Имплантация организованных массивов микропроводков для использования в одно-единицы электрофизиологических записей представляет ряд технических проблем. Методы проведения эту технику и оборудование, необходимое описаны. Кроме того, полезно использование организованных массивов микропровода для записи с различных нейронных субрегионов с высоким пространственным селективности обсуждается.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Порядок Имплантация с организованной Массивы Микропровода с одноместным-единицы Recordings в Пробудитесь, Ведя Животные
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В естественных условиях электрофизиологических записей в активном, ведет себя животное обеспечивают мощный метод для понимания нейронной сигнализации на уровне одноклеточного. Методика позволяет экспериментаторы изучить во времени и на региональном уровне определенные шаблоны огневые того, чтобы соотнести записанные потенциалы действия с постоянной поведения. Кроме того, одного блока записи могут быть объединены с множеством других методов с целью получения комплексных объяснения нервной функции. В этой статье мы опишем анестезии и подготовку к микропроводов имплантации. Впоследствии мы перечислим необходимое оборудование и хирургические меры, чтобы точно вставить микропроволоки массив в целевой структуры. Наконец, мы кратко опишем оборудования, используемого для записи с каждого отдельного электрода в массиве. Фиксированные массивы MICROWIRE описанные хорошо подходит для хронической имплантации и позволяют продольных записи нейронных данных в почти любых поведенческих готона. Мы обсуждаем трассировки электродов песни в триангуляции MICROWIRE должности, а также способы комбинирования микропровода имплантации с иммуногистохимических методов с целью повышения анатомическую специфику записанных результатов.
Введение
Электрофизиологические записи позволит ученым изучить электрические свойства биологических клеток. В центральной нервной системе, в которой электрические импульсы служить в качестве механизма передачи сигналов, эти записи имеют особое значение для понимания нейронной функции 1-2. Во время одного блока записей в себя животных, микроэлектрод, который был вставлен в мозг способен записывать изменения в поколение нейрона потенциалов действия во времени.
Хотя многие методы позволяют записывать активность мозга, один блок-электрофизиология является одним из наиболее точных методов, позволяя разрешение на одном уровне нейронов. Когда высокая степень пространственной специфичности желательно, микропровода могут быть использованы для целевой дискретные суб-ядер или ансамбли клеток в brain3. Одно-блок записи также извлечь выгоду из высоким временным разрешением, как записи точны на уровне микросекунд. И, в естественных условияхуслуга записи позволяют нетронутыми взаимодействия схемы, с естественной среде афферентных и эфферентных проекций, системного химических и гормональных влияний и физиологических параметров. Нервные сигналы получены от сенсорной информации, моторных поведения, когнитивной обработки, нейрохимии / фармакологии, или некоторой комбинации. Соответственно, разделение сенсорных, моторных, когнитивных и химическим воздействиям, требует хорошо продуманных экспериментов с эффективными обстоятельств и управления, которые могут позволить для оценки каждого из вышеупомянутых влияний. В целом, записи в себя животных позволяют экспериментаторы наблюдать интеграцию различных источников информации в рамках функционирующей цепи и для получения более полной модели функции схемы.
Одно-блок записи также страдают от ряда недостатков которой любой экспериментатор должен быть в курсе. В первую очередь, записи могут быть трудно провести. Действительно, свойства гое headstage усилители и имплантированные Микропровода, которые позволяют пространственной и временной специфичности в этих записей также делает записи подвержены влиянию посторонних электрических сигналов (т.е. электрический «шум»). Соответственно, способность устранять проблемы в электрофизиологических системы требует хорошо развитой технического понимания электрофизиологических принципов и аппарата. Важно также отметить, что при определенных обстоятельствах, записанные электрические сигналы в внеклеточных записи может представлять суммирование нескольких нейронных сигналов. Кроме того, Обобщаемость одной единицы активности на активность населения в пределах области-мишени часто может быть ограничена степенью неоднородности в сотовой области-мишени (но см. Cardin 4). Например, электроды могут быть смещены в сторону записи выходных нейронов высокой амплитуды вместо других клеток. Интерпретируемость одной единицы записи увеличиваетсяпутем объединения записи с другими методами, включая, но не ограничиваясь ими, электрические (ортодромном или Антидромная), химические (например, электрофореза или дизайнер рецептор) или optogenetic стимуляция 4, временные нервные inactivations, сенсомоторных осмотры 5, процедуры разъединения или иммуногистохимия 3.
