Анализ окислительного стресса у эмбрионов данио рерио

Окислительный стресс специально определяется как состояние, что результаты от неуравновешенное состояние сотовой окислительно-восстановительной. Сложные окислительно-восстановительные реакции, которые обычно происходят в клетках определения клеточной редокс-состояние. Окислительно-восстановительные реакции состоит из всех химических реакций, которые состоят в передаче электронов между атомами биологических молекул, производящих восстановление и окисление молекул (то есть окислительно-восстановительных реакций). Эти реакции катализируется электронном активированных видов (т.е. про-окислительные видов), которые характеризуются крайней структурной неустойчивости и спонтанной активации неуравновешенных электронов, которые обмениваются с соседними биомолекул. Эти неправильные реакции приводят в повреждении ДНК, белка карбоксилирования, и окисление липидов, и в конечном итоге привести к гибели клеток ^1. Повышенные уровни оксидативного стресса были связаны со старением и прогрессировании различных патологических состояний ^2. Окислительный стресс имеетСообщалось, что ответственность за сосудистых изменений в диабет и сердечно-сосудистых заболеваний ^3,4. Он также играет важную роль в дегенерации нейронов при болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона ^5. Кроме того, окислительный стресс была продемонстрирована в качестве важнейшего фактора в управлении прогрессирование рака и метастатических события ^6,7. Кроме того, воспаление и иммунный ответ может вызвать и дальнейшее сопровождение окислительный стресс ^8.

В живых клетках, про-окислительные видов являются производными от кислорода (ROS; активных форм кислорода) или азота (RNS; видов активного азота). ROS включают гидроксильный радикал, в супероксид-анион ^(OH). (O ₂ ^-) и перекись водорода (H ₂ O _2). Первичный RNS является закись азота ^(NO.). Ряд вторичных активных форм могут быть получены путем взаимодействия спонтанных betweeн АФК и RNS или свободных металлов ионов ^9. Например, супероксид-анион реагирует с закисью азота с образованием пероксинитрат (ONOO ^-), в то время как H ₂ O ₂ в реакцию с Fe ^{2 +} генерирует гидроксильные радикалы. АФК и RNS, из-за их способности реагировать с несколько биомолекул, считаются опасной угрозой для поддержания физиологического состояния окислительно-восстановительного ^10. Чтобы поддерживать окислительно-восстановительное состояние клетки снабжены серией детоксикации молекул антиоксидантными и ферменты. Супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы и Пероксиредоксины существу составляют антиоксидантным ферментативную-арсенал, который обеспечивает сотовой защиты от про-окислительных видов в том числе H ₂ O _2, ОН и Oono ^{-. 11.} Также молекулы антиоксиданта, как витамин С и Е, полифенолы и CoenzymeQ10 (коэнзима Q10) имеют решающее значение для утоления ROS и их опасного деrivatives ^12,13. Однако избыточное производство АФК и RNS, или дисфункции в системе Антиоксидант, сдвигает клеточный редокс-состояние к окислительному стрессу ^14.

Кроме того, их негативный оттенок, ROS могут играть различные физиологические роли в клетках различного происхождения. Клетки обычно производят ROS как сигнальные молекулы в качестве посредника нормальные биологические события, такие как хост-защиту и заживления ран ^15-17. Активные формы обычно получают в клетках путем внутриклеточных ферментов, таких как NOx (НАДФН-оксидазы) и XO (ксантина оксидазы) в ответ на сигнальных факторов, факторов роста и внутриклеточных колебаний уровней кальция ^18,19. Было сообщено, что ROS может дифференциально модулировать активность важных ядерных факторов, таких как p53 или клеточных компонентов, таких как ATM-киназы, мастер регулятора ответ на повреждение ДНК ^20. Аналогично АФК сильно влияют сотовой сигнализации на посредничество тыс.э окисления и инактивация белка тирозина фосфатазы (PTPs), которые устанавливаются в качестве важнейших регуляторов передачи сигнала ^21. Кроме того, протеомные основе методологии продемонстрировать, что RNS также несут ответственность за конкретные изменения белковых и изменений молекулярной сигнализации. RNS реагировать с цистеином тиоловых групп модифицирующих их в S-nitrothiols (SNO) и молекулярных путей, вызывающих одновременно с патологических состояний, таких как воспалительных и аутоиммунных заболеваний ^22,23.

Поскольку культура клеток эксперименты лишь частично воспроизвести множество факторов, действующих в естественных условиях, это представляет большой интерес для выполнения окислительно-восстановительные исследования на животных моделях ^24,25. Чтобы достичь этого, данио рерио был рассмотрен подходит позвоночных животной модели для исследования динамики окислительные стресс ^26. Данио это новая модель системы, которая предоставляет ряд преимуществ для изучения клеточных и генетических событий во позвоночных разработчикаelopment и болезни. Большие кластеры эмбрионов могут быть получены и доступны в неделю в течение эксперимента потребностей. Кроме того, внеочередное оптическая прозрачность из эмбрионов данио рерио, а также их небольшой размер, позволяет один визуализации клеток и динамический трекинг в целом организмов ^27. В последнее десятилетие, значительное число рыбок данио мутантов были получены для моделирования человеческих патологических состояний, таких как рак и генетические заболевания ^28-31. Самое главное, множество трансгенных линий был произведен, чтобы позволить широкие возможности генетических и биологических манипуляций ^32. Например, трансгенные тканеспецифические данио линии регулярно используются для естественных условиях исследования в. Эти строки выражают флуоресцентный белок под контролем выбранного промоутер, предлагая возможность идентифицировать отдельные клетки в естественных условиях, а также анатомическое строение они составляют.

Несколько токсикологические исследования уже используются тон данио рерио, чтобы оценить эффект в естественных условиях на окислительно-восстановительного гомеостаза химических веществ, что свидетельствует о пригодности этой позвоночных как животной модели для области лекарственных препаратов и окислительного стресса ^33-35. Хотя некоторые флуоресцентные зонды были протестированы для мониторинга окислительного стресса у рыбок данио личинки ^36,37, нет никаких установленных анализы для обнаружения и измерения уровня оксидативного стресса у рыбок данио тканей и живые клетки. Здесь мы опишем процедуру количественного в естественных условиях окислительного стресса в живых клетках эмбрионов данио рерио. Обработки изображений инструменты, СУИМ сортировка, флуоресцентные зонды и про-окислительные условия все объединены для создания простого анализа для обнаружения и количественного определения окислительных видов у эмбрионов рыбок данио и тканей.

1. Подготовка инструментов и рабочих растворов

1. Приготовьте раствор рыба воды. Сделать исходного раствора путем растворения 2 г морской соли "Instant Ocean" в 50 мл дистиллированной воды. Добавить 1,5 мл фондовом рыбы водой до 1 л дистиллированной воды для приготовления готовых к использованию рыбы воду (60 мкг / мл морские соли конечная концентрация). Автоклав готов к использованию рыбы воду перед использованием. Это решение используется в качестве данио эмбриона среды.
2. Подготовка метилцеллюлозы для эмбриона монтажа. Растворить 1,5 г метилцеллюлозы в 50 мл стерильной воды рыбы. Облегчения растворения с помощью магнита на магнитной мешалки. Полное растворение порошка может потребоваться несколько часов. Проверьте решение для ясности и Алиготе в трубочки. Хранить при -20 ° С в течение месяцев и оттаять аликвоты при использовании. Центрифуга метилцеллюлозы при 950 мкг в течение 5 мин перед использованием. Избегайте циклов замерзания-оттаивания из аликвоты.
3. Подготовка 50 мл Tricaine / этил 3-аминобензойной кислоты мэтансульфонат соль (исходный раствор) путем растворения 200 мг Tricaine в 100 мл воды и довести рН до 7,0 с помощью трис-HCl 1 М (рН 9). Храните этот запас при 4 ° С в течение не более 30 дней. ВНИМАНИЕ: Tricaine является токсичным. Используйте в соответствии с надлежащих принципов обработки.
4. Склонение окислительный стресс у эмбрионов данио рерио
   1. Подготовить окислителя решение для общего индукции окислительного стресса: Сделайте 50 мл раствора оксидантов, добавив Н ₂ О ₂ исходный раствор (перекись водорода; 100 мм) до рыбы воды. Используйте H ₂ O ₂ из конечной концентрации от 2 мм до 100 мкм. Подготовьте это решение незадолго до использования. Решение окислителя могут быть применены как к целой горе РОС-обнаружения и одноклеточных методов РОС-обнаружения. Не храните это решение. ВНИМАНИЕ: H ₂ O ₂ опасно, и вреден при вдыхании и проглатывании. Контакт с горючим материалом может вызвать пожар. Ручка под вытяжкой и носить соответствующую челнальных защиты.
   2. Подготовить окислителя решение для индукции окислительного стресса митохондрий, полученных: Сделайте окислителя маточного раствора (5 мм) путем растворения 3,9 мг ротенона в 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Держите это решение при комнатной температуре в темноте.
      1. Растворите Ротенон исходного раствора в 10 мл рыбного воды, чтобы сделать готовый к использованию решение. Использование ротенон в концентрации от 5-50 мкМ. Не используйте ротенон в концентрациях, превышающих 100 мкм. В соответствующих концентрациях, это решение окислителя могут быть применены как к целой горе РОС-обнаружения и одноклеточных методов РОС-обнаружения. ВНИМАНИЕ: Ротенон является токсичным и опасным. Ручка в соответствии соответствующие меры предосторожности.
   3. Вызвать окислительный стресс геном нокдауна: бросовым экспрессию генов nrf2a у эмбрионов данио рерио по морфолиногруппой микроинъекции как ранее сообщал Timme-Laragy А. и др., 2012 ^38..
   4. Вызвать OxidAtive стресс после повреждения тканей: генерировать маржу раны в хвостовой плавник эмбрионов данио рерио в 72 часов после оплодотворения, как описано ранее Niethammer др., 2009 ^39..
5. Подготовьте 5 мл раствора РОС-обнаружения для одного клеток методом РОС-обнаружения:
   1. Решение для общего обнаружения ROS: Растворите общий РОС-чувствительную молекулярную зонд в HBSS (Хэнкса сбалансированный солевой раствор) в целях подготовки рабочего раствора (диапазон концентрации: 2,5-10 мкм). Это решение должно быть подготовлено незадолго перед использованием.
   2. Раствор для конкретных обнаружения АФК индуцированной митохондрий: Незадолго до использования, растворить митохондриальную РОС-чувствительный зонд с ДМСО делая 5 мМ маточного раствора. Растворите исходного раствора в HBSS, чтобы подготовить рабочий раствор (диапазон концентрации: 2,5-10 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прямого воздействия света и кислорода воздействия РОС-обнаружения рабочих растворов и их соответствующие растворы. Защитите трубу от света с помощьюалюминиевая фольга. Не храните и не повторное использование зондов, растворенные в HBSS. Храните растворы при -20 ° С в течение месяца.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь молекулярные зонды и ДМСО под вытяжкой в ​​соответствии с надлежащих принципов.
6. Подготовьте 5 мл раствора РОС-обнаружения для метода крепления РОС-обнаружения всей: Растворите общий РОС-чувствительный датчик исходного раствора (стабилизированная в ДМСО) в HBSS, чтобы подготовить рабочий раствор (диапазон концентрация: 2,5-5 мкм). Избегайте свет и воздействия кислорода. Защитите трубу от света. Подготовка этого решения перед использованием. Не храните и не используйте повторно это решение. ВНИМАНИЕ: Обращайтесь молекулярных зондов под вытяжкой в ​​соответствии с надлежащих принципов.
7. Сделать 25 мл стоп-раствора добавлением 10 мл фетальной бычьей сыворотки в 15 мл PBS 1X. Держите решение стерильными. Храните это решение при 4 ° С. Это решение требуется только для одной ячейки - метод обнаружения РОС.
8. Установите данио воздуха инкубатор на 28 &# 176; С.
9. Установка центрифуги при 4 ° С для метода ROS обнаружения одной ячейки.

2. Спаривание взрослых рыб и отбор эмбрионов рыбок данио

1. Настройка взрослых данио пара пересекает соответствии со стандартными протоколами ^40. Выберите соответствующий трансгенной линии в соответствии с конкретными экспериментальными потребностей.
2. Собирайте яйца и поместить их в 90-мм блюдо с рыбой воды / эмбриона среды. Хранить яйца при 28 ° С до тех пор эмбрионы не будет развиваться и расти до желаемой стадии развития (например, 48 часов после оплодотворения, 72 часов после оплодотворения; HPF: часов после оплодотворения).
3. Экран для развивающихся эмбрионах. Исключить все неоплодотворенные яйца или слаборазвитые эмбрионов.
4. Обезболить эмбрионов путем добавления 1 мл Tricaine (исходный раствор) в 50 мл рыбного воды.
5. Выберите эмбрионов люминесцентные ТГ под стереомикроскопом.

3. Лечение эмбрионов с окислителем Агента

1. Используйте как минимум 30 эмбрионов между 48 чпф и 72 часов после оплодотворения в различных условиях. Вымойте эмбрионов дважды свежей рыбы воды, чтобы удалить Tricaine.
2. Сплит люминесцентные эмбрионов в трех блюд. Положите не более 30 эмбрионов / блюдо.
3. Извлеките промывочного раствора и добавляют 10 мл раствора окислителя или 10 мл воды рыбы, как контрольного раствора.
4. Выдержите эмбрионов в течение 10 мин до 1 часа при 28 ° С Инкубационный период зависит от уровня окислительного стресса, индуцированного быть в определенных тканей. Короткие периоды являются лучшими как клетки, затронутые окислительного стресса постепенно пройти гибель клеток.
5. Передача эмбрионы в новую чашку, содержащую HBSS и эмбрионов мыть, вращая. Предварительно теплой HBSS при 28 ° С

4. Всего Гора РОС Метод обнаружения

1. Сбор эмбрионов после лечения окислителя и поставить не более 10 эмбрионов в трубочку. Промыть ССРХ как можно больше. Защитите трубу от света с помощью алюминиевой фольги.
2. Добавьте 1 мл раствора РОС-обнаружения длякаждая трубка.
3. Инкубируйте эмбрионов в темноте в течение 15 мин при 28 ° С для предотвращения попадания света.
4. Во время инкубации подготовить на стеклянное скольжение для всей анализа эмбриона. Положите 300 мкл метилцеллюлозы на "депрессия" стекло и распространять его на поверхности стекла с кончика пипетки. Избегайте пузырей при освобождении метилцеллюлозы.
5. В конце инкубационного периода, немедленно извлеките решение РОС-обнаружения и мыть дважды 2 мл HBSS. Вымойте эмбрионов путем обращения трубки несколько раз. Не пипетки или вихрь.
6. Эмбрионы Аспирируйте до в стеклянную пипетки Пастера. Эмбрионы положении рядом открытии пипетки и осторожно извлечь их в метилцеллюлозы. Ориентируйтесь эмбрионов соответственно с тонкой линии нейлона.
7. Сравните флуоресценцию контрольных эмбрионов с обработанных эмбрионов. С другой стороны, закрепить параметры флуоресценции стереомикроскопа или конфокальной микроскопии, так что все эмбрионы отображаемого использованием того жеНастройки визуализации.

Single Cell Метод РОС-5 обнаружения.

1. Начните с шага: 3.5. Убедитесь в том, чтобы иметь по крайней мере 35 эмбрионов для каждого условия.
2. Трансфер эмбрионов в новое блюдо. Удалить воде рыба как можно больше. Добавьте 10 мл ледяной PBS 1X и 400 мкл ингибиторов протеазы коктейль. Вручную dechorionate эмбрионов щипцами и удалить желток мешок с тонкой иглой. Примечание: Удаление желтка мешок обеспечивает чистые образцы для последующего анализа FACS. Этот шаг может быть предотвращено в соответствии с FACS инструмента.
3. Передача де-yolked эмбрионов в 24-а многоямного пластины (15 эмбрионов / лунку) и удалить все рыбы воды.
4. Добавить 300 мкл HBSS, 30 мкл коллагеназы P 50 мкл трипсина-ЭДТА в каждую лунку.
5. Гомогенизируют эмбрионов, осторожно пипеткой вверх и вниз с плотно кончика пипетки (1000 мкл).
6. Инкубируют при 28 ° С в течение 20 мин и гомогенизируют с помощью пипетки образцы каждые 5 мин.
7. Проверьте ткани DISRuption наблюдая аликвоты гомогената в микроскоп соединения. Содействие суспензии отдельных клеток с помощью пипетки. Не инкубировать эмбрионов в течение более 30 мин.
8. Остановите реакцию добавлением 200 мкл стоп-раствора. Смешайте с помощью пипетки осторожно.
9. Передача клеточной суспензии в предварительно охлажденной трубки с жесткой нижней части. Держите трубку на льду и предотвращения попадания света.
10. Центрифуга в течение 5 мин при 250 х г при 4 ° С.
11. Снимите верхнюю фазу и вновь приостановить клеток с ледяной ССРХ, осторожно пипеткой.
12. Граф клеток и убедитесь, что у вас есть такое же количество клеток во всех ваших образцов. Не используйте менее 2 х 10 ⁶ клеток.
13. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 250 х г при 4 ° C.
14. Удалить супернатант и приостановить гранул с 1 мл ледяной охлажденной ССРХ содержащих РОС-чувствительный датчик.
15. Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение 3 мин в темноте. Vary время инкубации в соответствии с уровнем окислительного стресса и тон чувствительность датчика.
16. Трансфер клетки к FACS трубы. Держите пробирки на лед и предотвращения попадания света перед анализом FACS.
17. Сортировки клеток с флуоресцентно-активированном клеточном сортере (FACS). Набор длины волн в соответствии с Tg ткани флуоресценции (например, GFP) и спектров возбуждения / эмиссии молекулярного зонда, используемого для обнаружения ROS (например, конкретных митохондриальных АФК-чувствительных датчиков, родовых РОС-чувствительных датчиков).
18. Для каждого условия, измерить все образцы в течение той же экспериментальной сессии, применяя те же настройки FACS. Рассчитать процент флуоресцентных клеток как среднего различных биологических повторяет. Анализ по меньшей мере два повторов для каждого состояния.

Применяя метод здесь описанное, мы можем легко измерить и обнаружить окислительный стресс (и уровни ROS) в данио эмбриональных тканей. После пересечения взрослых данио, яйца собирают и позволили разработать при 28 ° С до 72 ч после оплодотворения (HPF). Для того, чтобы вызвать оксидативный стресс, мы предлагаем два различных подхода: 1) лечения эмбрионов с сильными про-окислителя реагентов или 2) содействие РОС формирования после повреждения тканей.

В рамках первого подхода, мы использовали два различных реагентов в зависимости от конкретных потребностей: перекись водорода (H 2 O 2), как универсального клеточного формирования агента ROS, и ротенон, как конкретного митохондриальной водителя ROS. Ротенон является ингибитором комплекса I части и т.д., которые дерегулирования являются причинным окислительного стресса 41.

Во втором подходе, мы индуцированной накопление АФК, создав рану в хвостовой плавник эмбрионов рыбок данио39. Кроме того, окислительные условия стресса может быть повышен в данио тканей, сбив с впрыском морфолиногруппой на Nrf2 антиоксидантной путь ответа, который является основным сотовой защита от цитотоксического действия окислительного стресса 38.

После того, как оксидативный стресс индуцируют у эмбрионов данио рерио, накопление активных форм кислорода (ROS) может быть измерена с помощью универсальных или митохондриальных конкретные РОС-чувствительные зонды, которые становятся флуоресцентный при активации (т.е. окисление).

Обработанные эмбрионы могут быть проанализированы с помощью метода крепление ROS обнаружения всю или путем применения одного метода обнаружения клеток ROS как представлено на рисунке 1. Выбор между методами зависит от необходимости выполнять качественное или количественное измерение окислительного стресса. Представитель результаты обоих методов представлены на рисунке 2 Рисунок 3.

Всего Метод Гора РОС-обнаружения

Рисунок 2 иллюстрирует применение способа в целом крепление РОС-обнаружения для в естественных изображений окислительного стресса. В частности, этот метод был применен следовать как "сильный" окислительный стресс, порожденный экзогенных про-окислителя лечения, а также "низкий" окислительного стресса, порожденного более физиологических условиях, таких как раны травм или делеции гена.

Физиологические уровни окислительных видов индуцируются генерации микро травмы или широкий рану на хвостовом плавнике живой данио эмбриона на 72 часов после оплодотворения. Было продемонстрировано, что после травмы, H 2 O 2 накапливается в рану запас 20 мин после раны 39. Для того чтобы визуализировать накопление окислительного стресса на полях раны, эмбрионы инкубировали с общимРОС-чувствительных зонд и отображаемого на 20 мин после ранения 39. При сравнении интактные хвостовое оперение с поврежденных хвостов, можно отличить накопление флуоресцентного зонда на краю раны (рис. 2а). Неспецифические слабый сигнал флуоресценции обнаружена по всему хвостовой плавник ткани в обоих условиях.

Чтобы подтвердить конкретную накопление РОС-чувствительной зонда на полях раны, Н 2 О 2 уровнях, на раны были снижены на фармакологического подхода. Поскольку было показано, что запас рана H 2 O 2 накопление чрезвычайно чувствителен к DUOX-ингибитор VAS2870 39, эмбрионы были предварительно обработаны этого ингибитора перед ранение. Сравнение флуоресценции РОС-чувствительной зонда, от VAS предварительно обработанных эмбрионов и соответствующих органов управления, указывает, что сигнал зависит от накопления АФК (т.е. H 2 O 2) (Фиг. 2В).

Кроме того, мы получили высокие уровни окислительных видов в данио тканей обработкой эмбрионов рыбок данио с ротенона. Ротенон обработанных эмбрионов и контроль инкубировали с общим РОС-чувствительной зонда специально выявления видов ROS. После этого зонд промывают, и эмбрионы были обследованы под флуоресценции-стерео микроскопом. Оксидативный стресс был обнаружен во всем теле эмбрионов (рис. 2в). Высокое увеличение изображения показывают анатомические области, где зонд успешно метаболизируется (рис. 2, г). Яркий поля изображения (верхние панели) отличить анатомические структуры, в то время как флуоресцентные изображения (нижние панели) указывают РОС-положительных клеток. Как показали флуоресцентных изображений результаты в основном качественный доклад окислительного обнаружении напряжения, что достигается путем сравнения контроль с обработанными эмбрионов.

Single Cell-РОС Метод обнаружения

Рисунок 3 отчеты представительные FACS участки и количественное определение окислительного стресса путем применения ROS метод обнаружения одной ячейки. Этот метод был адаптирован для измерения окислительные уровень стресса у рыбок данио клеток, которые подвергались усло-окислителя, отраженной в протоколе и, изображенной на рисунке легенд. Как описано, окислительный стресс был измерен путем инкубации данио ткани разложенных на отдельные клетки с РОС-чувствительной молекулярной зонда. Поскольку процедура диссоциации и сам FACS может привести к повреждению клеток, анализ образцов требует, чтобы только "живые клетки" считаются для оксидативного стресса количественного определения. Соответственно, диссоциированных клеток анализировали путем выбора фракцию клеток, показывающих "живой клетке" физические параметры (рис. 3а) и, исключая мертвые клетки (фигура 3В). Таким образом, образцы количественно дляУровни окислительный стресс в соответствии с флуоресценции РОС-чувствительного датчика и для показа эндогенный флуоресценции, такие как положительности для GFP (фиг.3С). Отрицательный контрольный образец для РОС-чувствительной зонда должны быть включены в целях оценки окислительного стресса, индуцированного обработки и технические процедуры (рис. 3C; панель: управление -). Относительная СУИМ участок количественное продемонстрировано в гистограмм, показывающих измерений различных биологических повторяет (рисунок и 3D-E).

Кроме окислительного уровня стресса количественного после водорода лечения перекиси, этот метод был применен для количественного окислительные уровень стресса в физиологических условиях таких нас в nrf2a морфантов и соответствующих органов управления (рис. 3F).

Кроме того, путем объединения метод обнаружения РОС одноклеточные с конкретными РОС-чувствительных датчиков таких нас митохондриальная ROS-чувствительных зондов, можно также измерить окислительного стресса в контексте конкретных митохондрий, ориентированных про-окислителя лечения (рис. 3G).

Рисунок 1. Схематическое фигура способа измерения уровней ROS у эмбрионов данио рерио. Данио рерио взрослых перешли в соответствующих селекционных танков. Оплодотворенных яиц затем собирают в чашки и хранили при 28 ° С, чтобы позволить эмбрион для полного развития. Индукция окислительного стресса может быть достигнуто различными способами, либо фармацевтического лечения или генетическими или физических инсультов. С другой стороны, в случае генетический мутант анализируемого, можно пропустить эту инкубации и двигаться вперед. В этот момент можно продолжить после двух различных методов. Согласно «целой мСпособ р а ф РОС-обнаружение "(слева), данио эмбрионов немедленно инкубировали с флуоресцентной РОС-чувствительного датчика (1), а затем анализировали с флуоресценции или конфокальной микроскопии (2). В методе "один клеток ROS обнаружения" (справа), данио эмбрионов диссоциируют на отдельные клетки (1), инкубировали с флуоресцентной РОС-чувствительного зонда (2) и анализировали с помощью FACS для обнаружения и количественного флуоресцентного (3). Хотя метод "вся гора-РОС обнаружения" позволяет обнаружить окислительный стресс в живых эмбрионов, прежде всего, как качественного анализа, "одноклеточного основе" метода грантов как качественных и количественных измерений окислительных уровня стресса.

Рисунок 2. Представитель результаты метода крепления РОС-обнаружения всей. A) Эмбрионы рыбок данио в 72 часов после оплодотворения были подвергнутычтобы ранив как описано Niethammer ранее соавт., 2009 39. Представительства конфокальные изображения показывают про-окислительные видов (АФК) накопление (стрелки) на краю раны раненого хвостового плавника. Окислительные видов были обнаружены с родовым ROS зонда (CellROX; 2,5 мкМ) через 20 мин после раны было сделано. Шкала бар 20 мкм. Б) Представительства конфокальные изображения, показывающие раны запас эмбрионов данио при 72 часов после оплодотворения. Эмбрионы предварительно обрабатывали VAS2870 (20 мкМ) или ДМСО в течение 90 мин до того, как рана была сделана. АФК были обнаружены с общим РОС-чувствительной зонда (CellROX; 2,5 мкм) 20 мин после ранения. Шкала бар 20 мкм. C) Все тело изображение, показывающее Ротенон-индуцированного окислительного стресса у эмбрионов данио рерио. Окислительный стресс настоятельно обнаружен в хвостовой части эмбрионов, как показано на панели D). Ротенон является мощным ингибитором митохондриальной ETC распространяется в основном SkelЭтал мышечные клетки у рыбок данио. Шкала бар, 180 мкм.

Рисунок 3. Характерные результаты отдельных клеток методом РОС-обнаружение.) Представитель СУИМ график, показывающий типичный образец эмбрионов данио диссоциирован на отдельные клетки. Живые клетки закрытого в R1 регионе в соответствии с FSC-Н и SSC-H параметров. SSC-H: 539 (напряжение), 1,0 (AmpGain), режим: линейная; FSC-H:. E00 (напряжение), 2,1 (AmpGain) B) представитель FACS график, показывающий типичный образец эмбрионов данио рерио диссоциирует на отдельные клетки. Перед анализом FACS, образец был инкубировали с пропидийиодидом (PI; 1 мкг / мл) в течение 5 мин. Мертвые клетки закрытого на R2 регионе в соответствии с П. И. флуоресценции (FL2-H канала). FSC-H: E00 (напряжение), 2,1 (AmpGain), режим: линейная, SSC-H: 539 (напряжение), 1,0 (AmpGain), режим: литийрядом. Напряжение каналы: FL-2:. 613 Вход в) представитель FACS участки, показывающие диссоциирован эмбрионов рыбок данио, подвергнутых лечению прооксидантного (H 2 O 2) и соответствующих органов управления. Эндотелиальные клетки визуализировали с помощью GFP канала. FACS участки представляют все клетки, пострадавших от окислительного стресса (ROS) на UL и UR. Отрицательные клетки нанесены на нижних квадрантах (LL и LR). Tg (Kdrl: GFP) s843 эмбрионы рыбок данио в 48hpf инкубировали с H 2 O 2 (2 мм) или H 2 O в качестве контроля в течение 10 мин. Перед анализом FACS, эмбрионы обрабатывают, как описано в протоколе. Клетки, пострадавших от окислительного стресса обнаруживаются с помощью общего РОС-чувствительный флуоресцентный зонд (CellROX; 2,5 мкм). Образец не выдерживают с РОС-чувствительной зонда был включен в качестве отрицательного контроля. Сравнение образец подвергают обработке прооксидантного с соответствующим контролем, количество клеток нанесены на верхних квадрантов (UL + UR) гораздо выше. СУИМ AcquisНастройки ition были следующими: каналы Напряжение: FL-1: 582 Log; FL-4:. 410 Вход D) Гистограмма, показывающая процент клеток (UL + UR), пострадавших от окислительного стресса в H 2 O 2-обработанные эмбрионов и соответствующие управления. Измерения связаны с образцами, показанных на C. Клетки, пострадавших от окислительного стресса обнаруживаются с помощью общего РОС-чувствительный флуоресцентный зонд (CellROX; 2,5 мкм). Результаты представляют собой среднее из п = 2 различных биологических повторяет ± SD. Е) гистограмму, показывающую процент эндотелиальных клеток (GFP +), пострадавших от окислительного стресса (РОС +) в H 2 O 2-обработанные эмбрионов и соответствующие управления. Измерения связаны с образцами, показанных на C. Результаты представляют собой среднее от N = 2 различных биологических повторяет ± SD. F) гистограмму, показывающую процент клеток, пострадавших от окислительного стресса (РОС +) в nrf2a морфантов (nrf2a МО) и соответствующих органов управления(Ctrl МО) при 24 часов после оплодотворения. Результаты представляют собой среднее из п = 2 различных биологических повторяет ± SD G) гистограмму, показывающую процент клеток, пострадавших от митохондриальной окислительного стресса в обработанных эмбрионов (Ротенон;. 10 мкм) и соответствующие элементы управления (Ctrl; ДМСО) при 72 часов после оплодотворения. После диссоциации эмбрионов на отдельные клетки, митохондриальный окислительный стресс (митохондриальный ROS +) измеряли с помощью митохондриального специфического зонда (MitoSOX, 5 мкМ). Результаты представляют собой среднее из п = 3 различных биологических повторяет ± SD.

Авторам нечего раскрывать.