Методическая статья

Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии

DOI:

10.3791/51345

⸱

28 марта 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Micro-BioRobotics @SSSA, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Department of Biology, University of Pisa, 3Center for Biomolecular Nanotechnologies @UniLe, Istituto Italiano di Tecnologia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ наночастиц взаимодействии с определенными субпопуляций иммунных клеток методом проточной цитометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наночастиц наделены очень перспективных свойств для терапевтических и диагностических целей. Эта работа описывает быстрый и надежный метод анализа с помощью проточной цитометрии для изучения взаимодействия наночастиц с иммунными клетками. Первичные клетки иммунной системы может быть легко очищен от человеческих или мышиных тканей антитело-опосредованной магнитного изоляции. В первую очередь, различные клеточные популяции, работающие в цитометром потока можно отличить по рассеянного вперед света (ФСБ), которая пропорциональна размеру ячейки, и боковой рассеянный свет (SSC), связанных с клеточными внутреннюю сложность. Кроме того, флуоресцентно меченые антитела против специфических рецепторов клеточной поверхности позволяют идентифицировать нескольких субпопуляций в пределах того же образца. Часто все эти свойства различаются, когда клетки повышаются на внешние раздражители, которые изменяют их физиологических и морфологических состояние. Здесь, 50 нм FITC-SiO 2 наночастицы использованы в качестве модели для определения йэ интернализация наноструктурированных материалов в крови иммунных клеток человека. Флуоресценции клеток и боковые рассеянного увеличение свет после инкубации с наночастицами позволило нам определить время и концентрационные зависимости взаимодействия наночастиц клетки. Более того, такой протокол может быть продлен по расследованию Родамин-SiO 2 наночастиц взаимодействие с первичным микроглии, центральной нервной иммунных клеток системы резидентов, изолирован от мутантных мышей, которые специально экспрессии белка зеленый флуоресцентный (GFP) в моноциты / макрофагов. Наконец, проточной цитометрии данные, относящиеся к интернализации наночастиц в клетки были подтверждены с помощью конфокальной микроскопии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наноматериалов являются в настоящее время вдохновляет интерес ученых жизни для потенциальных применений в биомедицине 1. Широкое разнообразие органических и неорганических материалов, могут быть использованы для получения наноструктур с различными формами, физических и химических характеристик. Среди этих структур, искусственных наночастиц сферической формы продемонстрировали большой потенциал для диагностики и трансляционной медицины 2. Их основной и конструктора движет возможного применения и это подразумевает глубокое изучение ответов клеток-мишеней следующие наночастиц контакт и взаимодействие. Наночастицы, что, как полагают, быть намеренно введении человеку придет в непосредственном контакте с несколькими типами иммунных клеток. Их ответственность, чтобы сохранить целостность тела делает их важной темой исследования в области наномедицины 3.

Клеточная часть врожденной иммунной системы в основном представлена ​​фагоциты. Среди них, моноциты / макрофаги линия клеток, полученных, в том числе центральной нервной микроглии система резидентов, играют ключевую роль в иммунной защите 4,5. Они способны вызвать защитные реакции в течение нескольких часов после встречи с зарубежными органами. Кроме того, моноцитов клетки координации и поручить адаптивный иммунный ответ посредством высвобождения цитокинов. Все эти события происходят даже в присутствии инженерных материалов, которые в значительной степени воспринимается как "несамосопряженной" иммунной системой 6.

Среди методов исторически используемых в иммунологии для анализа клеток, проточной цитометрии представляет собой один из самых мощных инструментов. Кроме того, наличие технологий для идентификации или очистки специфического иммунного субпопуляции (часто эксплуататорского исключение или наличие одного мембранного белка) позволяет точное исследование воздействия определенного наночастицы на этой конкретной первичной сеТип LL 7. Однако клетки могут представлять физиологические и морфологические изменения после воздействия наночастиц. Кроме того, наночастицы могут мешать конкретных оптических параметров, таких как поглощения или излучения света на заданных длинах волн, воздействуя полученные результаты 8. Так, ограничения по применению и возможных адаптаций классических иммунологических анализов к изучению новых материалов должны быть рассмотрены.

