воде, чтобы удалить пищу.
2. Используйте стандартный муха CO ₂ обезболивания станции, с CO ₂ колодки держать под рассечение стереомикроскопом, покорить личинок. Личинки должны стать неподвижны после размещения на CO ₂ площадки для 1-2 мин.
3. Теперь поместите один наркозом личинку на виноградный сок агаром под стереомикроскопа. Поверните животных брюшной стороне до визуализации брюшной нервной и сегментарной нервы через кутикулу ( рис. 3). Убедитесь, что личинка полностью неподвижны.
4. Использование Dumostar число-5 щипцов, щепотку сегментарные нервы плотно через кутикулу в течение 5-10 сек. Когда это будет сделано правильно, кутикула остается неизменным, и стена тело не пронзили. Примечание: травма можно проводить при различных положениях вдоль передне-задней оси тела, пока брюшной нервной, слюнных желез и кишечника, не повреждены. Наиболее эффективным расположение травма в конце ^3-го сегмента в животе, как показано на рисунке 3D. Травмы в этом месте повреждений большинство нервов и является самым простым, чтобы воспроизвести, не убивая животных.
5. После травмы, поверните животное так, чтобы его брюшная сторона вниз на виноградной пластины. Он должен быть в состоянии двигать головой и съесть. Если травма была успешной, то задняя половина личинки будет парализована.
6. Держите раненых животных на виноградного сока агаром при 25 &# 176; C в течение интервала времени в соответствии с экспериментальной целью. Для мотонейронов, ближний пень начинает прорастать в пределах 8-10 часов травмы ^14, а дальний пень начинает вырождаться в пределах 6-8 часов ^15. Для класса IV-да-сенсорных нейронов, ближний пень начинает прорастать в пределах 4-6 ч и дистальной начала пень вырождаться в 3-4 ч после травмы. Примечание: с соответствующими драйверами Gal4 и флуоресцентных журналистами, прорастание и вырождения можно наблюдать в чипе личинки (например, см. рисунок 6).

Результаты

Чип личинка состоит из одного слоя PDMS блока, (чип PDMS), конструкция которого описана в схеме на рисунке 1. (См. также дополнительный файл DXF для создав собственную форму). Личинка микрокамера, вакуумный порт и по периметру каналы (рис. 1А) 140 мкм углубления в чипе PDMS. Чип расположен на вершине рано поставил ^3-й возрастной стадии личинки, которая опирается на вершине покровного маслом (фиг.1В и 1 С). Масло стекла интерфейс между покровным и чип PDMS позволяет печатью, которая будет создана при приложении умеренного вакуума. Эта печать ловушки личинки внутри камеры, и с начала поставил ^3-й возрастной стадии личинка немного толще, чем камеры, уплотнения камера создает некоторую физическую сужение на животное, эффективно иммобилизации и ограничения его движения. В этом иммобилизованным государства, уверен вентральнойструктуры тела, такие как брюшной нервной и сегментарной толкнул близко к покровное. Это выгодно для обработки изображений, так как в иммобилизованным состоянии эти структуры могут лежать в пределах рабочей дистанции 40X и 63X целей. После вакуум снимают, личинка может быть легко удалена из микрокамеры, позволяя дополнительные эксперименты должны быть выполнены. Это чисто механический подход иммобилизация может держать 90% личинок живой после непрерывных периодов иммобилизации до 1 часа ^12.

Вакуум создается с помощью простого 20 мл шприц, следовательно, весь блок легко перевозить от стереомикроскопом, где позиционирование в камере осуществляется, в конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопом, где осуществляется жить изображений. Шприц соединен с вакуумным портом через трубы из полиэтилена и 23 г дозирования игл (с замком узлов удалены), как описано в шагах 1.6-1.14. Для инвертированных микроскопов, трубкии шприц соединены через верхней части чипа (фиг. 1B, 2A и 2В). Для вертикальных микроскопов, они связаны через порт на стороне чипа (рис. 1с, 2с, и 2 D). Конфигурация для инвертированных микроскопов несколько проще в использовании. Шприц вытащил создать нежный вакуум (примерно 10 фунтов на квадратный дюйм), который связывает интерфейс масло-стекло-PDMS, чтобы сформировать герметичность между покровного стекла и устройства PDMS, пушной промысел и иммобилизации личинку в камере.

Размещение личинки в микрокамере (шаги 2.7-2.10 в протоколе) имеет решающее значение для эффективного иммобилизации и выживания (рис. 2E-H). Если животное слишком велик для камеры, (рис. 2G), или если его руководитель или трахеи стать поймали между краем камеры и обложкахгуба (рис. 1H), то маловероятно, чтобы выжить процедуру.

