Методическая статья

Реконструкция 3-Dimensional гистологии Том и его применение для изучения Mouse молочных желез

14.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51325

⸱

26 июля 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Platform Biological Sciences, Sunnybrook Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Physical Sciences, Sunnybrook Research Institute, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 6Manitoba Institute of Cell Biology, University of Manitoba

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем подход к регистрации изображений для трехмерной (3D) объемной реконструкции гистологии, который облегчает изучение изменений органа на уровне макроструктур, состоящих из клеток. Используя этот подход, мы изучили 3D-изменения между молочными железами дикого типа и Igfbp7-null.

Аннотация

Реконструкция объем Гистология облегчает изучение 3D формы и изменения объема органа на уровне макроструктуры, состоящие из клеток. Она также может быть использован для исследования и проверки новых методов и алгоритмов в объемной области медицинской визуализации и терапии. Создание 3D атласы высокого разрешения различных органов 1,2,3 другое применение реконструкции объема гистология. Это обеспечивает ресурс для исследования тканевых структур и пространственную взаимосвязь между различных клеточных функций. Мы представляем регистрационный подход изображения для реконструкции объема гистология, который использует набор изображений оптических blockface. Реконструированный объем гистология представляет собой надежную форму обработанных образца с не Размножается постобработки ошибки регистрации. В гематоксилином и эозином (H & E) окрашенные срезы двух молочных желез мыши были зарегистрированы в соответствующие blockface изображений с использованием граничные точки, извлеченные из редГЭС образца в гистологии и blockface изображений. Точность регистрации визуально оценивали. Выравнивание макроструктурах молочных желез также визуально оценивают с высоким разрешением.

Это исследование определяет различные шаги этого трубопровода регистрации изображения, начиная от удаления молочной железы через к 3D-реконструкции объема гистологии. В то время как гистологии изображения 2D показывают структурные различия между парами секций, 3D объем гистологии обеспечивает возможность визуализации различий в форме и объема молочных желез.

Введение

IGFBP7 (инсулиноподобный фактор роста-связывающего белка 7) является членом семейства белков IGF-связывающих, и было показано, чтобы связать IGF1 рецептор 4. Понижающей регуляции IGFBP7, как известно, коррелирует с плохим прогнозом при раке молочной железы 5, в то время как повторное введение IGFBP7 в модели ксенотрансплантата опухоли значительно ингибирует рост опухоли 6 через индукцию апоптоза и клеточного старения 7. С целью изучения влияния IGFPB7, Igfbp7-нулевые мыши была создана 5 (неопубликованные данные). В то время как эти мыши не развиваются опухоли, они показывают изменения в гистологии яичников, мышцах и печени, а также дефекты в молочной железы паттерна развития (неопубликованные данные). Дефектный фенотип было впервые указано как нулевые мыши имеют меньшие размеры для мусора и не в состоянии выдержать несколько больших пометов (неопубликованные данные).

3D объемы гистологии есть потенциал, чтобы обеспечить полезную информаион для количественных и сравнительного анализа и оценки патологических результатов в объемных медицинских изображений. Трехмерная конфокальный, двухфотонного микроскопия может обеспечить высокое разрешение клеток морфологическую информацию железы на местном мере 14, но имеет ограниченное поле зрения и глубины. Реконструкция объем Гистология предоставляет больше информации по гораздо большей пространственной протяженности. Использование традиционных подходов некоторое искажение ожидается в ходе подготовки гистологических срезов, например, усадки, расширения, слезы и складок. Эти искажения затрудняют зарегистрируйтесь серийные гистологические изображения в 3D стека реконструировать 3D объема. В число последовательных секций с дефектами увеличивает сходство между интактных секций уменьшается и, следовательно, делает процесс регистрации сложнее.

Различные методы были предложены для регистрации гистологические срезы и создать непрерывную гистологии VOЛуме. Некоторые методы зависят от вариаций интенсивности 8, и другие основаны на форме секций 9. Для некоторых образцов анатомические структуры могут быть использованы в качестве ориентиров 10,11 вместе с вехой на основе методов регистрации 12,13. Но эти внутренние структуры не могут быть обнаружены по всему объему, а для некоторых образцов нет достоверных анатомические структуры не могут быть идентифицированы. Некоторые группы использовали парного регистрационный подход и зарегистрирован последовательных изображений гистологии друг другу с помощью контуров или анатомические структуры 16-18. Регистрация серийных срезов гистологии друг с другом без использования эталонных изображений может распространяться регистрации ошибок и изменения фактического формы объема, гистологии. Попарное регистрация подход основан на согласованности формой гистологии секций и внутренних структур во всем стопку изображений; Поэтому она требует плотной выборки образца, которыймогут не всегда возможно, например, для клинических образцов.

