Method Article

Анализ связывания Высокая пропускная МНС II для количественного анализа пептидных эпитопов

DOI:

10.3791/51308

March 25th, 2014

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (mM)20
Vol. MHC II Stock to Add (ml)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

to:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (μM)20
Vol. MHC II Stock to Add (μl)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биохимические анализы с рекомбинантных молекул MHC II человека может обеспечить быстрые, количественные понимание иммуногенному идентификации эпитопной, удаление или дизайн. Здесь, анализ связывания пептида-MHC II масштабируется до 384-луночных планшетах описывается. Это экономически эффективное формат должен оказаться полезным в области белка deimmunization и дизайна и разработки вакцины.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биохимические анализы с рекомбинантных молекул MHC II человека может обеспечить быстрые, количественные понимание иммуногенному идентификации эпитопной, удаление или дизайн 1,2. Здесь, анализ связывания пептида-MHC II масштабируется в формате 384-а. Уменьшено протокол снижает затраты реагентов на 75% и более высокую пропускную способность, чем описано выше протоколы 96-а 1,3-5. В частности, экспериментальная конструкция позволяет надежную и воспроизводимую анализ до 15 пептидов против одной МНС II аллеля на 384-а ELISA пластины. Использование одного обработки робота жидкости, этот метод позволяет исследователю анализировать примерно девяносто тестовые пептиды в трех экземплярах в диапазоне восьми концентраций и четырех типов аллелей MHC II менее чем за 48 часов. Другие работающие в области deimmunization белка или проектирования и разработки вакцины могут найти протокол, чтобы быть полезным в содействии их собственную работу. В частности, шаг за шагом инструкции и визуальном форматеЮпитера должны разрешить другим пользователям быстро и легко установить эту методологию в своих собственных лабораториях.

Introduction

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белки являются самым быстрорастущим класс терапевтических агентов 6, и быстрое расширение биотерапевтических трубопроводов была сосредоточена больше внимания на проблемы, связанные с развитием и использованием белковых препаратов. Одной из уникальных рассмотрение проистекает из того факта, что в здоровой и функционирующей иммунной системе, все внеклеточные белки дискретизированных с помощью антиген-представляющих клеток (АРС). После интернализации АПК, белок расщепляется на небольших пептидных фрагментов, и предполагаемые иммуногенные сегменты будут загружены в паз класса II главного комплекса гистосовместимости (MHC белков II). Комплексы пептид-МНС II зат....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Четыре основные мероприятия включают в себя анализ связывания пептида-MHC II: 1-Переплет: тест-пептидов конкурировать с меченых пептидов контроля за фазу раствора связывания растворимых белков MHC II. Связывание измеряется в широком диапазоне концентраций пептида испытаний. 2-захвата: После реакции связывания приближается к равновесию, комплексы пептид-МНС II захвачены и отделяется от несвязанного пептида и белка путем конформационно-зависимые распознавания с иммобилизованным антителом. 3-обнаружения: Захваченные контрольный пептид количественно обнаружены с помощью временным разрешением флуоресценции. 4-анализ: Спектроскопические данные обрабатываются, построенные и....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зрелый пептид последовательность из Enterobacter клоаки P99 бета-лактамазы (BLA) (GenBank ID # X07274.1) анализировали с ProPred 16 для предполагаемых пептидных связующих до МНС II аллеля DRB1 * 1501 (табл. 4). ProPred определены 117 нонамера пептиды с обязательным Р1 якоря остатка (т.е. M, L, I, V, F, Y или W в положении 1, который необходим для MHC II связывания 31). В 5% порога, только пептиды с баллами больше или равно 2,6 вероятные связующие. Таким образом, н.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биотерапевтических зарекомендовали себя в качестве краеугольного камня современной медицины, представляющие четыре из пяти лучших продающих наркотики в 2012 году 32. Сектор биофармацевтика показал устойчивый рост в течение нескольких лет 6, и постоянное развитие новых препаратов, а также появление биоподобий расширила биофармацевтических трубопроводов. Заглядывая в будущее, оценки и смягчения иммуногенность белков терапии станет неотъемлемой частью развития биотерапевтический ранней стадии. Для обл.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Леонард Моисей работает на и держит опционы на акции EpiVax, Inc, компании в частной собственности биотехнологии, расположенный в Провиденсе, Род-Айленд. Работа содержится в данном отчете непредвзятыми, которые могут быть связаны с коммерческими целями компании.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH гранты R01-GM-098977 и R21-AI-098122 для ЦБК и бочкой. RSS частично поддержана на стипендии Фонда Luce и частично за счет программы Тайер Инновации стипендий от Thayer техническая школа.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Тетраборат натрия ДекагидратСигма221732
лимонная кислотаСигмаC1901
Двухосновной фосфат натрияСигмаS7907
Тризма HClOmniPur9310
Твин-20СигмаP7949
100% ДМСОСигмаD8418
Октил-& beta;-D-GlucopyranasideFischer29836-26-8
Pefa Bloc SCFRoche1158591600
Dulbecco' s 10x Фосфатный буферный растворInvitrogen14200-166
Буфер для анализа DELFIAPerkin Elmer4002-0010
Буфер для усиления DELFIAPerkin Elmer4001-0010
Меченый Europium стрептавидинPerkin Elmer1244-360
L243 антитело против HLA-DRBiolegend 307602
Biotinylated индикаторные пептиды21st Century BiochemicalsCustom Order
Тестовые пептиды (1-4 мг, чистота 85%)GenscriptCustom Order
Очищенные мономеры HLA-DRB1 (не биотинилированные)Benaroya Research Institute*Индивидуальный заказ
384-луночный белый EIA/RIA планшетThermo460372
полипропиленом 384-луночный планшетCostar3656
Пленка, AxySeal, 80 & микро; м, Аппликатор ELISA Axygen AscientificPCR-SP
MilliQ WaterN/A N/A
Epimotion Liquid Handler (или аналогичный)Eppendorf5075
Select TS Plate Washer (или аналогичный)BioTek405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (или аналогичный)Molecular DevicesN/A
* Рекомбинантные молекулы MHC II человека можно получить в лаборатории ядра Benaroya Tetramer Core Laboratory. См.: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MHC II Binding AssayPeptide Epitope AnalysisHigh Throughput ELISASolution Phase CompetitionTime Resolved FluorometryPeptide MHC II ComplexImmunogenic Epitope IdentificationProtein DeimmunizationVaccine DesignLiquid Handling Robot

Related Articles