Ниже приведены несколько примеров использования личиночной чип для изучения различных клеточных реакций в нейронах (рис. 4-7, Movie S1 и Movie S2).

Изображений быстрого аксонального транспорта: Чип личинка был использован для изображения кинезин-опосредованного транспорта синаптических везикул в отдельных периферических аксонов (рис. 4 и Movie S1) антероградная (~ 1,0 мкм / сек) и ретроградный (~ 0,8 мкм / сек. ) движение этих пузырьков могут быть легко изучены из фильмов, собранных на вращающийся диск конфокальной микроскопии.

Позиционирование животное для лазерной микрохирургии:. Сенсорный нейрон дендритов пересекали помощью лазера импульсный УФ красителя (рис. 5 и фильм S2) Протоколы для использования тего метод для микрохирургии может быть найден в другом месте ^16,17. Эффективный метод иммобилизации позволяет быстрое время масштабных изменений в пострадавшей нейрона, такие как изменения в внутриклеточного кальция (обнаруженных генетически закодированного Ca ^{2 +} индикатор GCamp3.0 ^18), чтобы обнаружить и измерить (рис. 5).

Изучение регенеративных и дегенеративных ответов на травмы: Если животное оставляют на период между сессиями изображений, чип личинка затем быть использованы для изучения клеточных событий, которые происходят в широком диапазоне временных масштабов. Например, и "регенеративный 'и дегенеративные ответы на аксонального повреждения, которые проходят через масштабе времени 15 ч, могут быть отображены в чипе личинки (рис. 6). В этом примере, аксоны octopaminergic мотонейронов были ранены через сегментной нерва давке (рис. 3), описанной в части 3 протокола. Проксимальный аксона пень,который проходит новый прорастание и дистальные аксоны, которые образуют варикоз, а затем фрагментируются в процессе дегенерации валлеровский, могут быть отображены и изучены через разные промежутки времени после травмы.

Отслеживание photoconvertible флуоресцентные белки с течением времени в естественных условиях: Развитие photoconvertible флуоресцентных белков, чьи флуоресценции необратимо меняется под воздействием УФ-излучения) позволяет одним специально маркировать подмножество белков в клетке, а также отслеживать судьбу меченых белков с течением времени ^{19 , 20.} Этот метод обычно проводится в клеточной культуре, однако, с чипом личинки можно отслеживать генетически закодированные photoconvertible белков в определенных клетках в естественных условиях. В качестве примера мы покажем, что Denda2-α-тубулина слитый белок, выраженное в класс IV-да-сенсорных нейронов, может быть photoconverted в клеточных тел (7А и В). Транспортный из photoconverted белков может прослеживаться в течение долгого времени: в течение двух дней мы могли обнаружить значительное количество photoconverted белка в аксонов терминалов сенсорных нейронов, которые лежат ~ 1 мм от первоначального расположения в теле клетки (рисунки 7А и 7 ° С).

Все описанные примеры (рис. 4-7 и фильмы S1 и S2) были обследованы с помощью конфокальной системы вращающийся диск, состоящий из сканера Нипков CSU10 и EMCCD камеры C9100-50, установленный на Axio Observer с 63x (1.5 NA) масло цель, и отвезли с помощью программного обеспечения Volocity приобретения.

Рисунок 1. сильные> Схема мультфильмы для использования чип личинки.
(А) Чип личинка состоит из чипа PDMS, указанной в светло-голубой, присоединившихся к покровным стеклом. Чип содержит 140 мкм микрофлюидных каналов, указанных в белом. Центральный микрокамера предназначен для плотно входить рано поставил ^3-й возрастной стадии Drosophila личинка (cartooned светло-зеленым цветом). DXF файл, содержащий точные размеры, которые можно использовать для разработки формы предоставляется в качестве дополнительной информации. Шкала бар = 1,5 мм. (BC) Побочные виды схем для загрузки личинку в чип личинки. Личинка сидит вентральной стороной на покровное, и его тело лежит в глубокой микрокамере 140 мкм. 20 мл шприц соединен с впускным портом и вакуум используется, чтобы вызвать нежный вакуум. Масло-PDMS-стекло интерфейс Галокарбоновое связан вакуума в тугой печатью, которая ограничивает личинку в микрокамере. Эта печать легко обратимыпутем сброса давления из шприца, после которой животное немедленно восстанавливает подвижность. Для вертикальных микроскопов (В), шприц вакуумный подключен через полиэтиленовые трубки-50 от верхней части чипа. Для инвертированных микроскопов (C), эти соединения выполнены со стороны чипа, в то время как "сверху" чипа крепится к столике микроскопа с помощью двухсторонней ленты.

Рисунок 2. Изображения PDMS чипов и правильного позиционирования личинки.
(AD). Фотографии, показывающие PDMS чипы для перевернутых и вертикальных микроскопов. G наконечник иглы дозирующий 23 был вставлен в вакуумной порта, который обеспечивает подключение через трубки в вакууме (шприца). Шкала бар = (EH) 1.5 мм.. Drosophila. Е и F показаны примеры правильно иммобилизованных животных. Чем меньше животное в F является предпочтительным, если несколько изображений в течение длительных временных шкал (> 12 ч) будет проводиться. G показывает животное, которое является слишком большим, и H показывает небольшое животное, которое неправильно расположенный. Шкала бар = 1,5 мм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3. Нерв давка травмы сегментарных нервов в личинок дрозофилы.
(А) Мультфильм нервно раздавить анализа. В сегментные нервы в пределах ^3-го (B) Вид личиночной нервной системы от животного расчлененный 20 часа после нервного давки. Иммуноокрашивание для мембран нейронов с анти-HRP антител (красный) выделяет доли головного мозга, брюшной нервной и длинные сегментарные нервы, которые содержат мотонейроном и сенсорного нейрона аксоны. Подмножество отдельных мотонейронов помечены запуска экспрессии UAS-mCD8-GFP (зеленый) с водителем m12-Gal4. Сотовые органы и дендриты из этих нейронов лежат в брюшной нервной, а их аксоны проецируются в тела стены мышц через сегментарных нервов. (Этот драйвер также приводит GFP выражение в мышцах 12 для каждой личиночной hemisegment, которые вместе могут рассматриваться как передне-задней полосы на обе стороны от животного). В регионе повреждены давке подсвечивается голубыми пунктирными линиями. Шкала бар = 70 мкм. (С) Закрыть вид на поврежденных аксонов, 20 часов после травмы. Слева:проксимального Аксон претерпела прорастания и новый рост. Справа: дальний аксона фрагментирована, с небольшим GFP остальные, из-за валлеровский дегенерации и оформления мусора. Шкала бар = 10 мкм. (D) Изображения давке нерва в раннем ^3-м взрослой личинки. Красная стрелка указывает на брюшной нервной. Расположение на раздавливание по направлению к нижней части третьего сегмента, как описано в тексте протокола (Протокола 3). Изображения в D были первоначально опубликованы в J. Cell Biol 191, 211-223, DOI:.. 10,1083 (2010) Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4. Покадровый визуализации аксонов перевозки пептидергических синаптических пузырьков.крыса предсердного натрийуретического пептида АНФ с меткой GFP, UAS-ANF-GFP ^21, было выражено в конкретных мотонейронов с помощью драйвера накануне-АСР-Gal4 ^22. Живая съемка сегментных нервов показывает быстрый транспорт АНФ-GFP с надписью пептидергические пузырьки в аксонов. См. также Movie S1. (A) Одиночные кадры мотонейронов аксонов от живой покадровой обработки изображений. Зеленые, красные и синие стрелки показывают примеры антероградная, стационарные и ретроградные пузырьки, соответственно. Шкала бар = 5 мкм. (') Отдельные временные рамки из фильма были объединены с помощью ImageJ. (В) кимограф генерируется из покадровой визуализации АНФ-GFP транспорта, был создан из коллекции отдельных кадров, охватывающих одну минуту Время визуализации с использованием 'Многократный кимографе' плагин для ImageJ ^23. (С) Количественное определение осредненных скоростей сегментных, которые были рассчитаны на склонах сегментированных следов в kymographs. Зеленая полоса изложец антероградная скорость сегментарный (п = 543) и синяя полоса представляет ретроградную скорость сегментарную (п = 548) пузырьков из 10 kymographs. (D) Количественная оценка плотности частиц. Плотность частиц измеряли по количеству антероградная (показан на зеленой полосе), стационарных (показано на красной полосой) и ретроградных (показано на голубой панели) частиц в 100 мкм длины аксона от 10 kymographs. Данные в этой фигуре были также опубликованы ранее в Ghannad-Резаи и др., PLoS One 7 (1), e29869 подборку:. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).