В этом трубопроводе мы используем blockface изображения в виде набора эталонных изображений для реконструкции объема гистологии 19. Blockface изображения взяты из парафина блоков ткани после его установки на микротоме и перед каждой секции сократить. Таким образом, повреждение индивидуального серийных срезов разреза не мешает регистрации серийных срезов 8,11,15. Мы захватить blockface изображения по-другому от других групп. Изображения лиц оптический блок получаются телецентрическим линзы чтобы исключить или уменьшить искажения ствол и перспективный, который обычно происходит, когда с помощью регулярных линз в оптике. Это одно из преимуществ предложенного подхода над другими опубликованными способами, которые выполняют визуализацию с использованием регулярных blockface линзы. Изображения взяты под небольшим острым углом использовать отражение от поверхности блока для усиления контраста между TISSUE и парафин поверхность и устранить тени ткани в глубине под поверхностью парафина. Фотографический фильтр также используется для поляризации света, исходящего от поверхности блока и ткани, чтобы сбалансировать контрастность 19. Для коррекции смещения блока на поворотном микротоме, 2:58 сверлят отверстия в углах блока, которые легко обнаружить в blockface изображений. В центроиды эти отверстия используются наряду с ориентир на основе жесткой регистрации для выравнивания blockface изображения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Образцы

  1. Акцизный молочных желез хирургическим путем из дикого типа CDH1 а также Igfbp7-нулевых мышей три дня после начала лактации.
  2. Разведите желез на стеклах, чтобы помочь восстановить родной молочной морфологии железы.

2. Фиксация и обработка ткани

  1. Fix молочных желез в нейтральный буферный 4% PFA O / N на 4 ° С.
  2. Храните желез в 70% этаноле до обработки тканей.
  3. Перенесите желез малых кассет обработки ткани.
  4. Процесс тканей с использованием автоматического процессор тканей
    1. Обезвоживают ткани в увеличении этанола и ксилола ванны 70% этанола в течение 45 мин, 2 раза в 95% этаноле в течение 45 мин, 3 раза в 100% этаноле в течение 1 ч и 2 раза в ксилоле в течение 45 мин.
    2. Пронизывают ткани с парафиновых 3 раза в течение 1 часа каждый в вакууме с приложенного давления.
  5. Вставить тканей в парафин в блоки, Для секционирования.

3. Гистологии и Blockface изображений

  1. Обрежьте парафиновые блоки с использованием роторного микротом пока избыток парафин удаляется.
  2. Используйте Вертикально-фрезерный станок для бурения отверстий 1 мм как минимум в двух углах парафинового блока перпендикулярно к кассете.
  3. Установите тканей блок на вращающейся микротоме.
  4. Настройте систему визуализации blockface 19 перед микротоме.
  5. Захват оптической blockface изображение до секционирования.
  6. Отрежьте ленты четырех разделов на 5 толщиной мкм на микротоме.
    1. Передача ленты в ванну с холодной водой.
    2. Отделите второй и четвертый разделы лентой и смонтировать их на предметные стекла. Выбор второй и четвертый разделы обеспечивает разрыв 5 мкм между секциями.
    3. Развернуть каждый раздел в теплой водяной бане (48 ° С), чтобы unwrinkle его, а затем вновь монтировать его на предметное стекло.
      ПРИМЕЧАНИЕ: СUtting, монтаж, unwrinkling разделы вызвать некоторые искажения на секции, такие как слеза, сгиб, усадка, и расширения. Эти артефакты усложнить регистрацию секциях гистологии.
    4. Пятно секции с H & E с использованием автоматического ситечко.
    5. Покровные слайды с использованием автоматического Coverslipper.
    6. Оцифровка слайдов с использованием цифрового гистологии слайд сканер с разрешением интерес. Для этого протокола увеличение в 20 раз, а разрешение составляет 0,47 мкм.
    7. Вниз-образец гистологии изображения в разрешении blockface изображений, 18 мкм.

4. Изображение Регистрация

  1. Сегментация изображения и выбор точек
    1. В blockface изображения измерить значения пикселов отверстия регистрации и использовать среднее значение в виде фиксированной порога до сегменте отверстия регистрации в углах парафинового блока.
    2. Поскольку некоторые дополнительные детали, возможно, также быть сегментирован пос использованием фиксированного порога, используйте округлость и площадь сегментированных объектов, чтобы найти дыры и отбросить лишние объекты. Для этого нужно написать небольшой код и найти отношение (4π х области) / (периметра) 2 для сегментированных объектов. Это соотношение для круглых объектов 1.
    3. Для каждого молочной железы, выберите один blockface изображение как ссылки и выровнять остальные blockface изображений на ссылки с помощью центра отверстия регистрация и методов регистрации знаковых основе.
    4. Для выровненных blockface изображений, вручную сегмент или извлечь ткань от фона. Использовать наиболее значительную объекта в маске для остальной части протокола.
    5. Для H & E разделы выполните следующие действия для автоматической сегментации.
      1. Используйте Оцу пороговой технику 20 сегментировать изображений с фоном и создавать бинарные маски гистологии изображений.
      2. Выявление и выбрать наиболее значительный объект в каждой маски с использованием чistogram меченых объектов.
      3. Извлеките шириной в один пиксель граничные точки как от гистологии и blockface масок.
      4. Используйте алгоритм Сеть код 21, для представления граничные точки последовательностью кусочно-линейных подходит.
  2. Начальная Жесткая Регистрация
    1. Используйте Фурье дескрипторов алгоритм 22, чтобы найти первоначальный жесткий преобразовать между граничных точек гистологии и соответствующих им blockface изображений. Этот первоначальный преобразования включает в себя факторы перемещения, поворота и масштабирования.
    2. Transform каждый гистологии изображение с начальным преобразования, получаемого из предыдущего шага.
  3. Уточнение жесткой Регистрация
    1. Удалить высокие разделы края кривизны от гистологии контура с помощью катящийся шар фильтр 23.
    2. Выберите 500 очков из оставшихся гистологии граничных точек случайным образом с помощью равномерного распределения.
    3. Преобразованиегистологии случайные граничные точки с начальной трансформации, полученной из дескрипторов Фурье.
    4. Выберите весь набор blockface граничных точек и использовать Итерационные ближайших точек (ПМС) алгоритм 24, чтобы найти жесткий преобразование между blockface граничных точек, пункта назначения, а гистологии случайных граничных точек.
    5. Transform выровненных изображений гистологии, полученные из предыдущего шага и стопка выровненных гистологии изображений создает объем гистологии.
    6. Используйте программное обеспечение 3D визуализации для создания визуального образа объема гистологии.
  4. Просмотр Стек изображений на 5-кратным увеличением
    1. Вниз-пробовать оригинальные гистологии изображения в 5x увеличение.
    2. Обрезать область интереса в одном из гистологии изображений.
    3. Рассчитать расположение этого региона в других гистологии изображений 5x с использованием комбинацию из жестких преобразований из двух шагах от регистрации.
    4. Обрезать RegiДополнения, представляющие интерес для той же области размера во всех других гистологии изображений.
    5. Наконец уточнить выравнивание между регионами вручную. Напишите программу, которая перекрывает два изображения и позволяет для выбора значения для вращения и перемещения одного из изображений над другой, а затем сохраняет его в преобразованном виде, когда выравнивание принимается.
    6. Просмотр стеки выровненных 5x регионах гистологии с использованием 3D программного обеспечения визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ловушка традиционных методов микроскопии является то, что понимание органа на микроскопическом уровне ограничивается одной области-обзора в то время. Даже "всего по раскрытию информации" горки, которые обеспечивают целые разделы слайд, не в состоянии обеспечить трехмерную информацию. С развитием всей горкой, динамических технологий сканирования, наша способность увидеть раздел в полном объеме возросла, однако экстраполяции структуры требуется 3D-реконструкция громкости гистология.

...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании, мы разработали регистрационный рабочий процесс изображения на реконструкцию объем 3D гистологии от серийных 2D-изображений гистологии, которая не требует внутренних случайно выбранных ориентиров или имплантированные координатных меток внутри ткани, которые могли бы исказить ткань. По способу, описанному, blockface оптические сами изображения используются в качестве опорных изображений предшествующих секционирования. Мы используем внешние отверстия, просверленные в парафиновый блок, чтобы помочь в вы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Исследовательскую лабораторию визуализации биомаркеров (BIRL) в Научно-исследовательском институте Саннибрук за их услуги в области гистологии. Поддержка этой работы была предоставлена Фондом Терри Фокса, Канадским фондом по борьбе с раком молочной железы (The Prairie-NWT), а также грантом CIHR #MOP-97996.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% PFAVWR International1571016% раствор параформальдегида
Малые кассеты для обработки тканейVWR InternationalCA95029-956
Leica ASP300 автоматизированный тканевый процессорLeica14047643515
100% этанолFisher ScientificS25307B
XyleneVWR International CA95057-822
Парафин Thermo Fisher39501006Paraplast среда для встраивания тканей
Leica EG 1160 центр встраиванияLeica
Leica ротационный микротомLeica
Фрезерный станокArgo
Микроскоп слайдыVWR International CA48312-015
H& E морилкаVWR International
Автоматическая морилка
Coverslips VWR International 48404-452
MEDITE RCM 7000 стеклянная покровная тапочкаMEDITE
Leica SCN400 сканер слайдовLeica
MATLABMathWorks IncMATLAB 2007bПрограммное обеспечение для разработки
MeVisLabMeVis Medical Solutions AGMeVisLab 2.1программное обеспечение для 3D-визуализации