В протоколе, который следует мы перечислим материалы и шаги, необходимые для имплантации организованной массив микропровода у крыс (хотя протокол может быть адаптирован для использования в других видах). Порядок и стиль основных массивов, используемых в нашей лаборатории доказали свою надежность для продольных записей и может выдержать записи одного и того же нейрона для течением времени один месяц 6-8. Это делает эту процедуру идеально подходит для изучения фазовые ответов на экспериментальных стимулов, пластиковые изменений в нервных реакций, или механизмов обучения и мотивации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Постоянное внимание должны быть приняты для поддержания асептических условий (как описано в руководстве по по проблемам помощи и использованию лабораторных животных 9) во время подготовки и проведения следующей процедуры. Следующий протокол является в соответствии с Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и был одобрен на уходу и использованию животных комитета институциональной, Rutgers University по. Считается, что последующие процедуры потребует 3-6 ч, чтобы закончить.
Имплантация массива MICROWIRE:
- Место животные под наркозом с использованием 50 мг / кг пентобарбитала натрия (IP) и управляют 10 мг / кг атропина метилового нитрата (IP; Гликопирролат может быть замещена) и 0,25 мг пенициллина (300 000 ЕД / мл внутримышечно) для поддержания функции внешнего дыхания и предотвращения инфекции , соответственно.
Примечание: При длине 3-6 ч этого имплантации хирургии, фенобарбиталом натрия используется, потому что это является экономически эффективным и ограничивает воздействия на человекаанестетики (как может произойти при длительном использовании газовых анестетиков) в то же время обеспечивая длительный наркоз. Замена других анестезирующих средств является приемлемым. - Убедитесь, что анестезия вступило в силу, используя тест хвост щепотку перед переходом.
- При необходимости дать переменного инъекции кетамина гидрохлорида (60 мг / кг внутрибрюшинно) и пентобарбиталом натрия (5-10 мг / кг IP) для поддержания анестезии всей операции.
- Бритье головы с использованием # 22 лезвие скальпеля.
- Лечить бритая скальп с повидон-йод.
- Дайте подкожные инъекции бупивакаина (~ 1 мг / кг SC расположены на 4 местах инъекций), чтобы локально обезболить кожу головы. Разрешить 5-10 мин для местного анестетика вступили в силу.
- Наведите глазной смазки над глазами, чтобы сохранить влагу во время анестезии.
- Закрепите животное в ухо баров и носа зажима стереотаксической аппарата.
- Используйте визуальные ориентиры (например, горизонтальная полоса на стерeotaxic рамка) примерно уровне головы животного. Этот шаг предназначен только для примерно уровне черепа.
- Сделайте надрез вдоль средней линии головы с помощью # 11 лезвие скальпеля, установленный на держателе скальпеля. Разрез должен проходить от просто за ушами к задней части носовой кости.
- Использование рассечение шпатель, очистить череп всех остальных ткани, пока обе боковые черепа хребты и задняя череп хребет не были достигнуты.
- Потяните кожу вокруг разреза, используя ряд Hemostats (6x).
- Очистите череп любого крови и дайте ему высохнуть. Если все оставшиеся кровотечение происходит, прекратить остаточную кровотечение с небольшой инструмент прижигание. Обеспечение того, чтобы череп остается чистой и сухой позволяет стоматологическая акриловая используется на последующих стадиях, чтобы связать к черепу на постоянной основе.
- Марк брегма и лямбда (рис. 2D) путем интерполяции пересечение черепа швов. Рассекает микрофонroscope необходимо точно отметить эти позиции.
- Прикрепите небольшой острый предмет (например, контактный или зубной сверло) для стереотаксической руку и опустите его, чтобы определить спинной / вентральной (DV) координата брегмы и лямбда.
- Регулировка нос зажим, пока не DV координаты темени и лямбда находятся в пределах 100 мкм (0,1 мм) друг от друга.
- После того, как выравнивается, записывать передней / задней (AP), медиальной / боковой (ML) и DV координаты брегмы вместе с положением носа зажима. Тщательно проверьте координаты для точности, как остальная часть операции зависит от точности этих координатах.
- Используйте измеренные координаты для расчета с ОД и А.П. координаты четырех углов «окна череп" по отношению к темени (т.е. краниотомии; рис. 1). Окно череп точно позиционируется прямоугольник, через который будет проходить массив микропровод.
- Используйте расчетные координаты, чтобы отметитьокна череп координаты на черепе с помощью остроконечного привязанность стереотаксической и авторучка чернила. Чтобы получить точные оценки, применяются только небольшое количество чернил на кончике инструмента маркировки с помощью ватного аппликатором.
- Дрель в окно черепа, удалив кости в серии небольших слоев.
- Начните с бурения отмеченные углов окна, когда знаки были помещены.
- Затем подключите углы и наметить окно.
- Наконец, ясно, из области в контур вниз на глубину твердой мозговой оболочки. Отверстие должно быть шире (например, скошенный) ниже поверхностных слоев черепа, чтобы гарантировать, что окно сохраняет соответствующую ширину от верха до низа.
- Используйте microforceps тщательно удалить все оставшиеся костной стружки, мусора или твердую мозговую оболочку в окне черепа. Этот шаг является чрезвычайно важным, так как эти биты материала может нарушить целостность массива при опускании. После очистки, надо иметь тыс.е окно влажная с бактериостатическим физиологического раствора в течение оставшейся части операции.
- Наведите маркировку на черепе в течение 5 черепа винтов и 1 провод заземления (рис. 1). Эти позиции будут различаться в зависимости от целевой области мозга. Headstage будет наиболее безопасным, если один винт ставится на каждой из костей 5 черепа. Положите обе черепа винты и провод заземления в местах, которые не будут мешать размещению микропровод массива.
- Сверлить отверстия для винтов черепа и закрепите винты на месте. Винты не должны быть снижены до всего 3-4 темы отображаются (или, если использовать другие, чем те, которые рекомендованы винты, достаточно глубоко, чтобы пройти толщину черепа для содействия стабильности массива, но не слишком глубоко для того, чтобы повредить кору). Очистите резьбу винтов после размещения.
- Просверлите отверстие для провода заземления. Медленно опустите провод (более 1-2 мин) в целевой DV координат и зафиксировать провод на месте с помощью зубной акрил.
- Добавить акрил вокруг нитейвинтов череп. Перед акриловых высохнет, удалите излишки цемента, которая течет от провода заземления или черепа винтами. Разрешить 15 минут для стоматологической акрила для просушки / твердеют.
- Прикрепите массив в стереотаксической руку. Уровень массив и ориентировать его так, что он будет прямо проходить через рамки окна черепа.
- Поместите физиологический раствор в окне черепа так, что она находится на уровне черепа. Опустить массив, пока он не создает впадину в физиологическом растворе. Это координат используется как уровень черепа для массива. Используйте это значение для расчета финале Д.В. координата массива.
- Опустите массив медленно, пока не достигнет его окончательная Д.В. координат. Стоп каждый 1 мм опускания и ждать в течение нескольких минут для того, чтобы позволить ткани мозга для восстановления рябь и распустить нижнюю часть полиэтиленгликоль (ПЭГ) в массиве (PEG используется для временного закрепления проводов в свою конформацию при одновременном снижении и растворяется медленно в физиологическом растворе).
- Когда массив 1ммот цели, опустите его медленнее, пока конечная цель не будет достигнута. Понижение в 0,1-0,2 мм за один раз, прежде чем разрешить ткань отдохнуть в течение 5 мин предназначен для сохранения ткани в сайте-мишени, а также проксимальных синаптических соединений. Если оборудование доступно, точность опускания массива может быть оказана помощь с использованием моторизованных манипулятор.
- Растворите оставшийся ПЭГ и использовать зубной акрил заделать микропроводов на месте. Добавить несколько слоев цемента, чтобы обеспечить, что провода находятся в безопасности, а затем позволить 15-20 мин для цемента, чтобы укрепиться, прежде чем продолжить. Это гарантирует, что провода не будет толкать от их окончательного размещения.
- Постройте остаток headstage животного с помощью зубной акрил. Используйте акрил, чтобы упаковать черепа винты, заземляющий провод и разъем для микропроводков. Разрешить акрил шляпа, чтобы укрепиться достаточно перед началом работы.
- Шовный кожу головы разрез с помощью рассасывающиеся нити и администрировать 2 мл ое бактериостатическое физиологический раствор (подкожно) для восстановления гидратации после операции.
- Снимите животное от уха баров и поместить предмет в экологически чистом районе. Соблюдайте животное часто в течение послеоперационного восстановления, пока терморегуляции и передвижения не восстановились. После выхода из наркоза, переместите животное в одном-жилья на оставшуюся часть послеоперационного восстановления.
- Дайте животным ежедневно в послеоперационном периоде мониторинг и уход в первые дни после процедуры. Восстановление после этой процедуры является оптимальным, когда семь или более дней допускается.
- Дайте животным инъекции Carprofen (5mg/kg) и энрофлоксацина (5-10 мг / кг) или их эквиваленты во время восстановления в расписании рекомендованной лечащим ветеринаром.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Перечень оборудования, используемого в данной лаборатории для записи электрофизиологических сигналов можно найти в таблице 3. После восстановления после операции, одиночные-единицы записываются, подключив единичным усилением headstage в имплантированного разъема. Это headstage подключен через кабель к коммутатору, который способен свободного вращения без перерывов в электрофизиологические записи с использованием электрических колец скольжения. Коммутатор позволяет субъекты свободно перемещаться во время...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Внеклеточные записи представляют собой мощный экспериментальную технику, которые могут быть включены в почти любой экспериментальной подготовки в области неврологии. Провода, которые были имплантированы в организованных массивов можно отслеживать как их валы проходят через мозг и в их целевом регионе (рис. 5, а). Когда маленький, после опыта поражения создается в неизолированного кончика микропроводов создать небольшой депозит железа из нержавеющей стальной проволоки, можно точно отметить расположение н...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальным институтом по злоупотреблению наркотиками предоставляет Д.А. 006886 (MOW) и Д.А. 032270 (DJB).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Table 1. Список хирургических материалов. | |||
| Марля | Фишер (MooreBrand) | 19-898-144 | |
| Ватные тампоны | Фишер (пуританин) | S304659 | |
| Нембутал (пентобарбитал) | Сигма Олдрич | P3761 | |
| Атропин метилнитрат | Сигма Олдрич | A0382 | |
| Байтрил (энрофлоксацин)Батлер | Шейн ( Bayer) | 1040007 | |
| Кетамина гидрохлорид | Butler | Shein SKU# 023061 | |
| Бетадин (повидон-йод) | Fisher (Perdue) | 19-066452 | |
| Stereotax | Kopf | Model 900 | |
| Прижигающий инструмент | Stoelting | 59017 | |
| Препарирующий микроскоп | Nikon | SMZ445 | |
| Стоматологическая бормашина | Buffalo | 37800 | |
| Бактериостатический солевой раствор | Bulter Schein | 8973 | |
| Jewlers Винты | Stoelting | 51457 | |
| Микропроволочная матрица | Микрозонды | Пользовательские (гибкие) | |
| Заземляющий провод | Omnetics | Custom Plug | |
| Стоматологический акриловый | фишер (BAS) | 50-854-402 | |
| Рассасывающиеся шовные материалы | Фишера (Ethicon) | NC0258473 | |
| Puralube (мазь офталамуса/лубриканта) | Fisher (Henry Schein) | 008897 | |
| Table 2. Список хирургических инструментов. | |||
| 2x микрощипцы | George Tiemann Co. | #160-57 | Многоразовый (например, расчистка завалов в окне черепа) |
| 2x Щипцы | George Tiemann Co. | #160-93 | Многоразовые (например, наложение швов) |
| 6x Гемостаты | George Tiemann Co. | #105-1125 | Зажим и открытый разрез |
| 1x Маленькие ножницы | George Tiemann Co. | #105-411 | Разрезать швы после завязывания |
| 1x Тканевые щипцы | George Tiemann Co. | #105-222 | Удержание ткани во время наложения швов |
| 1x Иглодержатель | George Tiemann Co. | #105-1259 | Игла для швов |
| 1x Держатель скальпеля (с лезвием #11) | George Tiemann Co. | #105-80 (с лезвием #105-71) | Делаем разрез черепа |
| 1x #22 Лезвие скальпеля | George Tiemann Co. | #160-381 | Бритье кожи головы |
| 1x Хирургический шпатель | George Tiemann Co. | #160-718 | Соскабливание черепа для очистки тканей на черепе |
| Машина/Ювелирные винты | Различные | Н/Д | 0/80 x 1/8" |
| Таблица 3. Перечень оборудования для регистрации электрофизиологических сигналов. | |||
| Microwire Array & Connector | Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) | Н/Д (Номер детали основан на характеристиках матрицы) | Краниально имплантирован в целевую область записи. Массивы настраиваются в зависимости от желаемого расстояния между проводами, длины и т. д. |
| Unit-Gain Harness/Headstage | M.B. Проекты под ключ (Хиллсборо, Нью-Джерси) | Proj 1200 | Начальное усиление нейронного сигнала; позволяет распространять небольшие нейронные сигналы. |
| Коллектор (и дополнительный вращатель жидкости) | Plastics One, Inc. (Роанок, Вирджиния) | SL18C | Позволяет животным свободно вращаться, распространяя электрический сигнал на предусилитель |
| M.B. Turnkey Designs (Хиллсборо, Нью-Джерси) | Proj 1198 | Дифференциально усиливает нейронные сигналы на электроде сравнения. | |
| Фильтр и усилитель | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1199 | Полосовой фильтр и дополнительное усиление дифференциально усиленного сигнала. |
| Компьютер сбора данных | EnGen (Phoenix, AZ) | N/A (Custom Build) | Запускает программное и аппаратное обеспечение для сбора поведенческих и нейронных данных. |
| А/Д Кард | Трансляция данных (Marlboro, MA) | DT-3010 | Оцифровывает нейронные сигналы для компьютерной выборки. |
| Цифровые карты ввода-вывода | измерения (Norton, MA) | PCI CTR-05 | Получение поведенческих входов и выходов |
Ссылки
- Carter, M., Shieh, J. C. Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. , Academic Press. (2009).
- Aston-Jones, G., Siggins, G. R. Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Kupfer, D., Bloom, F. E. , Raven Press. (1995).
- Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521 (3), 558-588 (2013).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
- Ma, S., et al. Amphetamine's dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. , (2013).
- Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).
- Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25 (4), 1212-1227 (2007).
- Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324 (2), 701-713 (2008).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30 (12), 2387-2400 (2009).
- Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66 (2), 106-127 (2012).
- Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64 (9), 704-713 (2010).
- Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29 (44), 12952-12961 Forthcoming.
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (1997).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