Рисунок 5. Использование чипа личинки лазерной микрохирургии и визуализации кальция.
Дендритов от сенсорного нейрона IV класса перерезают на с мощными лазерными импульсами от лазера на красителе импульсного УФ. Протоколы для использования этого метода для микрохирургии может быть найден в другом месте ^16. Эффективная иммобилизация в чипе личинки позволяет для быстрого изменения внутриклеточных уровней кальция для изученных живого изображения. В этом примере было высказано генетически закодированы индикатор кальция GCaMP3.0 в IV класса дендритов (C4da) сенсорных нейронов с помощью драйвера ППК-Gal4. (A) покадровой образы интенсивности GCaMP3.0 были ложными окрашены в соответствии с цветом шкала интенсивности, чтобы указать изменения в интенсивности в течение долгого времени. Отдельные кадры были взяты из покадровой фильма (Movie S2) отображаемого на вращающийся диск конфокальной микроскопии на 5 кадров / сек. (B) Количественная оценка динамики кальция в ответ на лазерной микрохирургии. Нормализованная изменение складка сомы GCaMP3.0 интенсивности флуоресценции (ΔF/F0) отдельных нейронов в зависимости от времени (п = 7, показаны серым цветом). Усредненный ΔF/F0 была представлена ​​в оранжевом. Наблюдался пик увеличение интенсивности GCaMP3.0 между 1-2 сек после травмы. Фон вычитали из сырого интенсивности флуоресценции G-CaMP3.0. Данные в этой фигуре были также опубликованы ранее в Ghannad-Резаи и др., (2012) PLoS One 7 (1):. E29869. DOI: 10.1371/journal.pone.0029869 ^12.

Рисунок 6. Изображений аксонов прорастания и дегенерации с помощью чип личинка. Представительства конфокальные образы проксимального пень (слева) и дистальной культи (справа) из octopaminergic мотонейронов аксонов в различные моменты времени после нервного давки. Изображения были приняты на подобных местах, как показано на рисунке 3C. Эти нейроны помечены вождения экспрессию UAS-mCD8-RFP трансгена с помощью TDC2-Gal4 водитель ^24,25. Клеточные тела этих нейронов лежат в брюшной нервной ^24. Три отдельные аксоны можно увидеть в пределах одного сегментного нерва, и легко решена друг от друга. Это идеальный случай для изучения отдельных клеточных событий, таких как фрагментации вырожденной аксонов, который завершается в течение 15 часов для этих нейронов. Изображения были получены из живых животных с использованием чип личинка на 63x увеличением на вращающийся диск конфокальной микроскопии. Масштабные бары = 10 мкм для левых панелей (проксимальных пни) и 20 мкм для правых панелей (дистальных пни). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 7. Использование личинкучип для отслеживания photoconverted флуоресцентные белки в течение длительного времени и расстояния в живых животных.
В этом примере, слитый белок из photoconvertible флуоресцентного белка Dendra2 ^19, слитого с α-тубулина, выражается с БАС-Dendra2-α-тубулина трансгена в IV класса дендритов (C4da) сенсорных нейронов, с помощью драйвера ППК-Gal4 ^26. (А) Схематическое для эксперимента фотопреобразования. Клеточные тела нейронов C4da лежат на периферии и расширить аксоны через сегментных нервов, чтобы сформировать синаптические терминалы в нервной цепочки. Dendra2-α-тубулина в подмножестве клеточных тел в задней половине животного подвергают фотопреобразования с помощью УФ-освещении в течение 6 сек с использованием стандартного DAPI фильтр с ртутными лампами (слева мультфильмов). После времени, photoconverted Dendra2-α-тубулина могут быть обнаружены в синаптических окончаний в брюшной нервной. Это указывает на то, что белок тубулин была переходамносил на большие расстояния (из ~ 1-2 мм). Шкала бар = 1 мм (В) Пример изображения Dendra2-α-тубулина в класс IV сенсорной тела нейрона клеток до и после фотопреобразования. Шкала бар = 5 мкм. (С) Пример изображения синаптических окончаний для класса IV сенсорных нейронов в любом 0 ч или 48 ч после фотопреобразования клеточных тел. Конкретный вид photoconverted Dendra2-α-тубулина в синаптических окончаний после времени подразумевает, что белок путешествовали из тела клетки к аксона конца. Фотопреобразования и изображений во всех временных точках проводилось в чипе личинки. Шкала бар = 15 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Фильм S1. Лазерная микрохирургия и визуализации кальция нейрона C4da. импульсный УФ лазер был использован для секут чопорнаяичных дендритных филиал. Лазерная рассечение индуцированной быстрое увеличение GCaMP интенсивности, которая началась в месте повреждения и поехал в теле клетки. Была выражена UAS-GCaMP3.0 ¹⁸ с помощью специальный драйвер C4da ППК-Gal4 ^26. Фильмы были ложными цветные указать относительные уровни интенсивностей GCaMP3.0. Покадровой обработки изображений был проведен с вращающегося диска конфокальной микроскопии со скоростью 5 кадров / сек.