Ссылки

  1. Sunkin, S. M., et al. Brain Atlas: An integrated spatiotemporal port for exploring the central nervous system. Nucleic Acids Research. 41, 996-1008 (2012).
  2. Shen, E. H., Overly, C. C., Jones, A. R. The Allen Human Brain Atlas: Comprehensive gene expression mapping of the human brain. Trends in Neurosciences. 35 (12), 711-714 (2012).
  3. Trifunović, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (6), 2330-2336 (2008).
  4. Evdokimova, V., et al. IGFBP7 binds to the IGF-1 receptor and blocks its activation by insulin-like growth factors. Science Signaling. 5 (255), 92(2012).
  5. Burger, A., Leyland-Jones, B., Banerjee, K., Spyropoulos, D., Seth, A. Essential roles for IGFBP-3 and IGFBP-rP1 in breast cancer. European J. Cancer. 41 (11), 1515-1527 (2005).
  6. Amemiya, Y., et al. Insulin like growth factor binding protein-7 reduces growth of human breast cancer cells and xenografted tumors. Breast Cancer Res Treat. 126 (2), 373-384 (2011).
  7. Benatar, T., et al. IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathways. Breast Cancer Res Treat. 133 (2), 563-573 (2012).
  8. Bardinet, E., et al. Co-registration of histological, optical and MR data of the human brain. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention-Part I. , Springer-Verlag. London, UK. 548-555 (2002).
  9. Jacobs, M. A., Windham, J. P., Soltanian-Zadeh, H., Peck, D. J., Knight, R. A. Registration and warping of magnetic resonance images to histological sections. Medical Physics. 26 (8), 1568-1578 (1999).
  10. Zhan, Y., Ou, Y., Feldman, M., Tomaszeweski, J., Davatzikos, C., Shen, D. Registering histologic and MR images of prostate for image-based cancer detection. Academic radiology. 14 (11), 1367-1381 (2007).
  11. Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in vivo MRI for whole baboon brain. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
  12. Lazebnik, R. S., Lancaster, T. L., Breen, M. S., Lewin, J. S., Wilson, D. L. Volume registration using needle paths and point landmarks for evaluation of interventional MRI treatments. IEEE Transactions on Medical Imaging. 22 (5), 653-660 (2003).
  13. Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Annals of Biomedical Engineering. 33 (8), 1100-1112 (2005).
  14. Mori, H., Borowsky, A. D., Bhat, R., Ghajar, C. M., Seiki, M., Bissell, M. J. The American Journal of Pathology. 180 (6), 2249-2256 (2012).
  15. Gibb, M., et al. Resolving the three-dimensional histology of the heart. Computational Methods in Systems Biology. Gilbert, D., Heiner, M. , 2-16 Springer-Verlag. London, UK. 2-16 (2012).
  16. Wu, M. L., et al. Three-dimensional virtual microscopy of colorectal biopsies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 129 (4), 507-510 (2005).
  17. Arganda-Carreras, I., et al. 3D Reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microscopy Research and Technique. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  18. Song, Y., Treanor, D., Bulpitt, A. J., Magee, D. R. 3D reconstruction of multiple stained histology images. Journal of Pathology Informatics. 4 (2), 7(2013).
  19. Shojaii, R., Karavardanyan, T., Yaffe, M., Martel, A. L. Validation of histology image registration. SPIE Medical Imaging. 7962, 79621E, doi:10.1117/12.878762. 7962 (7962E), (2011).
  20. Ridler, T. W., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
  21. Freeman, H. Computer processing of line-drawing images. ACM Computing Surveys (CSUR. 6 (1), 57-97 (1974).
  22. Giardina, C. Accuracy of curve approximation by harmonically related vectors with elliptical loci). Computer Graphics and Image Processing. 6 (3), 277-285 (1977).
  23. Shojaii, R., Martel, A. L. A novel edge point selection method for registration of histology images. Optical Tissue Image analysis in Microscopy, Histopathology and Endoscopy. (OPTIMHisE) Workshop, MICCAI. , (2009).
  24. Besl, P., McKay, N. A method for registration of 3-D shapes. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 14 (2), 239-256 (1992).
  25. Chatterjee, S., et al. Loss of Igfbp7 causes precocious involution in lactating mouse mammary gland. PLoS ONE. 9 (2), e87858(2013).
  26. Manjunath, B. S., Chellappa, R. Unsupervised texture segmentation using Markov random field models. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 13 (5), 478-482 (1991).
  27. Krishnamachari, S., Chellappa, R. Multiresolution Gauss-Markov random field models for texture segmentation. IEEE Transactions on Image Processing: a publication of the IEEE Signal Processing Society. 6 (2), 251-267 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи