Неонатальный пиальных поверхности Электропорацию

Краткое содержание

Пиальных поверхности зона является уникальной предшественников в ЦНС, что уделяется все большее внимание. При этом мы подробно способ быстрого генетической манипуляции этой зоны предшественников с использованием модифицированного метода электропорации. Эта процедура может быть использована для клеточных и молекулярных исследований клеточных линий и сигнальных путей, участвующих в дифференцировке клеток и выяснить судьбу и свойства дочерние клетки.

Аннотация

За последние несколько лет пиальных поверхность была определена в качестве зародышевого нише значение во время эмбрионального, перинатальной и взрослых нейро-и глиогенеза, в том числе после травмы. Тем не менее, методы генетически допрашивать этих групп населения предшественников и отслеживания их клоны были ограничены из-за отсутствия специфичности или времени производство вирусов. Таким образом, прогресс в этой области был довольно медленным только с горсткой исследований этого месте. Электропорация была использована уже более десяти лет, чтобы изучить нервные свойства стволовых клеток в эмбрион, а в последнее время в послеродовом мозга. Здесь мы опишем эффективную, быструю и простую технику для генетических манипуляций пиальных поверхностных предшественников на основе адаптированной для электропорации подхода. Пиальных поверхность электропорации позволяет легкому генетической маркировки и манипуляции этих предшественников, тем самым представляя экономия времени и экономичный подход к изучению этих клеток.

Введение

Нервные стволовые и клетки-предшественники присутствуют в ЦНС млекопитающих ^{1, 2.} Их природа и свойства в эмбриональных и взрослых зародышевых зонах, окружающих желудочковой области мозга и спинного мозга были хорошо документированы в последнее десятилетие ^1-3. В значительной степени это было связано с развитием более точных генетических инструментов, таких как нервная система конкретного Cre рекомбинации floxed аллелей или ретровирусов линии трассировки ^4. Тем не менее, один регион-прародитель относящийся к мягкой мозговой оболочке поверхность предшественников зона-недавно был описан только в деталях ^5-7 и ждет комплексное обследование.

Пиальных поверхность мозга определяется как интерфейс между поверхностью мозга и окружающих мозговых оболочек ^8. Во время развития нейроэпителиальные, а позднее, радиальные глиальные конечные футов приложить к этой поверхности ^9,10. Некоторые из пихтыул нейроны в мозге человека и многих нейронных митозов наблюдаются в этом регионе ^11. Позже, во время эмбрионального нейрогенеза, корковых интернейронов, как известно, пройти пиальных регион, в дополнение к их миграционных путей в промежуточной зоне и субвентрикулярной зоне ^12-14. В течение этого периода, стволовые клетки можно культивировать из этой зоны, и это, кажется, активный центр нейро-и глиогенеза ^5. Во взрослом мозге, было сообщено, что интернейроны может родиться от пиальных поверхностных предшественников следующее гипоксического вызов ^7. Тем не менее, вклад этой области, чтобы его в genensis во время эмбрионального и постнатального развития остается неясным, в частности в связи с трудностью специально расследование этого региона ^6. В верхний бугорок и в коре головного мозга, поверхностные (или слой I в коре) интернейроны может модулировать схему вывода основных возбуждающих популяций нейронов и тем самым способствовать significantly к функции этих структур. В частности, слой 1 интернейроны находятся в позиции, чтобы регулировать возбуждения нейронов на протяжении верхних слоях коры головного мозга с учетом их Широкие возможности подключения к поверхностных и глубоких слоев коры колонн ^15,16. Аналогичным образом, горизонтальные интернейронов возбуждающих получать ввод от коры и сетчатки волокон, проекта в относительно широком области и предположили, посредником ингибирование нейрональных популяций, ответивших на удаленном зрительных стимулов ^17,18. Кроме того, их морфология хорошо подходит играть потенциальную роль в узорной волновой активности в развивающихся зрительной системы ^19. Интересно, что развитие интернейронов и созревание происходит в значительной степени после рождения. Кроме того, этот процесс созревания было установлено, регулируется нейронной активности и, следовательно, субстрат пластичности развития с пожизненных последствий для функции схемы ^20,21. Примечательно, что пO промоторы описаны который может специфически нацелены эти клетки трансгенно. Разделительные предшественники могут быть направлены с ретровируса ^7, но производство вируса занимает много времени и требует навыков, получая высокие титры клеток, необходимых для трансдукции.

Электропорацию привело к возрождению в изучении нервной системы, так как позволяет для быстрого и эффективного генетического допроса сигнальных путей в нейронных клеток-предшественников ^{4, 22, 23.} Электропорации включает инъекции плазмидной ДНК, после чего доставки электрических импульсов к внешней части головы, в одном направлении приведения в действие ДНК в пролиферирующих клеток-предшественников, окружающих желудочки ^{4, 22, 23.} Электропорации, как представляется, требуют транзит через клеток М-фазе клеточного цикла для экспрессии трансгенов плазмидных ^24. В частности, было обнаружено, что толькоклетки, проходящие через M фазы в 8 часов электропорации плазмид выразит трансгены, несмотря на их эффективной доставки всех клеток в ~ 160 мкм желудочковой стенки ^24. Он предположил, что это связано с необходимостью срыва ядерной оболочки в разрешении ядерной доступа из эписомные плазмид, как химические вещества, вызывающие ядерной пермеабилизации может индуцировать экспрессию плазмид в пост митотических клеток ^25. Первоначально использовали в эмбрионе ^22, электропорацию был адаптирован для использования в послеродовом мозга гораздо позже ^{26, 27.} В последнее время мы приспособились электропорации для использования в генетических манипуляций пиальных поверхностных предшественников ^6. Кроме того, с помощью этого подхода мы показали, что там, по-видимому два различных происхождений предшественников в этой области-межнейронной и астроцитов ^6. Этот протокол детали простой, быстрый, и мощный способ предназначаться эти клетки для допросаразвития механизмов, регулирующих этих клеток.

Протокол

Эта процедура в соответствии с требованиями Cedars-Sinai IACUC. Следователи должны обеспечить институциональную соответствие IACUC до судебного разбирательства. Все инструменты и реагенты должны быть стерилизованы перед использованием.

1. Подготовка Tools, решения, и ДНК смесь

1. Вставьте 100-мм Fire полированного боросиликатного стекла капилляров в микропипетки съемник. Установить отопление для обеспечения стандартного средневзвешенного тянуть, чтобы сформировать пипетки приблизительно 17,5 мм. Cut наконечники с острыми хирургическими ножницами на расстоянии примерно 8-9 мм от начала наконечника, чтобы создать примерно отверстие диаметром мкм в 100.
2. Сделать запас на 1% м / о быстрой зеленые решения путем смешивания отфильтрованного нуклеазы без воды (с использованием шприца фильтр 20 мкм) с сухим быстрого зеленый.
3. Изолировать очищенной эндотоксина свободной ДНК плазмиды, что высококонцентрирована (т.е.> 3 мкг / мкл), разбавленный в Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера. Добавить желаемых количеств плазмидык смеси разводили в ТЕ-буфере и добавить соотношение 1:10 в 1%-зеленому раствору быстрого приготовления (0,1% вес / объем конечной концентрации быстрого зеленый). Использование 0,5-2,0 мкг / мкл конечной концентрации плазмиды для надежной экспрессии трансгенов.

2. Животное Анестезия, Внесите загрузка и мягкой мозговой оболочки поверхности плазмиды впрыска

1. Вызвать гипотермии анестезии на 1-2 день после рождения мышей, разместив их на чашку Петри, который помещен на льду в течение 5-8 мин (время зависит от щенка возраста / веса). После гипотермии подтверждается отсутствием движения от ног-зажимая и / или хвостовой рефлекса у мышей готовы быть введен. Поместите животных обратно на лед, если боль рефлексы очевидны. Процедура инъекции и электропорации занять менее 2-3 мин в общей сложности, так что время гипотермия, раствор для инъекций, и процедуры электропорации соответственно для поддержания соответствующего анестезии.
2. Во время анестезии с использованием стандартного пипетку осторожно пипеткой требуемое количество plasmiг смешать, который будет введен (0,5-2 мкл) на кусок парафина фильма для справки. Здесь, общий объем 0,5 мкл плазмиды смеси впрыскивается. Далее, используя микро инжектор, осторожно вставьте собранный стакан капиллярную пипетку в пробирку, содержащую плазмиду смеси. Принять дополнительные меры предосторожности, чтобы предотвратить наконечник от взлома, убедившись, это не прикасайтесь к краям трубки. Аспирируйте решение в пипетку, медленно набирая назад переноса диск. После того, как был обеспечен достаточный объем загружалась в пипетку, не набрать вперед, пока давление возвращается в нейтральное положение от 0 гПа.
3. Использование 300-450 гПа давление для инъекций для обеспечения соответствующего давления для равномерное заполнение пиальных поверхности / менингеального пространства, поместить кончик рядом с пипеткой парафин отсчета фильм инъекции (от 2.2) и использовать педаль от микро форсунки, чтобы извлечь один Объем на парафина фильма. Отрегулируйте давление соответственно пока количество выбрасывается не сравняется с ранее пипеткой Ссылки на сайтыэ объем.
4. После того, как кончик была уравновешена и анестезии был подтвержден, щенки готовы для инъекции.
5. Целью эксперимента является придать плазмиды микс под черепом и выше пиальных поверхности, чтобы позволить для электропорации ДНК вниз в мягкой мозговой оболочки поверхностных предшественников (рис. 1А). Для коры инъекций, удерживайте щенка вниз, используя большой палец и указательный палец менее доминирующей рукой. Корковые полушарий и другие поверхностные структуры, такие как улучшенные двухолмия могут видеть между P0 и P2, что позволяет легкому адресности этих структур (рис. 1В). Использование доминирующую руку и целевой нужный область коры (т.е. двигателя, соматосенсорной и т.д.), вставьте пипетку мимо кожи и черепа, заботясь, чтобы избежать мозговых артерий. Убедитесь, чтобы предотвратить дальнейшее проникновение наконечника мимо черепа (на что указывает отсутствие дальнейшего сопротивления только после прокалывания череп).
6. Введите плазмуID решения с помощью ножной педали из микро форсунки и убедитесь, что он рассеивает равномерно по всей ткани (рис. 2А).
   Примечание: Очень важно, чтобы эмпирически определить подход, который максимизирует доставку плазмидной избегая гематому из-за давления жидкости. Это может быть сделано путем регулировки длительности впрыска, угол, объем, и точное значение целевой сайт, чтобы избежать нарушения сосудов.
7. Обязательно попробуйте и держать кончик от высыхания между инъекциями, поместив кончик в каплях испытаний от инъекций, сделанных ранее на вощеную бумагу или пластиковую парафиновой пленки. Это необходимо, чтобы предотвратить накопление кончика испаряется и Crystalized раствора ДНК, что может привести к закупорке наконечника и объемов поставок, несовместимых.

3. Электропорацию

1. Установите электропоратора в 135-150 V в течение пяти импульсов, длительностью 50 мсек, с 950 мс с интервалом между каждым импульсом. Для того чтобы увеличить проводимость ипредотвратить сжигание кожи, накрыть 3-мм платиновые tweezertrodes с электропорации геля. Проверьте ног-щипать и хвостовой рефлексов в этой точке для обеспечения анестезии. Если отзывчивый, разместить на льду в течение нескольких минут обезболить.
2. Для коры (и верхний бугорок) инъекций, используют 3-мм электрод (рис. 2б), чтобы увеличить жизнеспособность щенков (по сравнению с 7 - и 10-мм электродами, которые используются для зоны желудочка электропорации). Поместите отрицательно заряженный зонд электрода над области инъекции и положительно заряженного зонда вокруг противоположной области под глазами такой, что ориентация электрод находится при 45-60 ° углом по отношению к срединной линии (рис. 2в).
3. Используйте педаль электропоратора чтобы вызвать ток и удерживайте tweezertrodes на месте в течение 3-5 импульсов, в зависимости от щенка возраста и веса, эффективно ориентации ДНК в основных пиальных поверхностных клеток при учете кривизныполушарий.
   Примечание: отрицательный полюс может быть охватила области инъекции в между импульсами или больше электрод может быть использован, чтобы увеличить площадь электропорации.
4. Сразу после электропорации, тщательно счистить гель от щенков и разместить их под инфракрасной лампой в течение примерно 5 мин.
5. Щенки будут остро теряют естественной красновато-розовый оттенок в минут после электропорации из-за цианоз. Соблюдайте щенков для восстановления естественного цвета и началом нормального движения перед их возвращением в их клетки.
6. Убедитесь ресоциализации с матерью, наблюдая приносит ли она щенков обратно в гнездо и начинает холить их. Если она становится агрессивным, убедитесь, что щенки не имеют остатки геля и инкубировать их с некоторыми из постельных принадлежностей передать запах щенков.

4. Модификации Ориентация Улучшенный двухолмия

Ориентация:

1. ИнчжеКТ верхний бугорок таким же образом, что и коры, но отметили, что целевой регион находится только задняя и боковая лямбда и примерно по срединной линии (рис. 3А и 3В). С успешных инъекций, плазмиду смесь естественно заполняет контуры верхний бугорок. После инъекции были сделаны успешно, животные готовы к электропорации.

Электропорацию:

1. В очень же образом, для превосходного инъекций бугорок, поместите отрицательно заряженный зонд электрода над области инъекции и положительно заряженной зонда вокруг глаз, морды или подбородок, вождение ДНК в поверхностные регионах верхний бугорок (рис. 3C) . В этом случае, ориентация электрод находится на 25-40 ° углом по отношению к средней линии.

Результаты

Пиальных поверхностные электропорации приводит к экспрессии ДНК плазмиды в клетки-предшественники в основном-на или вблизи пиальных поверхности ^6. Более конкретно, ориентация электродов имеет решающее значение в диктовать направление движения плазмиды и последующей экспрессии. Таким образом, в конфигурации с двумя электродными, плазмиду направлен в почти прямую вектора между отрицательным и положительным электродом. Поэтому, если отрицательный полюс находится над месте инъекции, а положительный полюс вентраль...

Обсуждение

Самый важный аспект для успешного электропорации пиальных поверхностных предшественников являются: 1) адресности плазмиды смеси, чтобы пиальных поверхности; 2) предотвращение генерацию гематом в месте инъекции; и 3) избежать смертности, связанных с среднего мозга электропорации.

Соответственно ориентации пиальных поверхность осуществляется измеренного и тщательного прокалывания черепа, чтобы избежать проникновения пиальных поверхности. Неправильное ориентации на покрывающей кожи или основной...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Боросиликатные трубки огневой полировки	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Съемник микропипеток	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Цифровой микроинъектор	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3-мм Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Инфракрасная тепловая лампа	VWR	36547-009
Ножницы Sharp	Fine Science Tools	14060-09