Эта работа касается обнаружения наночастиц взаимодействия с первичными иммунных клеток методом проточной цитометрии. Для решения этого вопроса, 50 нм FITC-SiO 2 наночастицы были использованы в качестве модели наноматериала, чтобы описать метод. Silica частицы могут быть получены в очень точно в нано-метрика масштабе. Размер, форма и поверхностные свойства, такие как заряд или гидрофобность, может быть точно настроена, чтобы увеличить их биосовместимость 9. Многие особенности SiO 2 наночастиц позволяет им быть использованы в качествемодель для доставки лекарств частиц 10. Кроме того, флуоресцентные красители или квантовые точки могут быть захвачен или связаны с этими частицами, предлагающих полезные нано-инструменты для работы с изображениями целей 11.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ

Образцы людей и животных были обработаны в соответствии с руководящими принципами Министерства здравоохранения Италии, закон 116/92 и Директивы Европейского Совета Сообщества 86/609/EEC.

1. Моноцитов Клеточные культуры

  1. Культура человека ТНР-1 клетки в Т-75 колбы, содержащие RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки человека, 50 ед / мл пенициллина и 50 мг / мл стрептомицина, 0,05 мМ β-меркаптоэтанол при 37 ° С в 5% CO 2.
  2. Сплит культуры, когда сливная (каждые 3-5 дней).

2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от Баффи пальто

  1. Перед началом протокол изоляции, приготовить раствор фосфатно-буферного раствора (PBS), рН 7,2, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA), добавив 5 мл БСА маточного раствора до 95 мл промывки буфером (1: 20 разведение). Дега буфер и держать его холодным (2-8° С).
    ВАЖНО: Несоблюдение дегазации буфер может привести к менее оптимальным результатам, потому что пузырьки могут заблокировать колонну изоляции (см. шаг 3.2).
    Примечание: Антикоагулянт цитрат декстроза формула-А (ACD-A) или цитрат фосфат декстрозы (CPD) Альтернативно может быть применен. С другой стороны, другие альбумина сыворотки белки или из других видов может заменить БСА. Не используйте буферы, содержащие Са 2 + или Mg 2 +.
  2. Получить Баффи пальто от здоровых доноров (в возрасте 20-60 лет).
  3. Подготовка 50 мл конические пробирки для центрифугирования в градиенте плотности. Определить количество труб, необходимых для обработки крови (каждая трубка может обрабатывать 35 мл разведенной крови) и добавить 15 мл Ficoll-Paque каждому пустой трубы.
  4. Развести 8 мл крови с 24 мл PBS / BSA / ЭДТА (1:04 разбавление).
  5. Осторожно слой разбавленный раствор поверх Ficoll-Paque (плотность = 1,077 г / мл) в каждой из 50 мл конические пробирки. Не смешивайтекрови и Ficoll-Paque.
    ВАЖНО: Во избежание смешения крови и Ficoll-Paque, держите трубку при ° углом 45 и слой смеси крови медленно.
  6. Центрифуга при 400 мкг в течение 30 мин при 4 ° С. Мононуклеарные клетки (МНК) останется на границе плазмы Ficoll-Paque, тогда как гранулоциты и эритроциты осадка за счет более высокой плотности на осмотическое давление Ficoll-Paque.
  7. Перенесите межфазных клетки (мононуклеарных клеток периферической крови, МНПК) на новый 50 мл трубки, заполненной PBS / BSA / ЭДТА и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
  8. Вымойте гранул дважды PBS / BSA / ЭДТА для удаления тромбоцитов. Отжим при 200 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  9. Культуры клеток в полной RPMI-1640 с 10% человеческой сыворотки и антибиотиков или перейти к очистке моноцитов.

3. Очистка первичной моноцитов из МНПК

  1. Изолировать моноциты от МНПК разделением магнитного шарика используя HumПан изоляции моноцитов комплект:
    1. Pass клетки через сетку 30 мкм нейлон (предотрывной фильтров, 30 мкм) для удаления возможных сгустков клеток.
    2. Определение количества клеток с помощью гемоцитометра.
    3. Центрифуга клеточной суспензии при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). Аспирируйте супернатант полностью.
    4. Ресуспендируют осадок клеток в 30 мкл PBS / EDTA / BSA буфера на 10 7 общего числа клеток.
    5. Добавить 10 мкл FcR Blocking Reagent на 10 7 общего числа клеток.
    6. Добавить 10 мкл Биотин-антитело коктейль на 10 7 общего числа клеток.
    7. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 5 минут при температуре 2-8 ° С.
    8. Добавить 30 мкл буфера на 10 7 общего числа клеток.
    9. Добавить 20 мкл Анти-биотин микросферы на 10 7 общего числа клеток.
    10. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 10 мин при 2-8 ° С.
    11. Ресуспендируют до 10 8 клеток в 500 мкл PBS / EDTA / BSA буфера.
  2. Магнитный СовместноеAtion
    1. Соответственно, к общему числу клеток, выбрать подходящий столбец MACS и MACS точки (см. MACS столбец спецификацию).
    2. Поместите колонку в магнитном поле MACS Сепаратор.
    3. Столбец Подготовка промывкой соответствующим количеством PBS / ЭДТА / BSA буфера (MS Рубрики: 500 мкл; колонны LS: 3 мл).
      Примечание: Столбцы "поток остановка" и не иссякнет.
    4. Применение клеточной суспензии на колонку. Сбор проточные, содержащий немеченые клетки, представляющий обогащенный фракции моноцитов.
    5. Столбец 3x Промыть PBS / ЭДТА / BSA буфера (500 мкл для MS и 3 мл для LS каждую промывку).
    6. Сбор немеченые клетки, которые проходят через, представляющих обогащенные моноцитов клетки, и добавить в проточных из раздела 3.2.4.
      Примечание: Промыть колонку, добавляя PBS / ЭДТА / BSA буфера аликвоты только когда резервуар колонка пуста.
    7. (Необязательно) Убрать столбец изсепаратор и поместить его на подходящую пробирку. Внесите буфер на колонку (MS столбцов: 1 мл; колонны LS: 5 мл). Сразу спугнуть магнитно меченных nonmonocyte клетки, крепко нажимая на поршень в колонну.
    8. Культура очищают моноцитов в полной RPMI-1640 с 10% человеческой сыворотки и антибиотиков.

4. Очистка первичной моноцитов из цельной крови

  1. Очищают моноциты из цельной крови с использованием цельной набор для выделения моноцитов крови в соответствии с инструкциями изготовителя.

5. Наночастиц Интернализация в крови лейкоцитов и очищают моноцитов

  1. Виброплиты 5 х 10 5 клеток / мл (1 мл / лунку) из изолированных МНПК или очищенных CD14 позитивных моноцитов в 12-луночный планшет.
  2. Vortex FITC-SiO 2 наночастиц раствор и ресуспендируют в полной среде в рабочей концентрации 100 нМ.
  3. Добавить 10 мкл работает nanopстатья подвеска (100 нМ) в течение обработанных образцов по достижению наночастиц конечной концентрации 1 нМ. Добавить такой же объем полной среде для необработанных контрольных в каждую лунку.
  4. После 1 часа интернализации сбора образцов в 1,5 мл полипропиленовую пробирку и центрифугируют их в течение 3 мин при 6000 х г при комнатной температуре.
  5. Вымойте гранул с 1 мл работает буфер 3 мин при 6000 мкг при комнатной температуре.
  6. Ресуспендируют осадок в 200 мкл рабочего буфера. Клетки теперь готовы для чтения с помощью проточной цитометрии.

6. Выделение первичных смешанных глиальных культур (См. Bertero др.. 7)

7. Replating Смешанная глиальных Конфлюэнтные Клеточная культура

  1. Промыть Т-75 колбу один раз 10 мл PBS (без Ca 2 + / Mg 2 +), затем добавляют 10 мл версеном и инкубируют при 37 ° С в течение 5-7 мин.
  2. Внесите супернатант вверх и вниз несколько раз для того, чтобы отделить клетки с поверхности Т-75 и растворитьсотовые заполнители.
  3. Передача клеточной суспензии в 15 мл полипропиленовую трубку. Сбор небольшое количество суспензии клеток для подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
  4. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 300 х г при комнатной температуре.
  5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в конечной концентрации 5 × 10 5 клеток / мл в глиальных полной культуральной среде.
  6. Тарелка 0,5 мл / лунку в 24-луночный планшет и пусть клетки довольствоваться 2-4 часа до начала лечения наночастиц.

8. Наночастиц Интернализация в микроглии

  1. Добавить 500 мкл полной глиальных культуральной среде (для необработанных контрольных) или 500 мкл 2x Родамин-SiO 2 суспензии наночастиц в полной глиальных культуральной среде (для обработанных образцов) в каждую лунку.
  2. Внесите клетки, чтобы отряд nonrapid-придерживаясь клеток в выбранных временных точках и собрать их в 2 мл полипропиленовые пробирки.
  3. Добавить 500 мклиз версеном в каждую лунку и инкубируют планшет при 37 ° С в течение 5 мин, затем отсоединить оставшуюся часть клеток и собирают каждый образец с соответствующими nonadhering клеток на предыдущем этапе.
  4. Центрифуга образцов в течение 3 минут при 300 х г при комнатной температуре.
  5. Ресуспендируют осадок в 100 мкл рабочего буфера AutoMACS.

9. Окрашивание CD11b-VioBlue

  1. Добавить 10 мкл VioBlue-CD11b человеческого / мышиного антитела к 100 мкл клеточной суспензии (соотношение 1:11), в рабочем буфере и инкубируют 10 мин при 4 ° С.
  2. Добавить 1 мл рабочего буфера и перемешивают клеточной суспензии.
  3. Центрифуга каждый образец в течение 3 мин при 300 х г.
  4. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 100-150 мкл рабочего буфера.
  5. Прочитайте образцы в цитометром (хранить образцы при 4 ° С между двумя последними шагами).
    ВАЖНО: прежде чем анализировать образцы, перейдите к компенсации перекрывающихся сигналов яспектры н выбросов наблюдается между различными флуорохромами (конъюгированное с флуорохромом наночастиц или антитела).

10. Спектральный перекинуться компенсации

  1. Откройте окно "Настройки инструмента" (присутствует во всех программах инструмент программного обеспечения).
    Примечание: При использовании другого прибор от одной сообщается в материале таблице, пожалуйста, обратитесь к специальному руководству приборной для деталей приобретения.
  2. Приобретать необработанного образца (без наночастиц) при низкой жидкостного скорости (если это разрешено прибора). Во время приобретения, вручную настроить вперед и из стороны рассеяния (FSC и SSC, соответственно), регулируя каналы напряжения.
    Примечание: изменить ось весы SSC и FSC для того, чтобы лучше визуализировать полную население клеток в участке. Инструмент настройки шаблона для каждого типа клеток, представляющих интерес может быть создан, сохранить и использовать для дальнейших приобретений.
  3. Откройте спецификуВкладка «регион» в программном обеспечении. Нарисуйте соответствующий большую область ("ворота") относительно заданной населения.
    Примечание: Интернализация наночастиц индуцирует SSC сдвиг клеток. Если ворота слишком строго ограничено вокруг клеточной популяции интереса, полученные данные, вероятно, пропустить часть ячеек, которые будут обнаружены.
  4. Используйте два неокрашенных образцов, по одному для использования в качестве холостой пробы и один для компенсации от PI окрашивания (опционально), один единственный окрашенных пробу соответствующим флуорохромом для каждого флуоресценции канала на получение компенсации.
    Примечание: Используйте другую 1,5 мл пробирку для каждого флуорохромом-сопряженных антител, которые будут использоваться в эксперименте маркировки.
  5. Откройте вкладку "компенсация" в поле "Настройки инструмента". Увеличение или уменьшение коэффициента коррекции при приобретении пока интенсивность флуоресценции в спилловер канала не примерно то же самое для флуорохромом позтельным и отрицательным населения.
  6. Приобретать образцы наночастиц обращению после компенсации была скорректирована.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проточной цитометрии является полезным инструментом, чтобы определить и охарактеризовать различные клетки, и это является методом выбора для выявления конкретных иммунных клеток, таких как моноциты, гранулоциты, Т-клеток, В-клеток, естественных киллеров (NK) клеток, дендритные клетки (ДК), и другие субпопуляции лейкоцитов.

В попытке лучше характеризуют белых кровяных клеток поведение в ответ на наночастиц, мы провели интернализации анализов с первичными лейкоцитов, выделенных из крови здоровых доноров (рис. 1 и 2) и с человеком моноцитов клеточной линии (клетки ТНР-1, рисунок 3) .

Как сообщалось, в рисунке 1а, три основные субпопуляции лейкоцитов в крови были четко определены вперед и из стороны рассеяния после выделения МНПК. Более того, после FITC-SiO 2 лечения, лимфоциты (серый), моноциты (синий) и гранулоциты (красный) имеют различный пanoparticle скорость интернализации как показано зеленым интенсивности флуоресценции (рис. 1В). Описанный протокол позволяет очистка первичных CD14 позитивных моноцитов из РВМС. 2А сообщает проточной цитометрии точка участке CD14 + моноцитов в присутствии FITC-SiO 2. Фиг.2В показано FITC-SiO 2 интернализации количественно в тех же самых клетках и выражали в логарифмическая шкала гистограммы.

Подобные интернализации эксперименты проводились на ТНР-1 моноцитов, получавших с увеличением концентраций ФИТЦ SiO 2 наночастиц. Необработанные клетки были использованы в качестве отрицательного контроля. Фиг.3А показывает зависимое от дозы увеличение в сторону рассеяния при неизменном рассеяния вперед в ТНР-1 клеточную линию. На фиг.3В, вместе с гистограмм SSC и ЛПС на каждом FITC-SiO 2 наночастиц концентрации тестируемого, средняя интенсивность флуоресценции (МFI) количественное представлена. Эти данные показывают, что лечение с помощью FITC-SiO 2 наночастиц индуцирует дозозависимое интернализации в моноцитов, выделенных повышению внутриклеточного детализации (со стороны рассеивающей) и флуоресценции (зеленый канал).

Чтобы получить более полное представление о типе взаимодействия иммунных клеток и наночастиц, первичные смешанные глиальные культуры выделяют и микроглии, центральной нервной клетки иммунной системы резидентов, очищают. Использование трансгенных мышах, экспрессирующих зеленый флуоресцентный микроглии позволяет визуализировать различных нервно-воспалительных механизмов. Трансгенной мыши B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J использованы в этой работе выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем промотора CX3CR1 12. Через 7 дней в пробирке (DIV), флуоресцентной микроскопии показывает смешанный первичный глиальных культуру с большим количеством астроцитов (GFP отрицательным прилипший клетокы) и некоторые зеленые клетки (GFP положительные, 5А). В этой модели мыши, три глиальные субпопуляций могут быть выделены с помощью проточной цитометрии с одним CD11b-антител окрашивания: первый CD11b - GFP - (астроциты и другие глиальные клетки), второй отдельной группе микроглии CD11b +-клеток GFP + и Третий CD11b + GFP - субпопуляции (рис. 4А). Эти два последних субпопуляций оба способны усваивать наночастиц с небольшим повышением эффективности по GFP + населения (представляющего патрулирование незрелых микроглии по транскрипции промотора CX3CR1), как показано на проточной цитометрии (фиг.4В). Произошло интернализации может быть дополнительно проверена с использованием той же конечной концентрации родамина-SiO 2 наночастиц, как показано на фиг.5В с помощью конфокальной микроскопии.


Рисунок 1. FITC-SiO 2 наночастиц интернализация в изолированных крови лейкоцитов.) Представитель рассеяния вперед (FSC) по сравнению с бокового рассеяния (SSC) проточной цитометрии точка участке Ficoll-Paque изолированных лейкоцитов крови. Б) Зеленый флуоресцентный наложения гистограмма участок из трех основных лейкоцитов крови сотовые субпопуляции в присутствии 1 нМ FITC-SiO 2 наночастиц (+45 мВ) в течение 1 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-1
2 наночастиц интернализация в CD14 + очищенные моноциты.) Представитель рассеяния вперед (FSC) по сравнению с бокового рассеяния (SSC) проточной цитометрии точка участке очищенных CD14 позитивных моноцитов. Б) Зеленый флуоресцентный гистограмма участок очищенной моноцитов субпопуляции в присутствии 1 нМ FITC-SiO 2 наночастиц (+45 мВ) в течение 1 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 3. Эффекты FITC-SiO 2 наночастиц интернализации на ТНР-1 клеток.) ​​Представитель рассеяния вперед (FSC) по сравнению с боковой scatterinг (SSC) проточной цитометрии точка участке ТНР-1 моноцитов клеточной линии, после 1-часовой экспозиции FITC-SiO 2 наночастиц увеличением концентрации. B) зависит от концентрации изменение бокового рассеяния (SSC), рассеяние вперед (FSC) и зеленый флуоресценции в присутствии FITC-SiO 2 наночастиц (+45 мВ) в течение 1 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 4. Родамин-SiO 2 наночастиц интернализация в первичную микроглии, выделенной из B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J мышей.) Зеленый флуоресцентный белок (GFP) против CD11b-VioBlue проточной цитометрии точка участке пр.imary смешанный глии изолированы от B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J мышей. CD11b + GFP + и CD11b + GFP - население показаны в верхнем правом углу и нижнем правом углу квадранта соответственно B) Красный флуоресценции наложения гистограммы микроглии субпопуляций в присутствии 1 нМ Родамин-SiO 2 наночастиц (+45 мВ) на 30. мин (красный гистограмма) в сравнении с контролем (серый гистограммы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 5. Визуализация GFP +-микроглии. (A) люминесцентной микроскопии на 7 DIV и (В) конфокальной микроскопииродамина-SiO 2 наночастиц интернализации (красные стрелки) в GFP +-микроглии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работают представляет очень важных моментов, которые необходимо принять во внимание. Это действительно важно для работы при температуре 4 ° С (на льду) и, возможно, в темноте в течение всех этапов окрашивания, так как более высокие температуры и света может негативно сказаться на урожайности окрашивания. Наночастицы могут быть ультразвуком быть лучше ресуспендировали непосредственно перед использованием.

Правильное проточной цитометрии анализа требует правильной калибровки в различных каналах. Калибровка прибора должна быть выполнена перед каждой экспериментальной сессии. Кроме технических проблем с приборами, может быть также проблемы с маркировки антител. Он является обязательным использовать антитела в соответствующей концентрации. Если концентрация слишком высокая или слишком низкая, не удовлетворяющие интенсивности сигналов может быть следствием.

К недостаткам этой методики озабоченность необходимости работы с монодисперсных образцов, неспособность локализоватьсайт происхождении сигнала (т.е. различные клеточные отсеков). Есть также некоторые ограничения в выборе флуорохромами, которые будут использоваться в комбинации: длина волны возбуждения и полос излучения должны быть достаточно разделены, чтобы позволить их надлежащего измерение. Если используемые спектры антител перекрываются, правильно компенсация не требуется.

Проточная цитометрия представляет собой мощный метод анализа клеток в присутствии или в отсутствие наночастиц. Эта техника позволяет многопараметрическая изучение клетки, большое количество событий, рассмотренных, быстрота анализа (более 1000 ячеек / с), воспроизводимости и статистические показания. Образцы могут быть обработаны без потери жизнеспособности клеток.

С помощью флуоресцентно меченных наночастиц можно претендовать и количественной оценки их интернализации в клеточных субпопуляций, которые, определенных специфических маркеров, выставленных на клеточной мембране. Параметры решетки может изменяться в присутствии S pecific наночастицы. В зависимости от цели исследования, эти изменения могут быть использованы для идентификации конкретного явления, такие как боковой рассеяния клеток, которые пропорционально возрастает с увеличением скорости интернализации наночастиц.

Наночастиц-индуцированной модификации поверхности клеток также может представлять собой ограничение этого метода. По этой причине оборот рецепторов клеточных мембран должно быть всегда принимать во внимание и, возможно, известны заранее, чтобы точно охарактеризовать популяцию клеток интерес. Экстремальные нарушения мембранного осмоса в наночастиц перегружен образцов может привести к гибели клеток.

Наноматериалов зависит от дозы токсичность следует эмпирически проверены на каждой клеточной популяции. Четко определенные мертвые клетки должны быть исключены из флуоресценции количественного. Например, окрашивание аннексина V / PI является одним из нескольких методов, обычно используемых для обнаружения и некротические и апоптотических клеток.

"> GFP-экспрессирующих первичные клетки также являются мощным инструментом, чтобы выбрать определенный субпопуляции клеток и сбор данных без prelabeling. Сочетание с дополнительными люминесцентных наночастиц позволяет очень быстро и точно количественная оценка взаимодействия клеток наночастиц. Наркотиков или ген доставка, как полагают, улучшить в дальнейшем путем применения наночастиц в состоянии выпустить определенную лекарственную нагрузку в выбранных тканей.

Занятость наночастиц также конкретные носители доставки и / или иммуномодуляторов для фармации требует знания биологической среды (т.е. через проточной цитометрии) для изучения клеток наночастиц взаимодействия.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что Miltenyi Biotech GmbH выступил спонсором представления этой рукописи. HiQ-Нано компании ( http://www.hiq-nano.com/index.html ) является нанотехнологии выделении компании возникла из ИИТ.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Fondazione Istituto Italiano ди Tecnologia.
Авторы хотели бы выразить признательность Miltenyi Biotec GmbH (Бергиш-Гладбах, Германия) за спонсорскую этой рукописи, доктор Паоло Петручиани (Департамент Иммуно-гематологии и службы переливания, больницы Лотти Pontedera, Пиза, Италия) для обеспечения Баффи пальто человека и Профессор Массимо Паскуалетти (Биологический факультет - Единица Cellular и биологии развития, Университет Пизы, Пиза, Италия) для размещения колонии мыши.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HBSSGibco14170-088Тепло в 37 градусов; C водяная баня перед использованием
RPMI-1640 (ATCC Modified)GibcoA10491-01Прогреть в 37 градусов; C водяная баня перед применением
DMEM, высокий уровень глюкозы, фенол красныйGibco41966-029
Пенициллин-стрептомицин, жидкостьGibco15140-122
ГентамицинGibco15710-049
Сыворотка для лошадей (лот n° 1131917)Gibco16050-122
β-меркаптоэтанолGibco21985-023
Трипсин 2,5%Gibco15090-046
Человеческая объединенная сывороткаInvitrogen34005100
VerseneInvitrogen15040-033
DNAse ISigma AldrichD5025-150KU
CD11b-VioBlue человек и мышьMiltenyi Biotec130-097-336
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec130-091-376
autoMACS Раствор для промывки Miltenyi Biotec130-091-222
Беговой буферMiltenyi Biotec130-092-747
autoMACS Running BufferMiltenyi Biotec130-091-221
Набор для выделения моноцитов человеческой сковороды Miltenyi Biotec130-096-537
Набор для колонки цельной кровиMiltenyi Biotec130-093-545
Микрогранулы цельной крови CD14, человеческаяMiltenyi Biotec130-090-879
Колонка MSMiltenyi Biotec130-042-201
Колонна LSMiltenyi Biotec130-042-401
Сепаратор MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
Сепаратор MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
Раствор для лизиса эритроцитов Miltenyi Biotec130-094-183
Фильтры предварительной сепарации 30 & микро; mMiltenyi Biotec130-041-407
MACSQuant Анализатор проточный цитометрMiltenyi Biotec130-092-197
MACSQuant калибровочные шарикиMiltenyi Biotec130-093-607
Ficoll-Paque PremiumGE HealthcareGEH17544202
FITC-SiO2 наночастиц (50 нм, +45 мВ)HiQ-Nano Company
Родамин-SiO<суб>2 наночастицы (50 нм, +45 мВ)HiQ-Nano Company
12-луночный планшет FalconBecton Dickinson353043

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, X. Q., et al. Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).
  2. Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles. Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).
  3. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Immunological properties of engineered nanomaterials. Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).
  5. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
  6. Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462, 449-460 (2009).
  7. Bertero, A., et al. Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia. Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).
  8. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays. Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).
  9. Malvindi, M. A., et al. SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing. Nanoscale. 4, 486-495 (2012).
  10. Bardi, G. SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery. Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).
  11. Bardi, G., et al. The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance. Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).
  12. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи