Морская улитка Aplysia californica широко используется в качестве нейробиологической модели для исследований клеточной и молекулярной основы поведения. Здесь описана методология изучения нервной системы Аплизии для электрофизиологического и молекулярного анализа отдельных нейронов идентифицированных нейронных схем.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Аплизия Ганглия Подготовка к электрофизиологическому и молекулярному анализу отдельных нейронов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Основная проблема в нейробиологии заключается в том, чтобы понять молекулярные основы нейронной схемы, которые регулируют конкретное поведение. После того, как конкретные молекулярные механизмы определены, новые терапевтические стратегии могут быть разработаны для лечения аномалий в конкретном поведении, вызванном дегенеративными заболеваниями или старением нервной системы. Морская улитка Aplysia californica хорошо подходит для исследования клеточной и молекулярной основы поведения, потому что нейронные схемы, лежащие в основе конкретного поведения, могут быть легко определены и отдельные компоненты схемы могут быть легко манипулировать. Эти преимущества Aplysia привели к нескольким фундаментальным открытиям нейробиологии обучения и памяти. Здесь мы описываем подготовку нервной системы Аплизии к электрофизиологическому и молекулярному анализу отдельных нейронов. Короче говоря, ганглия, вскрытая из нервной системы подвергается протеазы, чтобы удалить оболочку ганглия так, что нейроны подвергаются, но сохранить нейронной активности, как в нетронутыми животных. Этот препарат используется для проведения электрофизиологических измерений одного или нескольких нейронов. Важно отметить, что после записи с использованием простой методологии, нейроны могут быть изолированы непосредственно от ганглиев для анализа экспрессии генов. Эти протоколы были использованы для проведения одновременных электрофизиологических записей из L7 и R15 нейронов, изучить их реакцию на ацетилхолин и количественное выражение гена CREB1 в изолированных одного L7, L11, R15, и R2 нейронов Аплизии.
Введение
Человеческий мозг чрезвычайно сложен с почти 100 миллиардами нейронов и триллионами синаптических связей. Есть почти равное количество ненейрональных клеток, которые взаимодействуют с нейронами и регулируют их функции в головном мозге. Нейроны организованы в схемы, которые регулируют конкретное поведение. Несмотря на достижения в нашем понимании функций мозга и нейронных цепей, мало что известно о идентичности компонентов схемы, которые контролируют конкретное поведение. Знание идентичности различных компонентов схемы значительно облегчит наше понимание как клеточной, так и молекулярной основы поведения и помощь в разработке новых терапевтических стратегий для нейропс....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка брюшной Ганглии, Электрофизиологические измерения, и изоляция отдельных выявленных нейронов из брюшной Ganglion аплизии californica
- Поддерживайте аплизию в лабораторном аквариуме с циркулирующей искусственной морской водой (ASW) при 16 градусах по Цельсию при 12:12 свет: темные условия.
- Изоляция брюшного ганглиона.
- Обезболивать животных путем введения 380 мМм MgCl2 раствор в течение 5-10 мин (эквивалент 30-35% массы тела животного).
- Определите брюшной ганглий на основе его положения в центральной нервнойсистеме 24,28.
- Удалите ганглии хирургическим путем и немедленно....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Вес животных, которые были использованы в этом исследовании варьировались от 100-200 г. Следуя описанным протоколам, мы провели электрофизиологические измерения и молекулярный анализ нейронов брюшных ганглиев, изолированных от животных, от 2-5 г до 200-300 г.
Стандартизация лечения протеазы важна для успешных электрофизиологических измерений нейронов в ганглиях. Первоначально, несколько протеазы (Dispase) концентрации и продолжительности были использованы и разрыва потенциалов действия от R15 .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Нейрон R15 участвует в регулировании сердечно-сосудистой, пищеварительной, дыхательной и репродуктивной систем30. Регулярно ритмичная лопнухать активность AP является особенностью R15. Как показано в разделе результатов, парная запись R15 и L7 показывает, что подготовка ганглиев сохранила активность нейронов R15. Нейроны R15 и L7 соответствующим образом отреагировали на Ach. Этот препарат ганглиев может поддерживаться до 8-10 часов, и электрофизиологическая активность может постоянно контролироваться. Таким об.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы искренне благодарим Фонд Уайтхолла за их поддержку финансирования и стартовые фонды из Научно-исследовательского института Скриппса для проведения этой работы.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Aplysia | Aplysia Resource Facility, University of Miami | ||
| NaCl | SIGMA | S 3014-1KG | |
| KCl | SIGMA | P 9333-500G | |
| CaCl2• 2H2O | SIGMA | C5080- 500G | |
| MgCl2• 6H2O | Fisher Scientific | BP 214-501 | |
| NaHCO4 | SIGMA | S 6297-250G | |
| HEPES | SIGMA | H 3375-500G | |
| Протеаза | GIBCO | 17105-042 | |
| Тризол Амбион | 15596-026 | ||
| Хлороформ | MP Biomedicals | 2194002 | |
| 100% этанол | ACROS | 64-17-5 | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 3 M NaOAc, pH 5,5 | Ambion | AM9740 | |
| Вода без нуклеазы | Ambion | AM9737 | |
| Набор для амплификации аРНК MessageAmp II Ambion | AM1751 | ||
| qScript cDNA SuperMix | Quanta Biosciences | 95048-100 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Прикладные биосистемы | 4367659 | |
| щипцы | Инструменты для тонкой науки | 11252-20 | |
| Ножницы | для тонкой науки | 15000-08 | |
| Нержавеющая сталь Минимальные булавки | Fine Science Tools | 26002-10 или | |
| 26002-20 | |||
| Термоамплификатор Veriti Applied | Biosystems | Термоамплификатор | |
| 5430R Центрифуга | Eppendorf | 5430R Центрифуга | |
| 7900HT Быстрая ПЦР в реальном времени | Applied Biosystems | 7900HT Быстрый усилитель ПЦР | |
| BRAMP-01R | NPI Электроника | ||
| Digidata Преобразователь | Instrutech ITC-18 | HEKA ELEKTRONIK | |
| Микроманипулятор | Патч Star | Scientifica |
Ссылки
- Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
- Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
