Выделение мРНК, связанных с митохондриях дрожжей для изучения механизмов локализованных перевода

Краткое содержание

Многие мРНК, кодирующих митохондриальные белки связаны с внешней мембраны митохондрий. Мы описываем субклеточную процедуру фракционирования, направленную на изоляцию митохондриях дрожжей и связанные с ним мРНК и рибосом. Этот протокол может быть применен к клеток, выращенных в разнообразных условиях с целью выявления механизмов локализации мРНК и локализованный перевод около митохондрий.

Аннотация

Большинство митохондриальных белков закодированы в ядре и должны быть импортированы в органеллы. Импорт может произойти в то время как белок синтезируется около митохондрий. Поддержка этой возможности является производным от недавних исследований, в которых были показаны многие мРНК, кодирующие митохондриальные белки, которые будут локализованы в митохондриях близости. Вместе с ранее демонстраций ассоциации рибосомы "с наружной мембраны, эти результаты предполагают, локализованный процесс перевода. Такие локализованные перевод может повысить эффективность импорта, обеспечить уникальные сайты регулирования и минимизировать случаи эктопической экспрессии. Различные методы были использованы, чтобы охарактеризовать факторы и элементы, которые опосредуют локализованного перевода. Стандартный среди них внутриклеточного фракционирования дифференциальным центрифугированием. Этот протокол имеет преимущество изоляции мРНК, рибосом и белков в одной процедуры. Они могут характеризоваться различными молекулярными и Biрадиохимический методы. Кроме того, транскриптомику и протеомики методы могут быть применены к полученного материала, тем самым позволяют генома Insights. Использование дрожжей в качестве модельного организма для таких исследований имеет преимущества скорости, расходов и простоты. Кроме того, передовые генетические инструменты и доступные штаммы удаления облегчить проверку факторов кандидатов.

Введение

Эукариотические клетки организованы в различных отсеках, имеющих определенные функции. Чтобы выполнить свою функцию, каждый отсек содержит уникальный набор белков, которые необходимы для его деятельности. Возможным механизмом, посредством которого эти белки подходят к своей отсек является локализованной перевода ^1,2. В этом процессе, белок синтезируется в пункт назначения по рибосом и мРНК, которые расположены там. Среди несомненных преимуществ локализованного перевода увеличивается эффективность таргетинга белка, уменьшается потребность в белковых сопровождающих, и позволяет механизмы регулирования по каждому конкретному объекту. Кроме того, локализованны....

Протокол

1. Митохондрии Очистка

Взвесьте осадок клеток. Примерно 0,6 г получают из 100 мл клеток.

1. Расти 100-150 мл дрожжевых клеток в OD ₆₀₀ = 1-1,5 на 30 ° С на среде роста nonfermentable, таких как галактоза основе ростовой среды, с тем чтобы обогатить для митохондрий.
2. Центрифуга клетки при 3000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
3. Вымойте гранул с дважды дистиллированной воде и центрифуги снова. Удалите супернатант.
4. Ресуспендируют осадок в 1 мл буфера на DTT 0,5 г клеток. Важно, чтобы лечить клетки с восстановителем, чтобы разорвать дисульфидных с....

Результаты

Этот протокол позволяет разделение на митохондрии, содержащие фракции из цитозольных компонентов. Лучший способ проверить свой ​​успех является выполнение северную анализ и западную анализ (рис. 1) с образцами из разных стадий выделения. Три параметры качества изоляции являются производными от этих анализов. Во-первых, является ли целы РНК или белки в образцах - это будет обнаружен как отдельных полос в анализах. Деградация события будут вызывать появление дополнительных, более короткие полосы или мазко.......

Обсуждение

Технологические достижения в визуализации уступил инструменты с высоким разрешением для изучения локализации мРНК. Сегодня можно измерить движение даже одной молекулы мРНК в мс масштабе времени ^23-26. Тем не менее, традиционные биохимические методы, как описана выше, также информативным и являются предпочтительными в некоторых случаях. Биохимические изоляция позволяет очистку большого репертуара мРНК и белков, и, следовательно, предпочтительным для генома исследования. В одном изоляции, можно получить достато.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дрожжевой экстракт
BactoPeptone
Galactose			Не автоклавируйте
Среда			Для обогащения митохондрий следует использовать любой неферментируемый источник углерода, например, питательную среду на основе галактозы стерилизованную 1% дрожжевого экстракта, 2% BactoPeptone, 2% галактозу
0,1 M Tris-HCl, pH 9,4
30 мМ Tris-HCl, pH 7,6
Дитиотреитол (DTT)
10 мМ DTT Buffer			0,1 M TrisHCl pH 9,4, 10 мМ Дитиотреитол (DTT). Делайте каждый раз свежим
1,2 М Сорбит
4 мМ KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μ m фильтр
Zymolyase Buffer			1,2 М сорбит, 4 мМ KH2PO4 , 16 мМ K2HPO4. Фильтруем этот буфер (0.2 μ m) и хранить при комнатной температуре для впрок
Zymolyase 20T			20 000 Ед/г
Восстановительная среда			Питательная среда на основе галактозы с добавлением 1 М Сорбит
0,1 мг/мл Циклогексимид (CHX)
0,6 М Маннитол
5 мМ MgAc
100 мМ KCl
0,5 мг/мл Гепарин
1 мМ Фенилметансульфонилфторид (PMSF)
Буфер			0,6 М Маннитол, 30 мМ Трис-HCl pH7,6, 5 мМ MgAc, 100 мМ KCl. Добавить свеже: 0,5 мг/мл Гепарина, 0,1 мг/мл CHX и 1 мМ (PMSF). Отфильтруйте этот буфер и используйте его ледяной
8 М Гуанидиний-HCl
100% и 70% этанол (EtOH)
3 М Ацетат натрия, pH 5,2
10 М Стоковый раствор
LiCl 250 мМ Tris HCl pH 6,8
SDS
Глицерин
β-Меркаптоэтанол
бромофенол синий
4x LSB			250 мМ Tris HCl pH 6,8, 8% SDS, 40% глицерин, 20% β-меркаптоэтанол и 0,02% бромофенол синий
гомогенизатор Dounce емкостью 15 мл оснащен плотно прилегающим пестиком

для роста галактозы маннита