Фильм S2. Быстрый аксонов транспорт АНФ-GFP в мотонейронов.
Было высказано крыса мерцательная натрийуретический пептид АНФ отмеченных GFP, UAS-ANF-GFP ²¹ в рамках конкретных мотонейронов с помощью драйвера накануне-АСР-Gal4 ^22. Перенос этих пептидергических пузырьков внутри личиночной нервов сегментных был сфотографирован на чипе личинки при 300 мс / кадр с помощью вращающегося диска конфокальной микроскопии.

Дополнительный Рисунок 1 (DXF файла)
DXF файла для кремния формы производства. Файл предназначен для негативного фоторезиста маски (темно подал маски для SU-8) на 4 дюйма кремниевой пластины. Второй ряд содержит 5 пресс-формы для изготовления личинка чипы, используемые в настоящем протоколе. Каждый из этих чипов (в строке 2) содержат ~ 5,4 мм х 1,5 мм камеру предназначен для установки на ранней стадии ^3-й возрастной стадии личинки. Первая строка (строка 1) содержит большее камеру (~ 5,4 мм х 2 мм), в то время как третий ряд (строка 3) содержит меньшую камеру (~ 4.4mm х 1,5 мм). Они могут быть использованы с личинками больших и меньших размеров, соответственно. Шкала бар = 2 мм.

Обсуждение

Создание или получение чип личинка:

Чип личинка состоит из PDMS блока (именуется «чип PDMS '), прикрепленной к покровным стеклом. Протокол на шаге 1 описывается процедура изготовления и использования личинка чипы, предполагая, СУ-8 плесень доступно. СУ-8 форма микроизготовленном по фотолитографически рисунка толстую СУ-8 слой фоторезиста 140 мкм на кремниевой пластины (подробнее см. Ghannad-Резаи и др.. ^12). Как микротехнологий из СУ-8 плесени требуется доступ к специализированным оборудованием, мы рекомендуем заказывать его из микротехнологий объекта (например,. Объект ЛНФ в Университете штата Мичиган ^14), или из литейных цехов, отправляя им дизайн микросхемы, которая предоставляется в качестве дополнительного файла. Если кто-то хочет изменить дизайн чипа PDMS (например, для использования с личинками различных размеров), САПР программное обеспечение, которое обрабатывает DXF файлов (например, AutoCAD) могут быть использованы. СУ-8 плесень также может быть сделано в доме, следуя инструкциям в Mondal др.. ²⁷ Многие читатели, возможно, будет удобно просто получить PDMS чип образца опробовать технику до изготовления собственные чипы. Это будет сделано в свободном доступе по запросу.

Использование микрожидкостной 'личинки чипе "для живого изображения:

Способ иммобилизации на чипе личинки избегает использования анестетиков, а вместо этого включает в себя давление, посредством применения вакууме, чтобы ограничить движение животного. В то время как животные могут выжить иммобилизации в чипе для нескольких часов ^12, более короткий период иммобилизации (5-15 мин) рекомендуется. Это достаточно времени для работы с изображениями многих клеточных событий, представляющих интерес, в том числе изменений в внутриклеточного кальция, или быстрой аксонального транспорта. Это также достаточно времени для желаемых манипуляций в живых животных, такие как лазерная основе микрохирургии, фотообесцвечивания и photoconverСион.

Для изучения событий в продольном направлении в течение более длительного периода времени в одном животном, животные могут быть размещены в чип и отображаемого несколько раз, разделенные периодами отдыха. Виноградный сок агаром идеально подходят для отдыха между сессиями изображений, так как они обеспечивают простой источник пищи и повышенной влажности. Несколько сессий визуализации влияют личиночной выживаемости до такой степени, так как каждая сессия несет в себе определенный риск для повреждения животное (см. часть 2 в устранении неполадок, ниже). Животные могут быть регулярно в образ> 5 раз в течение двух дней с выживаемости более 50%. Так как животные не под наркозом, они здоровы и подвижные сразу после освобождения вакуума в чипе. Там поэтому нет необходимости в время восстановления между сессиями изображений, так что расстояние между время между сессиями является гибкой и может быть скорректирована с целями эксперимента.

Поиск и устранение неисправностей:

Наиболее распространенным техническая являетсяподает в суд с чипом личинки и методы их решения являются:

(1) Животное движется слишком много. Слишком много мобильность может помешать целей визуализации. Наиболее распространенные причины для этого в чипе личинки являются) животное слишком мал для чипа, или б) применяется во время стадии иммобилизации вакуумного давления находится под угрозой. Чип личинка описано в данном протоколе предназначен для раннего поставил ^3-й стадии личинок. Оптимальный размер для животного является 3,5-4 мм в длину (вдоль передне-задней оси). Чтобы убедиться, что давление вакуума достаточно, тянуть шприцев 2-2,5 мл, или пока не почувствуете сопротивление в ручке. Одним из признаков, что вакуум работает в том, что небольшие пузырьки в канале периметра можно видеть медленно движется к источнику вакуума. Еще одним свидетельством является то, что покровное всегда должны путешествовать с чипом, когда чип подъема за верхнюю (и это рекомендуемый метод для транспортировки в камеруПосле того, как личинки позиционируется и вакуум включен). Вакуум может быть нарушена, если есть трещины в трубопроводе, или если есть нефть в трубе. Это можно легко решить путем замены 23 г дозирования кончик иглы и полиэтилен-50 трубки (от шагов 1.6-1.14).

(2) животное погибает после изображений в чипе. Эта процедура предназначена, чтобы вызвать минимальное напряжение на животное, и животные дикого типа генотипа имеют выживаемость> 90%, даже после часа иммобилизации на чипе ^12. Так как некоторые генотипы могут быть менее устойчивыми к стрессу чипа, сначала проверьте, что животных дикого типа (например, кантон S) выжить технику иммобилизации. а) Наиболее распространенной причиной для летальности является неправильное положение личинки (см. рис 2G-H). Если части кутикулы, головы или трахеи не совсем в камере, то они могут быть повреждены во время иммобилизации, иличинка, что слишком велико для чипа (> 4 мм) меньше шансов выжить. б) реже причиной летальности является использование слишком большого давления или вакуума при загрузке чип. При правильной установке в чипе, давление, создаваемое с помощью вакуума хорошо переносится. Однако избыточное давление, либо из вакууме или в начальной стадии позиционирования животное может быть проблемой. Лучше всего, чтобы узнать степень нажима, необходимого эмпирически испытаний с дикого типа личинок нужного размера. с) если слишком много Галокарбоновое масло охватывает трахею животного животное может потенциально иметь проблемы с долгосрочного выживания. Масло играет несколько важных функций в микросхеме: важно для создания вакуума, оптики во время съемки, и она противодействует высушивание в чипе. Однако чрезмерное масла следует избегать. (Это может также привести к нефти в трубопроводе и шприца, ущерба вакуум). Предложенные пальто протокол просто брюшной стороне личинки маслом, то гemoves излишки масла путем размещения личинки на чистую покровного прежде, чем перейти конечном покровного для работы с изображениями. г) фототоксичность можно испытать от изображений сессии. Как и в любой живой применения изображений, он идеально подходит для использования короткие сроки экспозиции с низкой интенсивности лазерного света, который лучше всего достигается с помощью высокочувствительного камеру или детектор. Постарайтесь свести к минимуму освещение с ультрафиолетовым светом, в том числе широкого спектра света, созданного источников ртути легких.

Другие вопросы и будущие направления:

Поскольку этот метод не использует обезболивающие, сердце животного продолжает бить. Это создает некоторую неизбежную мобильность, которая влияет изображений в некоторых местах больше, чем другие. Приведенные примеры показывают, что брюшной нервной, сегментные нервы, и тело стены могут быть легко отображены без вмешательства со стороны сердца. В случаях, когда сердцебиение влияет изображений, регулярные движения иногда может быть исправлена ​​для св программное обеспечение для анализа (например, стабилизатор изображения плагин для ImageJ). Это хорошо работает, когда отдельные объекты движутся на быстро масштабе времени (например ~ 1 мкм / с для быстрой аксонов транспорта) или на очень медленном масштабе времени (минут до нескольких часов). Тем не менее, когда объект (ы) объекты движутся с диапазоном скоростей и направлений, это может быть труднее для коррекции сердечных сокращений индуцированной движений.

Другой проблемой является небольшая изменчивость в оптике от животного к животному или между нескольких сеансов изображений одного и того же животного в чипе. Чем глубже объектом интереса в пределах животного, тем больше это изменение будет. Сегментные нервы и брюшной нервной, как правило, слишком глубоко в то животного, подлежащего отображаемого на регулярной микроскопом. Однако мягкий давление, испытываемое в чипе личинки толкает эти структуры очень близко к кутикулы и покровного стекла. Точное расстояние этих структур от покровного стекла будет иметь небольшие вариации из трIAL к суду. Изменение объектов закрыть кутикулы, например, клеточных тел сенсорных нейронов, меньше. Поэтому очень важно, особенно для проведения измерений интенсивности, чтобы использовать большое количество животных и независимых испытаний для учета изменчивости в оптике.

Хотя примеры, показанные здесь были сосредоточены на процессах в нейронах, подход должен быть поддаются визуализации любую структуру в животное, которое может быть предъявлен в течение фокусировки глубине объектива микроскопа. Это включает в себя кутикулу, стенки тела мышцы, и их NMJs. Трахеи на брюшной стороне животного и потенциально части пищеварительного тракта также может быть отображены. Животное также может быть расположен с его спинной стороне в сторону покровного стекла на короткий срок визуализации структур вблизи поверхности спинного. Способность изображений структур глубоко внутри животного ограничено рабочее рассто ние объектива микроскопа используется. Структуры, такие как имaginal диски недоступны большом увеличении (например, 40X) целей.

Личинка чипы, описанные в данном протоколе предназначены для личинок в начале 3 стадии ^й возрастной стадии (размером от 3,5-4 мм). Однако многие интересные вопросы требуют визуализации на различных личиночной стадии. Меньшие чипы для размещения ^2-й стадии личинок, или более крупные чипы для размещения поздно ^3-й возрастов могут быть легко разработаны, используя тот же принцип. (Дополнительный Рисунок 1 содержит легко изменяемую файл DXF получения кремниевых форм с измененными размерами камеры). Простой принцип обратимого уплотнение может даже быть применены к другим организмов, таких как C. Элеганс или данио, с основной вариант является размер камеры. Полезный будущее направление заключается в разработке чип, который может обездвижить много животных сразу, чтобы использовать для целей скрининга. Правда, для этого, дизайн должны были бы быть значительно отличаетсяот текущего устройства, где вопросы позиционирования животное в чипе необходимо решать с для каждого животного независимо.

Нерв давка анализа для изучения ответов травмы в личиночной периферических нервов:

Нерв давка анализа, описанного здесь личинок нервов сегментных простой метод для введения травмы периферических аксонов у дрозофилы. Преимущества этого метода относятся: а) это просто проводить с помощью стандартных инструментов, найденных в лаборатории Drosophila (стереомикроскоп СО источника и щипцов _2), б) он может быть быстро проведены для многих животных, делая биохимический анализ нервных стволов после травмы возможно ^14, в) молекулярные и клеточные реакции на этой травмы являются высокая воспроизводимость ^14,15,28, и может быть использован, чтобы обнаружить процессы, которые также важны для позвоночных нейронов ^29,30.

Альтернативные методы ранив нейронов является на общса мощного лазерного, например импульсно-УФ или фемтосекундного лазерного, разорвать аксон через лазерной микрохирургии ^17,31-33. Чип личинка является идеальным методом для позиционирования животное для такого микрохирургии. Однако из-за небольших различий в оптике между испытаний, обсужденных выше, способ на основе лазера может быть более трудно воспроизвести в личинок, особенно в личиночной нервов сегментных. Кроме того, лазер повреждение аксонов требует больше времени, чтобы позиционировать каждое животное, следовательно, является более трудным проводить в большом масштабе (с большим количеством животных).

Поиск и устранение неисправностей:

Наиболее часто встречаются технический вопрос от нервного давке это смерть от повреждения внутренних органов. При проведении давку, важно, чтобы не прищемить брюшной нервной, слюнные железы, или кишечник. Важно также, чтобы не проколоть кожицу. Эти вопросы лучше избегать, принося щипцы под углом 45 ° к кутикулы Surfacе (см. Рисунок 3).

Качество щипцов имеет большое влияние от эффективности давке и выживания после этого. Мы рекомендуем номер Dumostar 5 щипцов. Чтобы сохранить свою остроту, щипцы должны быть обработаны с осторожностью, не используется в других целях, и заменены, как только они становятся тупыми или согнуты.

Размер животного может также влиять на эффективность давке. Мелкие животные (менее 3 мм в длину) имеют гораздо меньше шансов пережить травму. С крупных животных, (странствующий ^3-й возрастов), это более трудно найти нервы и избежать повреждения крупных слюнных желез и кишечника, и остается меньше времени для изучения ответов травмы до окукливания. Нерв давка наиболее эффективно проводится в начале ^3-го возрастной стадии личинок (которые являются ~ 3-4,5 мм в длину вдоль передне-задней оси).

Источник питания, что животное поднимается на могут повлиятьСила кутикулы и выживания после давки. Рекомендуется разводить животных в пище, сделанные из стандартного рецепта дрожжи-глюкозы.

Лучший метод для обучения, как эффективно сделать давки является практика на многих животных, в первую очередь с первичной целью достижения выживание (и не окукливания) 24 ч после давки. Начинающие обычно имеют скорость низкая выживаемость (например, 10%), но как только техника узнал, выживаемость может достигать ~ 90%.

Другие вопросы и будущие направления:

Давка анализ обеспечивает мощный метод для изучения прорастания аксонов проксимальнее места повреждения и дегенерации аксонов и синапсов дистальнее места повреждения. В то время как скорости дегенерации варьироваться между различными типами нейронов, они очень воспроизводимым в пределах заданного типа нейронов, обеспечивая свидетельствует о воспроизводимости травмы анализа.

В отличие от этого, "регенеративный" прорастанияответ наблюдается в проксимальных аксонов является более сложным для изучения. Все аксоны в сегментной нерва инициировать обширная прорастания близко к месту повреждения (например, см. рисунок 6 и рисунок 3). Однако степень прорастания может варьироваться от нейрона к нейрону, и трудно оценить количественно. Аналогичная степень и изменчивость прорастания можно наблюдать после нескольких очаговых поражений одиночных мотонейронов в сегментных нервов, введенных с помощью лазера на красителе УФ импульсного. Мы интерпретируем что nondiscriminate направленность прорастания связано с отсутствием сигналов наведения в сегментарных нервов. В противоположность этому, сенсорного нейрона аксоны поврежденные лазером близко к их клеточных тел пройти новый рост аксонов в том же направлении, что была утрачена аксона ^34. Аксоны в этом регионе животного, вероятно, подвержены более конкретной информацией о местоположении для руководством регенерирующих аксонов. Окружающая среда в сегментных нервов вряд ли будет иметь много resemblanсе в окружающую среду, что аксоны первоначально перемещаться во время их руководством в зародыше, следовательно, не будет иметь информацию для руководства регенерирующие аксоны.

Еще одно ограничение для изучения регенерации с помощью сегментарную нерв раздавить анализа является то, что потерпевшие сенсорные и мотонейронов аксоны еще есть значительное расстояние, чтобы покрыть (0,25-1 мм) для достижения своей цели, а также ограниченные сроки (<3 дня) до претерпевает животных окукливание. Недавнее исследование выявило генетическую манипуляцию prothoraciotropic рецептора гормона, который утраивает продолжительность ^3-й возрастной стадии личиночной стадии ^35. Эта манипуляция продлит сроки для значительно изучения восстановления и дегенерацией нейронов после травмы, до 9, а не 3 дней. Это может быть достаточно долго, чтобы наблюдать новые события, такие как повторное подключение потерпевшего аксона с его постсинаптической цели, особенно если травма индуцируется близко к синаптической финал.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Полиэтиленовая трубка 0,5 мм	Fisher Scientific	14-170-11B	Полиэтиленовая трубка, внутренний диаметр = 0,023 дюйма Наружный диаметр = 0,038 дюйма
1 мм Полиуретановая трубка	Fisher Scientific	BB521-63	Полиуретановая трубка, внутренний диаметр = 0,063 дюйма   Внешний диаметр = 0,125 дюйма
Соединитель заусеницы к заусенице	Bio Rad	732-8300	0,8 мм Соединитель заусеницы к заусенице
3-ходовой запорный клапан	Bio Rad	732-8104	Резьба на клапане для шприца
Шприц (20 мл)	Fisher Scientific	14-817-33	Винтовка на шприц 20 мл для  генерирующего вакуума
Дозирующие иглы, 23 G (внутренний диаметр 0,4 мм, внешний диаметр 0,6 мм)	McMaster-Carr	75165A684	Игла для подключения к выходу
Дозирующие иглы, 21 G, (внутренний диаметр 0,6 мм,  0,8 мм Наружный диаметр)	McMaster-Carr	75165A679	Игла для подключения к выходу
Галокарбоновое масло	Sigma	H8898	Галокарбоновое масло 700
Dumostar Номер 5 Щипцы	Roboz	RS-498	Для раздавливания нервов
PDMS Kit (База и отвердитель)	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0,5 КГ	Dow Corning Sylgard 184 Силиконовый инкапсулант 0,5 кг Комплект
Прозрачное стекло Coverslips	Fisher Scientific	12-544-C	24 мм x 40 мм (толщина в соответствии с рекомендацией для объектива вашего микроскопа)
Одноразовый пластиковый стаканчик (9 унций)
Пластиковая палочка для мешалки
бритвенное лезвие
агаровые пластины для виноградного сока			Смотрите http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 рецепт