Тканевая инженерия из стромальных опухолей микроокружения с применением к клеточной Рак Invasion

Summary

Ткань инженерии фибробластов, полученных родной матрица является новым инструментом для создания стромы субстрат, который поддерживает пролиферацию эпителиальных клеток и дифференцировки. Вот протокол применения этой методологии для оценки воздействия различных видов клеток стромы на опухоль клеточной биологии представлен.

Abstract

3D органотипической культуры эпителиальных клеток на матрице с встроенной мезенхимальных клеток широко используется для изучения эпителиальных клеточной дифференциации и инвазии. Тип крысиный хвост коллагена и / или матрица получена из Engelbreth-Холм-Swarm мыши клеток саркомы были традиционно используются в качестве субстратов для моделирования матрицу или стромы микросреду, в которую мезенхимальные клетки (обычно фибробластов) заселены. Хотя эксперименты с использованием таких матриц очень информативным, можно утверждать, что в связи с первостепенной присутствии одного белка (например, в типа I коллаген) или высоким содержанием компонентов мембранных подвальных и факторов роста (например, в матрице, полученной из мыши клетки саркомы), эти подложки не наилучшим образом отражают вклад в матричной композиции, сделанное стромальных самих клеток. Для изучения родных матрицы, произведенные первичных фибробластов дермы, выделенных от больных с опухолью склонны, генетическая пузырей расстройство (рецессивный дистрофическийбуллезный эпидермолиз), мы адаптировали существующий собственный протокол матрицу для изучения вторжение опухолевых клеток. Фибробласты индуцируются производить свои собственные матрицу в течение длительного периода в культуре. Это родной матрица затем отделяется от культуральной чашки и эпителиальные клетки высевают на него прежде всего сокультивирования повышают до границы раздела воздух-жидкость. Клеточной дифференцировки и / или вторжение затем могут быть оценены с течением времени. Этот метод дает возможность оценить эпителиальные-мезенхимальных взаимодействия клеток в 3D-настройки без необходимости синтетического или иностранной матрицы с единственным недостатком является длительный период времени, необходимый для получения родной матрицу. Здесь мы опишем применение этого метода для оценки способности одной молекулы, выраженное фибробластов, тип VII коллаген, ингибировать инвазию опухолевых клеток.

Introduction

Использование биоматериала в 3D культуре ткани позволило исследователям изучить поведение клеток в лаборатории в физиологических условиях больше похоже на окружающую среду в естественных условиях, чем у одного воспроизводятся с 2D адгезии и пластиковой подложке. В частности, большие успехи вперед были сделаны в моделировании стратифицированную эпителий с принятием 3D методами культивирования в воздух и жидкой фаз ^1-4. Такие методы добросовестно имитировать дифференцировку кератиноцитов и инвазии опухолевых клеток благоприятной большую гибкость и точность для исследователей, изучающих эти процессы. Выбор биоматериала подложки для имитации среды стромальных имеет первую очередь предполагает использование типа I коллаген, Engelbreth-Холм-рой мыши саркомы матрицы и де-epidermized дермы. Например, рак, связанный фибробласты, как было показано, чтобы внести вклад инвазию раковых ^5, инициации и прогрессии через стромальных-эпителиальных взаимодействий ^6,7 Wheн выросли в таких субстратов.

Золотым стандартом для имитируя стромы среды в кожу, крупнейшие и наиболее широко изученных слоистых эпителий, использующие такие методы, рассматривается быть де-epidermized человека дермы (DED). Подготовка DED включает в себя удаление эпидермиса через трипсином или физического диссоциации от человеческого трупа ^3,4 кожи. Однако доступ к такой кожи может быть очень трудно для лабораторий, не связанных с клиническими учреждениями, а больные дермы практически невозможно получить. В качестве альтернативы, лаборатории часто используют комбинацию типа коллагена (изолирован от крысиные хвосты) и / или Engelbreth-Холм-рой мыши саркома матрица.

После открытия в 1927 году Нажотта ^8, что коллаген может быть легко выделен с использованием уксусной кислоты и соли осадков, его применение к культуре ткани впоследствии пионером Huzelла и его коллеги ^9. Коллаген покрытие оказалось превосходит стекло для культивирования клеток из 29 штаммов и ткани эксплантов как опрошенных Ehrmann и Gey ^9. В настоящее время основным типом коллагена используется в тканевой культуре изолирован от крыс-хвост сухожилий, и, как правило, купил из коммерческих источников. Однако недостатком для верного подложки рекапитуляции является то, что крысиный хвост коллагена не совпадает с человеческого коллагена, или человека дермы, где тип я и III коллагены присутствуют в качестве основных составляющих, и изолированы крысиный хвост коллагена неизменно фрагментирован.

Engelbreth-Холм-рой мыши саркома матрица является желеобразные смесь белок выделяется культивируемых Engelbreth-Холм-Swarm мыши клеток саркомы ^10. Основными компонентами являются ламинином, тип IV коллагена, гепаринсульфат протеогликан, энтактин и нидоген и точные соотношения этих белков будут меняться от партии к партии. Помимо структурных Proбелки, эта матрица также содержит значительные уровни факторов роста, таких как трансформирующий фактор роста β, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста 1, бычий фактор роста фибробластов, и тромбоцитарный фактор роста, который будет изменять поведение сотовой ^11,12. Указывая к самой сложности Engelbreth-Холм-Swarm мыши саркомы матрицы, в общей сложности 1851 белков были идентифицированы в недавнем протеомного исследования ^13. В свете богатого и сложного характера этой матрицы, осторожность была предупреждена при интерпретации и сравнения различных экспериментов с использованием его ^11.

Наши лаборатории имеют большой интерес к генетическим кожных заболеваний, особенно тех, с предрасположенностью к развитию кожной плоскоклеточный рак (CSCC) ^14. В случае рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз (RDEB), тяжелой пузырей заболевания с зародышевой линии мутации в COL7A1 гена 15-17, мы определили, что кожный микросреда у этих больных является опухоль содействие ^18. В ходе этого исследования мы не смогли оценить опухоль способствуя свойства фибробластов кожи, встроенных в коллагена I / Engelbreth-Холм-Swarm мыши саркомы матрицу и исследованных способов оценки, родное матрицу клеток. Чтобы добиться этого, мы изменили предыдущую технику из лаборатории Люси Жермен работает на коже человека эквиваленты ^19,20. Техника Жермена смог восстановить человеческую кожу с хорошо организованной базальной мембраны с использованием первичных кератиноцитов человека и культуры фибробластов в отсутствие синтетического или трупной эшафот.

В этой статье операции, используемые резюмировать кожную опухоль стромы микросреду (родной матрицу) выводится непосредственно из первичных стромальных фибробластов в пробирке описаны ^18. Родные матрицы рroduced на долгосрочной культуре фибробластов были использованы в качестве дермального эквивалента до анализа на клеточной инвазии CSCC. Мы представляем данные, используя встроенную матрицу, полученную из любой внеклеточного матрикса, секретируемого RDEB фибробластов (дефицитных по типу VII коллагена (С7)) или из RDEB фибробластов, трансдуцированных ретровирусом типа VII коллагена, экспрессирующих построить и демонстрируют сильное воздействие единого коллагена на опухоли Вторжение сотовый.

Protocol

Данное исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией принципов и был одобрен соответствующими комитетов по этике.

1. Подготовка сред и реактивов

1. Подготовка 200x из L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат складе
   1. Растворите 29 мг L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата в 5 мл модифицированной среде Игла (DMEM) раствор Дульбекко и фильтруют через 0,22 мкм мембранный фильтр. Магазин, как 0,25 мл стерильной аликвоты в -20 ° C.
   2. Добавить 0,25 мл аликвоты 200x L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата к каждому складе 50 мл фибробластов среде (DMEM с 1% L-глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки) в день, необходимого для конечной концентрации 0,1 мМ L -аскорбиновой кислоты 2-фосфата.
2. Подготовка питательной среды кератиноцитов
   1. Выделение и культивирование первичных кератиноцитов SCC были описаны ранее ^21. Подготовка питательной среды кератиноцитов описываетсяв нем, как хорошо.
   2. Вкратце, подготовить средства массовой информации следующим образом:
      300 мл DMEM и 100 мл Хэма F-12 с добавлением 10% FBS
      0,4 мг / мл гидрокортизона
      5 мг / мл инсулина
      10 нг / мл EGF
      5 мг / мл трансферрина
      8,4 нг / мл холерного токсина
      13 нг / мл лиотиронин
      1x пенициллин-стрептомицин решение

2. In Vitro Строительство фибробластов Native Matrix в L-аскорбиновая кислота 2-фосфат дополнен СМИ

1. Семенной 200000 фибробласты на лунку в 6-луночных планшетах (20000 клеток / см ²⁾ в фибробластов среде с из L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата. Подпитку каждые 2-3 дня с 2-5 мл СМИ. (Примечание: возобновленного кормления частота и объем может быть скорректирована с учетом индивидуальных потребностей различных клеток См. "Разговоры".).
2. Толстый слой клеток, внедренных в внеклеточного матрикса сформируют в конце 6 недель, видимых невооруженным глазом ( Рисунок 1). Чтобы освободить этот слой из планшета для культуры ткани, мягко очистить окружность матрицы с микропипетки наконечник на 1 мл, а затем нажмите края матрицы к центру скважины. Этот слой клеток и матрица (родной матрица) должны быть легко отсоединяться от поверхности пластины, и теперь завис в средствах массовой информации. Распространение родной матрицу в средствах массовой информации, чтобы избежать его складывая на себя.
3. Пусть родной матрицы поплавок и реконструировать в течение 5 дней, сменить носитель каждые 2-3 дня. Благодаря прочности на разрыв и внутренней реконструкции в матрицы, матрица будет сжиматься и становится значительно сокращен до меньшего, но более толстый родной матрицы, и готова быть использованы для вторжения анализа.

3. Вторжение Проба с опухоли ГТК кератиноцитов

1. Возьмите родной матрицу осторожно тупыми щипцами и трансфер в нейлоновой сеткой. После того, как в сети нейлона, распространять матрицу мягко лежать как можно более плоскими, используя 1 мл микропипеткинаконечник и тупые щипцы.
2. Подготовка стерильные цилиндры клоновых по размытию небольшое количество стерильного вазелина на одном конце.
3. Поместите клоновых цилиндры на родном матрицы, со стороной Вазелин вниз. Это необходимо для обеспечения герметичности между родной матрицы и клоновых колец.
4. Добавить CSCC клетки к клональных цилиндров (250000 клеток в 100 мкл питательной среды кератиноцитов).
5. Удалите клоновых цилиндров после 6 часов, когда клетки CSCC расположились на родном матрицы.
6. Поднимите сеть нейлона с родной матрицы и CSCC клеток к воздуха и жидкой фаз на изогнутой опоры сетка из нержавеющей стали.
7. Добавьте СМИ роста кератиноцитов дополнены с аскорбиновой кислотой, пока уровень СМИ не касается дна родной матрицы.
8. Изменение СМИ каждые 2-3 дней и урожай в 7 и 14 дней после высева CSCC клеток.

4. Заготовка 3D культур и подготовка к гистологии

1. Fix в 4% номиналаaformaldehyde в течение ночи при комнатной температуре.
2. Пополам образцы и вставлять в воск для фиксированных формалином и залитых в парафин блоков, с поверхности среза наружу.
3. С другой стороны, вставлять пополам образцы в октябре и оснастки заморозить сразу в жидком азоте для свежих замороженных блоков ткани.
4. Вырезать 4 мкм разделы, посвященные микротоме и депарафинизации (при необходимости). Пятно с использованием стандартного гематоксилин-эозином. Для визуализации клеток CSCC, моноклональное антитело мыши против кератина 14 (LL001, в доме) может быть использован в окрашивании иммуногистология.

Results

Этот метод открывает возможность изучения и сравнения инвазии опухолевых клеток (в данном случае CSCC) под разными 3D стромальных средах. Используя эту технику, не только C7-дефицитных носители матрицы, которые воспроизводятся на окружающую среду RDEB кожной могут быть получены, но и дополнительные матрицы, которые были генетически модифицированных для сверхэкспрессии C7 ^18. Как видно на рисунке 2, вторжение в RDEB CSCC кератиноцитов было значительно отстают в С7-сверхэкспрессирующих родных м...

Discussion

Из-за природы этого эксперимента, общее время, необходимое для завершения может быть до двух месяцев. На протяжении всего этого времени, все меры предосторожности и стерильной ткани практики культуры должны быть использованы для предотвращения микробного загрязнения.

Помимо своей роли в качестве кофактора в синтезе гидроксипролина и гидроксилизина из коллагенов, аскорбиновая кислота стимулирует коллагена специфическую экспрессию мРНК в фибробластов ^22. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-аскорбиновая кислота 2-фосфат	Sigma	A8960
DMEM с L-глутамином, 4,500 мг/л D-глюкоза, 110 мг/л пируват натрия	Life Technologies	11995-073
100x Пенициллин-стрептомицин	Life Technologies	15070
вазелин	VWR	PROL28908.290
Клональные цилиндры	Sigma	Z370789
Фильтрующий диск из нейлоновой сетки Hydrophilic 100 μ м 25 μ м диаметр 100/шт	Многопоровая	NY1H02500
Изогнутая проволочная сетка из нержавеющей стали	Сделано в доме		Размеры были сделаны так, чтобы сетка помещалась в 6-луночные пластины