Микрофлюидных Платформа для измерения хемотаксис нейтрофилов из необработанного цельной крови

Краткое содержание

Этот протокол детали по результатам анализа предназначен для измерения человеческого хемотаксис нейтрофилов из одной капли цельной крови с надежной воспроизводимости. Такой подход позволяет обойти необходимость разделения нейтрофилов и требует всего несколько минут для анализа времени на подготовку. Микрожидкостных чип позволяет повторное меру хемотаксис нейтрофилов в течение долгого времени у младенцев или мелких млекопитающих, где объем образца ограничено.

Аннотация

Нейтрофилы играют существенную роль в защите от инфекций и их номера в крови часто измеряется в клинике. Более высокие нейтрофилов в крови, как правило, является показателем текущих инфекций, в то время как низкие показатели нейтрофилов являются предупреждающий знак для более высоких рисков для инфекций. Для выполнения своих функций, нейтрофилы также должны быть в состоянии эффективно перейти от крови, где они проводят большую часть своей жизни, в ткани, где происходят инфекции. Следовательно, любые дефекты в способности нейтрофилов мигрировать может увеличить риск для инфекций, даже когда нейтрофилы присутствуют в соответствующих количествах в крови. Тем не менее, измерения миграции нейтрофилов способности в клинике является сложной задачей, которая требует много времени, требуется большой объем крови, и экспертные знания. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали надежные микрофлюидных анализов для миграции нейтрофилов, которая требует единого капельку необработанной крови, обстоятельствоотверстия необходимость разделения нейтрофилов и легко количественно на простом микроскопом. В этом анализе нейтрофилы мигрируют непосредственно от капли крови, через небольшие каналы, по направлению к источнику хемоаттрактанта. Для предотвращения гранулированный поток эритроцитов по тем же каналам, мы внедрили механические фильтры с прямым углом поворачивает, что выборочно блокировать продвижение красных кровяных клеток. Мы подтвердили анализа путем сравнения миграцию нейтрофилов из капель крови, собранных от пальца, и венозной крови. Мы также сравнили эти цельной крови (ВБ) источников с миграцию нейтрофилов из образцов очищенных нейтрофилов и нашел постоянную скорость и направленность между тремя источниками. Это микрофлюидных платформа позволит изучение миграции нейтрофилов человека в клинике и установке исследования, чтобы помочь продвинуть наше понимание нейтрофилов функций в норме и патологии.

Введение

Торговля нейтрофилов играет важную роль в определении прогресса и решение многих воспалительных заболеваний, в том числе атеросклероза ^1, бактериальной инфекции или сепсиса ² и ожогов ^3. Для их большой вклад в здоровье и болезни условиях, количество нейтрофилов является частью стандартного анализа крови часто считается в клинических и научно-исследовательских лабораторий. Тем не менее, несмотря на то, один из самых распространенных испытаний, значение количества нейтрофилов в диагностике инфекции и сепсиса неоднократно сомнение ^4. Например, одно исследование нейтрофилов в ожоговых больных показали, что число нейтрофилов и число нейтрофилов функция миграции не коррелируют; означающее рассчитывать уже о том нейтрофилов не является точным показателем иммунного статуса ^3. Хотя более трудно измерить, нейтрофилов функциональные компетенции был предложен в качестве более ценными в широком диапазоне условий.

т "> Важно отметить, что многие из нейтрофилов дефектов являются временными и не вызывают постоянных генетических дефектов, различие, которое не в значительной степени игнорируется в клинике до недавнего времени. В контексте ожогов, миграцию нейтрофилов может контролироваться в ходе Лечение пациента в качестве индикатора воспалительного статуса или инфекции ^3. Традиционные анализы миграции в настоящее время используются в лаборатории (Бойден камера, Данн камера, микропипетка анализа) не могут быть переведены в клинических условиях, так как они требуют больших объемов крови и громоздким времени методы изоляции нейтрофилов (табл. 1). Эти анализы также не может быть использован для мониторинга переходных изменений в хемотаксис нейтрофилов в мелких лабораторных животных, таких как мыши, так как объем крови, необходимый для выделения нейтрофилов позволяет только один образец, а часто и требуется объединение кровь из нескольких животных для одного анализа. Например, исследование с участием мultiple условия и процедуры на нескольких временных точках потенциально может потребовать тысячи мышей с использованием текущих хемотаксиса. Это ограничивает основную биологические исследования, что можно сделать, чтобы понять сложную динамику иммунной функции в контексте травмы, инфекции или записать часто изучаются в мышиных моделях ^5.

Чтобы удовлетворить потребность в нейтрофилов функциональном анализе, что является быстрым, надежным, но требует минимальный объем крови, мы разработали микрофлюидных устройство, которое измеряет хемотаксис нейтрофилов непосредственно из небольшого капли цельной крови. Известно, что многие факторы в цельной крови, в том числе сыворотки ⁶ и ⁷ тромбоцитов, влияет на функцию нейтрофилов. Поэтому выгодно, что весь Микрожидкостных кровь для анализа минимизирует пример обработки для поддержания микросреду в естественных условиях нейтрофилов при измерении изменения в хемотаксиса с помощью анализа ин витро ^8. Этот подходсокращает время от сбора крови для миграции нейтрофилов анализов от часов, используя традиционные методы, чтобы всего за несколько минут (табл. 1). Весь микрофлюидных крови платформа дает устойчивую линейную хемоаттрактантных градиент для длины эксперимента, не имеет движущихся частей, и не требует внешнего источника давления (т.е. шприц насоса). Ключевой особенностью в дизайне всей микрофлюидных крови устройства является включение эритроцита (РБК) фильтрации гребень, что механически фильтрует эритроциты от входа в миграционную канал устройства. Правые повороты этой фильтрации гребень предотвратить необходимость фильтрации гель, который, вероятно, будет забит эритроцитов и, следовательно, блокировать хемоаттрактантных градиент от достижения активно мигрирующих нейтрофилов в ВБ. Включение всей микрофлюидный крови устройства в 12 или в 24-луночный планшет облегчает скрининг нескольких медиаторов человека или мышиного хемотаксиса нейтрофилов сименно.

Протокол

1. Микрофлюидных Изготовление устройства

1. Использование стандартных методов фотолитографии, изготовить мастер-формы пластины в класс 1000 чистой комнате. Образец первый 3-мкм-тонкий отрицательный слой фоторезиста на основе эпоксидной смолы, чтобы определить миграционные каналы в соответствии с инструкциями производителя. План второй 50-мкм-толстый слой определить клеток-погрузочные и хемокинов камеры.
2. Используйте рисунком пластины, чтобы бросить полидиметилсилоксана (PDMS) устройств. Энергично перемешайте PDMS (20 г) с инициатором (2 г) в течение 5 мин с использованием пластиковой вилкой в ​​большой поднос весом пластиковой.
3. Осторожно залейте PDMS на пресс-форме.
4. Дегазации PDMS путем размещения формы с выливают PDMS в вакуумном эксикаторе в течение 1 часа.
5. Выпекать и вылечить PDMS микрожидкостных устройств для по крайней мере 3 часа в печь, установленную на 65 ° С
6. Выбивать центральные WBLCs используя перфоратор с диаметром кончика 1,5 мм.
7. Удар целые форме пончика устройств с использованием puncее с диаметром кончика 5,0 мм.
8. Удаления частиц из пончика устройств с помощью клейкой ленты.
9. Промыть 12-луночный планшет с деионизированной водой и затем сушат азотом. Поместите пластину в 60 ° С духовке в течение 5 мин.
10. Кислород плазменной лечить пластину 12-луночных дважды; один раз в одиночестве 35 сек, а затем снова с пончика устройств для другого 35 сек.
11. Аккуратно положите устройств в лунки планшета с помощью пинцета.
12. Выпекать пластина с таможенных устройств на горячей плите, установленной до 80 ° С в течение 10 мин.

2. Микрофлюидных Анализ Подготовка

1. Первичные микрожидкостных устройств сразу же после плазменной обработки кислородом, когда устройство является гидрофильным и капиллярные эффекты могут способствовать примирование малых каналов в устройстве.
2. Создание хемоаттрактантных решение путем смешивания 5 мкл FMLP [исходный раствор 10 мкм] с 5 мкл фибронектин [раствор 1 мг / мл] и 490 мкл HBSS.
3. Медленно пипетка & #160; хемоаттрактант решение в WBLC, используя гель загрузки наконечник (рис. 1А). Пипеткой еще 20 мкл хемоаттрактанта вокруг внешней части устройства.
4. Поместите пластину в эксикаторе в течение 15 мин. В вакууме с устройством, раствор закапывают в боковых каналах устройства и смещенного воздуха рассеянного наружу через PDMS.
5. Удалить пластину с эксикаторе и подтвердите смачивание канале прибора под микроскопом. Смотреть, как пузырь становится меньше, хемоаттрактант раствор поступает в камеру. Ни один пузырь не должен присутствовать в устройстве после вакуумной обработки.
6. Вымойте WBLC и снаружи устройства полностью, чтобы удалить излишки раствора хемоаттрактантных. Этот шаг создает градиент хемоаттрактанта от каждой из целевых хемотаксических камер (FCCS) к центру устройства.
   1. Заполните 1-мл шприц с PBS, добавить тупым кончиком иглы 30 G, чтобы шприц. Аккуратно вставьте кончик шприца в иглув центре отверстие пончика. Аккуратно нажмите 100 мкл PBS в отверстие так, чтобы капли PBS форм на верхней части устройства.
   2. Tilt пластины и пипеткой 1 мл PBS вокруг устройства таким образом, что жидкость собирается в нижней части скважины. Аспирируйте жидкость и повторите процесс для общей сложности 3 раза, используя свежий буферный раствор (использование средств массовой информации, а не буфером, если разделенные нейтрофилы будет загружен в СМИ) ^9.
7. Заполните каждую лунку со средствами массовой информации до верхушки устройств не погружена под жидкости. Пусть устройства сидеть в течение 15 мин, чтобы позволить градиент стабилизироваться. Экспериментальные результаты и теоретические данные из конечных моделирования элементов показывают, что градиенты в этих устройствах стабильны до 24 часов для малых молекул (например, FMLP) и до нескольких дней для увеличения молекулярной массы (например, IL8).
8. Использование советы гель загрузки, медленно пипетки 2 мкл крови (или отдельные нейтрофилы) в каждой всей лоа кровидинь камера (WBLC) (рис. 1А).

3. Подготовка образца

Нейтрофилов человека из капиллярной крови

1. Сбор капиллярной крови из пальца, здорового добровольца, который находится в не иммунодепрессантов. Все образцы пациентов были получены с письменного информированного согласия, и в соответствии с процедурами, утвержденными MGH и Shriners Институциональные советов.
   1. Для палец укола сбора крови, мыть руки водой с мылом и высушить кожу. Подготовка anti-coagulant/stain маточного раствора путем добавления 1 мл HBSS + 0,2% HSA и 10 мкл Hoechst пятно (32,4 мкм) до гепарин пробирку для сбора крови (1,65 USP/50 мкл крови). Уколите палец с помощью предохранительный SurgiLance ланцет (2.2-мм глубина, 22 г), вытереть первую каплю крови и собрать 50 мкл крови в пробирку Эппендорф, содержащий фондовый антикоагулянт и Hoechst решение флуоресцентным красителем (10 мкл) и осторожно перемешать.
2. Инкубировать кровь и Hoechst пятно в течение 10 мин, чтобы обеспечить ядра флуоресцентного окрашивания. Запустите образец в течение 1 часа сбора крови.

Нейтрофилов человека из венозной крови

3. Ничья 10 мл периферической, венозной крови в пробирки, содержащие 33 USP гепарина.
4. Добавить 50 мкл венозной крови в средствах массовой информации и Hoechst пятна, как описано выше. Инкубировать кровь и Hoechst пятно в течение 10 мин, чтобы обеспечить ядра флуоресцентного окрашивания. Запустите образец в течение 1 часа сбора крови.

Нейтрофилов Разделение из цельной крови - Положительный контроль

5. Чтобы отделить нейтрофилы, используют стерильные методы, чтобы изолировать нейтрофилов с 10 мл венозной образца цельной крови с использованием Hetastarch (6% вес / объем) в градиенте плотности с последующим негативной селекции магнитный шарик изоляции набора в соответствии с протоколом производителя.
6. Ресуспендировали окончательный аликвоты нейтрофилов в концданию 4000 клеток / мкл 1X в HBSS + 0,2% сывороточный альбумин человека. Держать клетки при 37 ° С до готовности запустить эксперимент.

4. Микроскопия и анализ изображений для хемотаксиса нейтрофилов измерений

1. Настройка температуры biochamber до 37 ° С, влажность при 80% и СО ₂ на уровне 5%.
2. Начните с изображениями сразу с помощью покадровой обработки изображений на микроскопе (10X или выше увеличения).

5. Статистический анализ

1. Вручную отслеживать по крайней мере 50 нейтрофилов у каждого образца.
2. Граф клеток, входящие в FCC с течением времени (рис. 2).
3. Рассчитать нейтрофилов скорости в канале между WBLC и FCC, используя ImageJ (NIH) (рис. 2).
4. Количественная направленность нейтрофилов путем подсчета количества клеток, которые проходят до развилки и расчете соотношения между числом клеток, которые превращаются в сторону FCC и клеток, которые выхода йе устройство. Клетки, которые не направленная не следуют хемотактическую градиент и поэтому мигрируют в равном количестве по отношению к ФКС и выходном канале (рис. 2).

Результаты

Весь в крови (ВБ) нейтрофилов хемотаксис анализа была подтверждена путем измерения накопления нейтрофилов к градиентом FMLP (фильм S1). Результаты подтверждают, что эритроциты захватываются фильтрации гребень в то время как нейтрофилы (синие) способны активно мигрировать из цельной крови (рис. 3А и фильм S1). Стабильная линейный градиент хемоаттрактант (зеленый), сформированный на всей микрофлюидный крови устройства была подтверждена с использованием FITC-меченого декст...

Обсуждение

В этой работе, мы разработали микрофлюидных платформу для измерения хемотаксис нейтрофилов от капли крови (2 мкл). Механическая фильтрация на-чипе эритроцитов из активно мигрируют нейтрофилы обходит необходимость в громоздких методов разделения клеток, таких как градиенты плотности ^10, позитивной селекции ^11, или негативной селекции ^12, склонных ввести артефакты, активизируя нейтрофилы. Механическая фильтрация эритроцитов отличает нашу технологию от других микрожидкостных чипов для зонди...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
полидиметилсилоксан (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Стандартные стеклянные горки	Fisher Scientific	125495	1 X 3 дюйма
Стеклянная нижняя пластина	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, диаметр наконечника 5,0 мм	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, диаметр наконечника 1,5 мм	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-load-pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Шприц	Fisher Scientfic	309602
игла с тупым концом, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, гепарин	Бектон Дикинсон
HBSS	Sigma-Aldrich
Сывороточный альбумин человека	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0,2% конечная концентрация в HBSS
Фибронектин	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
Предохранительный ланцет SurgiLance, глубина 2,2 мм, 22 г	SLN240
Hoescht морилка	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Набор для обогащения нейтрофилов человека	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Плазменный Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Прецизионный пинцет из нержавеющей стали	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Химически стойкий вакуумный эксикатор	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Цифровая горячая плита	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE инвертированный микроскоп	Nikon - Micro Video Instruments Inc.
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd объектив	Nikon - Micro Video Instruments Inc.
люмен 200 с световодом 2 метра для Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Узкополосные 32-мм возбудители - 25-мм излучатели	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 охлаждаемая ПЗС-камера 1,600 x 1,200 пикселей	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	РЕТ-2000Р-Ф-М-12-С