Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение кровеносных сосудов, полученных мультипотентные прекурсоров от человека скелетных мышц

10.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51195

⸱

21 августа 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Department of Bioengineering and Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 2Department of Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Nazarbayev University Research and Innovation System, Nazarbayev University, 4Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 5Department of Cell Biology, Erasmus MC Stem Cell Institute, 6OHSU Center for Regenerative Medicine, Oregon Health & Science University, 7Centre for Cardiovascular Science and MRC Centre for Regenerative Medicine, Queen's Medical Research Institute and University of Edinburgh, 8David Geffen School of Medicine and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 9Stem Cell Research Center, Department of Orthopedic Surgery and McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

В этой статье

Краткое содержание

Кровеносные сосуды в пределах скелетных мышц портовых нескольких мульти-клона населения предшественников человека, которые идеально подходят для восстановительных приложений. Этот метод изоляции позволяет одновременно очистку трех мультипотентными клеточных популяций предшественником соответственно из трех структурных слоев кровеносных сосудов: миогенные эндотелиальных клеток из интиме, Перициты от СМИ, и адвентициальные клеток от адвентиции.

Аннотация

С момента открытия мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК), уроженец идентичность и локализация МСК были затемняется ретроспективном изоляции в культуре. В последнее время, с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS), мы и другие исследователи определили перспективно и очищенный три субпопуляции мультипотентных клеток-предшественников, связанных с сосудистой скелетных мышц человека. Эти три популяции клеток: миогенные эндотелиальные клетки (МИК), Перициты (ПК), и адвентициальные клетки (ACS), локализованы соответственно к трем структурных слоев кровеносных сосудов: интима, СМИ и адвентиции. Все эти человеческого кровеносных сосудов стволовых клетки (hBVSC) населения не только выразить классические маркеры MSC, но и обладают мезодермальные потенциалы развития, аналогичные типичных МСК. Ранее СОВС, ПК, и кондиционеры были выделены через различные протоколы и впоследствии характеризуют в отдельных исследованиях. Нынешний прот изоляцияocol, посредством изменения процессе выделения и корректировок в селективных маркеров клеточной поверхности, позволяет нам одновременно очистить все три hBVSC субпопуляции от FACS из одного биопсии мышц человека. Этот новый метод будет не только оптимизировать изоляцию нескольких субпопуляций BVSC но и облегчить будущие клинического применения hBVSCs для различных терапевтических целей.

Введение

Скелетных мышц человека была рассмотрена клинически привлекательным источником стволовых клеток / клеток-предшественников. Скелетных мышц содержит не только совершил миогенные предшественники, скелетные миобластов, но и примитивные миогенные стволовых клеток, в том числе спутниковых клеток и мышечных стволовых клеток (MDSCs) 1. Использование мышечных клеток, полученных человека стволовых / прогениторных, аутологичных или аллогенных, в регенеративной медицине широко исследованы в доклинических моделях животных и клинических испытаний. Регенеративные применения мышечных стволовых клеток / клеток-предшественников в диапазоне от регенерации дистрофические мышцы в мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) пациентов ремонтом травмированного сердце у пациентов с сердечным приступом.

С момента открытия мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК) и других мультипотентными клеточных популяций предшественника, в том числе мозга, полученных мультипотентными клеток костного взрослых предшественников (MAPCs) и полученные из жировой ткани стволовые клетки (ADSCs), взрослые стволовые /клетки-предшественники были широко изучены на сегодняшний день 1-9. Тем не менее, их родной идентичность и локализация на месте были затемняется ретроспективных методов изоляции. В последнее время с помощью сортировки флуоресценции активированных клеток (FACS), мы и другие группы перспективно определены и очищенные три мультипотентные клеточные популяции предшественника из кровеносных сосудов в пределах скелетных мышцах человека и ряда других органов: миогенные эндотелиальные клетки (МИК), перицитами (ПК), и адвентициальные клетки (кондиционеры) 10. Эти три субпопуляции человека кровеносных сосудов стволовых клеток (hBVSCs) может быть соответственно найти в трех структурных слоев кровеносных сосудов: внутренней оболочки, средняя оболочка, и туника адвентиции. Более конкретно, МИК и ПК обнаружены в микрососудов и капилляров в то время как кондиционеры локализованы в адвентиции слой больших артерий и вен. Каждая клетка-предшественник подмножество выражает уникальное сочетание антигенов клеточной поверхности: MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), ПК (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -), и КК (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).

Дальнейшая характеристика этих hBVSC подмножеств показало, что все три популяции клеток предшественник обладают мезодермальные потенциалы развития, аналогичные типичных МСК, в том числе скелетной миогенеза, остеогенез, хондрогенеза и адипогенеза. Все подмножества hBVSC также демонстрируют классические маркеры MSC, в том числе CD44, CD73, CD90, CD105 и, недавно, и в культуре. В совокупности эти улики поддержал сосудистого происхождения МСК. Кроме того, терапевтические мощности MECs, ПК и КК недавно было продемонстрировано в отдельных исследованиях. MECs Начиная от взрослых биопсии человека мышечных были показаны для восстановления травмированных и дистрофические скелетных мышц и ремонта ранения миокарда более эффективно, чем скелетные миобластов и сосудов эндоthelial клетки (ECS). Очищенные ПК от различных органов человека, также было показано для ремонта / регенерации травмированных и дистрофические скелетных мышц и способствовать бассейна спутниковым клеток 13-16. Совсем недавно, мы продемонстрировали, что ПК, полученные из скелетных мышц человека эффективно восстанавливать инфаркта миокарда с помощью косвенных паракринного эффекта и прямых клеточных взаимодействий 17. ACS, с другой стороны, были либо непосредственно выделены из эксплантированных кровеносных сосудов или очищают с помощью FACS из жировой ткани человека и скелетных мышцах. Заметным проангиогенных эффект кондиционеров была продемонстрирована в мыши задних конечностей ишемии модели 19. Кроме того, кондиционеры, также было показано, чтобы восстановить инфаркта миокарда более эффективно, чем обычные МСК, что указывает на устойчивую терапевтический потенциал кондиционеров в ишемической восстановления тканей 20.

Нынешние гранты протокола очистки одновременные, проспективное очистка СОВС, ПК, иКК с сосудистой одного человека биопсии скелетных мышц. Это позволяет изучать и / или выбрать оптимальный hBVSC субпопуляции для различных терапевтических целей. Кроме того, эта новая техника расширяет репертуар стволовых клеток / клеток-предшественников, которые могут быть получены из скелетных мышц человека, что делает его идеальным источником мультипотентных клеток-предшественников для регенеративной медицины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 биопсии мышц Обработка

  1. Сохранение человеческого биопсии скелетных мышц на льду в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (P / S) во время транспортировки.
  2. После получения мышечной биопсии, удаления образца из транспортировочного контейнера и промойте его дважды в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 2% антибиотик противогрибкового раствора (A / A) в стерильных условиях.
  3. Удалить прилагаемый жировой и соединительной ткани с стерильными ножницами и щипцами в DMEM, дополненной 2% A / A.
  4. Удалить большие кровеносные сосуды под микроскопом рассечение и впоследствии сократить образец мышечные на мелкие кусочки (<1 см 2 в размере).
  5. Заповедник вырезать мышечные части (<5 грамм) в 20 мл сохранение среды (PM; DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P / S) в 4 ℃ до 5 дней.

2 Мышцы Dissociatионов и Выделение клеток

  1. В день выделения клеток, мышечные удалить части от PM и мыть дважды в PBS с добавлением 2% P / S. Для того, чтобы пищеварение решение, добавить тип-I, II типа, и тип-IV коллагеназ (100 мг / мл) недавно в PM.
  2. Мелко нарезать и механически фарш мышечные части стерильными ножницами и пинцетом в чашку Петри с небольшим количеством PM, пока раствор не проходит 10 мл серологической пипеткой, не свертывания. Удаления остаточного жировой и соединительной ткани в ходе этого процесса. Используйте по крайней мере 8-10 граммов взрослого мышцы или 2 грамма плода мышцы для каждого выделения клеток.
  3. Трансфер 4-5 граммов фарша взрослого мышцы до 20 мл (или 2 грамма фарша плода мышцы в 10 мл) OFTHE пищеварения раствора с 10 мл серологические пипетки. Дайджест 50 - 60 мин при температуре 37 ℃ на орбитальном шейкере при 70 - 80 оборотов в минуту. Оптимизация выход клеток и сохранение антигенной поверхности путем регулирования времени пищеварение и / или скорость перемешивания, соответственно, в расчете на количествотканей. Соблюдайте статус пищеварение каждые 15-20 мин, пока мутность почти не очищает.
  4. Энергично пипетки переваренной ткани в 3-5 раз с 10 мл серологические пипетки. Добавить равное количество ТЧ, чтобы остановить реакцию, а затем центрифугируют при 400 х г в течение 4 мин.
  5. Осторожно удалите супернатант; ресуспендируют осадок в 10 мл PM мыть, а затем фильтруют через сито 100 мкм клеток.
  6. Центрифуга при 400 мкг в течение 4 мин и осторожно удалите супернатант. Ресуспендируют гранулы в буфере для лизиса эритроцитов (155 мМ NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3, 0,1 мм ЭДТА), фильтруют через 70 мкм сито клеток для получения суспензии отдельных клеток, а затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Фильтр через ситечко 70-m клеток снова, если наблюдается любой осадков.
  7. Центрифуга при 400 мкг в течение 4 мин и ресуспендируют осадок клеток в 0,5 мл PBS. Подсчитайте количество клеток. Получить в общей сложности не менее 5 миллионов клеток для сортировки клеток. Развести одэлектронной клеточной суспензии до менее чем 5000000 клеток на мл с PBS для окрашивания. Выньте 50-100 мкл клеточной суспензии и раскола в 11 труб для контроля окрашивания (неокрашенных контроля, отрицательного контроля, и одноцветных положительные контроли).

3 Маркировка сотовый и сортировка

  1. Инкубируйте клеточной суспензии в течение 10 мин при 4 ℃ в мышиной сыворотке (разбавленного 1:10 в PBS) для блокирования цели, если это необходимо.
  2. Добавить CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE и CD146-FITC (все 1: 100) в суспензии отдельных клеток, инкубировать 20 мин при 4 ℃. Для отрицательного контроля, добавить эквивалентные концентрации Apc-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, ПЭ, и FITC-конъюгированных антител изотипа IgG, и инкубируют в течение 20 мин при 4 ℃. Для одноцветных положительных контролей, добавить эквивалентные концентрации CD34-АПК, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, и CD146-FITC отдельно в каждую пробирку и инкубируют в течение 20 мин при 4 ℃.
  3. После инкубации, Центрифуги при 400 мкг в течение 4 мин, чтобы вымыть. Ресуспендируют осадок клеток в 1 - 2 мл DMEM, дополненной 5% FBS и 1% P / S. Конечная концентрация суспензии клеток должно быть не менее 5000000 клеток на мл. Добавить 7-AAD (1: 100) и выдержать в течение 15 минут при комнатной температуре для мертвой клетки исключения. Для отрицательного контроля и одноцветных положительных контролей, ресуспендируют клеточных осадков в 0,5 мл DMEM, дополненной 5% FBS и 1% P / S.
  4. Перенесите все клеточные суспензии для круглым дном потока полистирола цитометрии труб. Подготовьте сбора клеток трубки (каждая трубка предварительно наполненный 500 мкл соответствующей культуральной среде: MPM для MECs; EGM-2 для персональных компьютеров; переменного тока среда для ACS). Транспорт клеточные суспензии на льду к клеточной сортировщика.
  5. Запуск клеточные суспензии на клеточной сортировки в порядке неокрашенной контроля, отрицательного контроля, одноцветных положительного контроля, и главной клеточной суспензии во время настройки интенсивности лазерного излучения, компенсацию канала, и клеточную популяцию стробирования строго, чтобы максимизировать клеток рurity (пожалуйста, обратитесь к статьям, опубликованным Юпитера и других журналов для деталей проточной цитометрии).
  6. Соберите нужные клеточных популяций в соответствующих пробирок. Хранить собранные клеток при 4 ℃ если не посев сразу.

4 Сообщение сортировки Клеточная культура

  1. Семенной отсортированный СОВС (p0) на <10000 клеток / см 2 в MPM на тарелки предварительно покрытых типа-я коллагена. Для последующего пассирования MECs, семян 3500 - 4000 клеток / см 2 в MPM на пластинами / колб предварительно покрытых типа-я коллагена.
  2. Семенной отсортированный ПК (p0) на <20000 клеток / см 2 в ВОСА-2 на тарелки недавно покрытых 0,2% желатином. Для последующего пассирования ПК, разбить ячейки в соотношении 1: 3 в PC среде (DMEM не дополненной 20% FBS и 1% P / S) на регулярных полистирол пластин культуры до Р2. От P3 вперед, семенные клетки в 6500 - 7000 клеток / см 2 в PC среды на регулярных полистирол культуры пластинами / колбах.
  3. Семенной отсортированный кондиционеров (P0) в <20000 клеток / см 2 в AC (DMEM с добавлением 20% FBS и 1% P / S) на регулярных полистирол пластин культуры. Для последующего пассирования кондиционеров, семенных клеток в 6500 - 7000 клеток / см 2 в AC среды на регулярных полистирол культуры пластинами / колбах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Параметры FACS сначала корректируется на основе данных, полученных из неокрашенной контроля, отрицательного контроля, и одноцветных положительного контроля данных. После исключения мертвых клеток, меченных флуоресценции суспензии клеток подвергают серии отрицательных и положительных маркеров клеточной поверхности выделений. Во-первых, CD45 + клетки закрытого типа перед CD56 + и CD56 - клетки отделяют от CD45 - фракцию. CD56 + фракции дополнительно подвергают селекци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Идентификация и очистка hBVSC субпопуляций представляют собой важный шаг вперед в постижении MSC онтогенеза. Существует все больше свидетельств, указывающих на периваскулярное происхождение МСК и связь между тканеспецифических клеток-предшественников и кровеносных сосудов 22-25. Кроме того, способность изолировать однородные субпопуляции из hBVSCs дальше СПИДа понимание MSC неоднородности и сосудистой клеточной биологии 26.

В последние несколько лет, MECs, ПК, и кондици...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

J.H. получала вознаграждение от Cook MyoSite, Inc. за консультационные услуги и роялти, полученные от лицензирования технологий в период проведения вышеупомянутого исследования. Все остальные авторы не имеют конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Элисон Логар за отличную техническую помощь с проточной цитометрии. Эта работа была поддержана грантами от Министерства обороны (JH), Генри Дж Манкин Обладая кафедры (JH) и Министерства образования и науки Республики Казахстан (AS). КХО была частично поддержана со стороны predoctoral общении Американской ассоциации сердца (11PRE7490001). M.Corselli при поддержке Калифорнийского института регенеративной медицины учебного гранта (TG2-01169).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллагеназа типа 1SigmaC5894Стерильный флакон
Коллагеназа типа 2SigmaC1764Стерильный флакон
Коллагеназа типа 4SigmaC1889Стерильный флакон
Anti-human CD34 APCBD Pharmingen555824Keep sterile
Anti-human CD45 APC-Cy7BD Pharmingen557833Keep sterile
Античеловеческий CD56 PE-Cy7BD Pharmingen 557747Keep sterile
Anti-human CD144 PEBeckman CoulterA07481Keep sterile
Anti-human CD146 FITCAbD SerotecMCA2141FKeep sterile
FACS Aria II Flow CytometerBecton-Dickinson
EGM-2 complete mediumLonzaCC-3162Для культивирования ПК (только P0)
DMEM с высоким содержанием глюкозы (1X), жидкий, с L-глутамином, без пирувата натрияInvitrogen11965Для культивирования ПК
DMEM high glucose (1X), жидкий, с L-глутамином, с пируватом натрияInvitrogen11995Для культивирования MEC и ACs
Фетальная бычья сывороткаInvitrogen10437-028
Термоинактивированная лошадиная сывороткаInvitrogen26050-088
Пенициллин/стрептомицинИнвитроген15140-122
Антибиотик-антимикотик (100Х)Инвитроген15240-062
Трипсин-ЭДТА 0,5% (10Х)Инвитроген15400-054
Дульбекко s PBS без кальция и магнияInvitrogen14190-250
Экстракт куриного эмбрионаAccurate ChemicalCE650T-10Фильтр перед применением

Ссылки

  1. Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
  2. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
  3. Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  4. Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
  5. Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
  6. Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
  7. Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
  8. Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
  9. Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
  10. Chen, C. -W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439(2012).
  11. Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
  12. Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
  13. Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
  14. Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
  15. Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
  16. Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499(2011).
  17. Chen, C. -W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
  18. Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
  19. Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
  20. Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
  21. Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
  22. Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
  23. Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
  24. Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
  25. Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
  26. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
  27. Chen, C. -W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
  28. Lin, C. -S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
  29. Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875(2012).
  30. Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение кровеносных сосудов, полученных мультипотентные прекурсоров от человека скелетных мышц
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.