Клеточная терапия для сердечной недостаточности у крыс: Двухместный Торакотомия для инфаркта миокарда и эпикарда Имплантация клеток и Biomatrix

С конца ^19-го века, сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему номер один серийный убийца в промышленно развитых странах. Среди них, ишемическая болезнь сердца представляет собой основную этиологию. Острая фаза приводит к инфаркта миокарда (ИМ) и следуют неадекватные ремоделирования, что постепенно развивается в сторону хронической фазе и тяжелой сердечной недостаточности. Несмотря на недавние значительных технологических и терапевтических достижений, заболеваемость и смертность в связи с прогрессированием сердечной недостаточности по-прежнему растет ^1. В этом контексте, клеточная терапия получила все больший интерес в качестве нового метода терапии, чтобы остановить прогрессирование болезни к сердечной недостаточности и стимулировать недавно идентифицированный регенеративные способности миокарда. Экспериментальные и клинические исследования предоставили убедительные доказательства благотворного влияния, полученных после трансплантации сердца в различных типах клеток. Основные исходы включали улучшенное CardiФункция переменного сократительная, снизился ремоделирования левого желудочка, уменьшается размер инфаркта, и повышение сосудистой плотности в зоне инфаркта. Тем не менее, сохранение низкого количества клеток после инъекции клеток остается важным недостатком. Ассоциация клеток с биоматрицы улучшения доставки клеток ² недавно способствовали исследователь и клинические интересы.

Лигирование левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) является эталонным методом для ИМ в небольшой животной модели, что приводит к трансмурального инфаркта и зрелого рубца. Сотовый терапии, примененной в хронической фазе инфаркта миокарда требует второго хирургического вмешательства. Средний стернотомия обычно выполняется, чтобы интрамиокардиальной инъекцию клеток или эпикардиальной имплантации biografts. Такие инвазивные хирургические процедуры увеличения смертности, послеоперационной время восстановления, боль и риск инфицирования. Малоинвазивная подход, представленный здесь не только предотвращает такую ​​предвзятость, но и предоставляет оptimal доступность сердце, предназначенная для обработки. MI и эпикардиальная имплантация клеток, связанных с типа гель биоматрицы выполняются на работающем сердце с помощью левых межреберных торакотомии.

ПРИМЕЧАНИЕ: Льюис самцов и самок крыс, 200-220 г были в стандартных лабораторных условиях (12 ч света и темноты, вволю воды и пищи, IVC клетка). Все животные были обработаны в соответствии с рекомендациями FELASA и швейцарского Закона о защите животных.

1 Приготовление клеток: мезенхимальных стволовых клеток Выделение из костного мозга

1. Обезболить крыс с изофлуран и 5% O ₂ 5 л / мин в индукционной камере в течение 5 мин. Поместите морду животного на носовой обтекатель, подключенного к системе анестезии. Выполните ног или хвоста щепотку, чтобы подтвердить седации.
2. Снимите кожу от ноги ножницами, сокращая кожу от лодыжки до бедра. Удалить мышцы и сократить бедренную артерию для животных обескровливания. Expose тазобедренный сустав и вывихнуть бедренной головой. Важно, чтобы не повредить бедренной головой. Поместите кости в стерильном PBS в 50 мл пластиковую пробирку.
3. Удалите все муscles и связки от кости, не нарушая их. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, что кость остается неизменным, чтобы избежать увязки решения промывки или загрязнения с этанолом. Промыть очищенных костей в 70% этаноле в течение 5 мин.
4. Под стерильной ламинаре, палка о двух кончики костей с ножницами. Промойте костный мозг, вводя стерильной PBS из костного конечности. Сбор мозга в 15 мл пробирку. Центрифуга 7 мин при 300 х г в.
5. Удалить супернатант. Приостановить осадок в 3 мл Красная кровь буфера для лизиса клеток. Инкубируйте суспензию в течение 1 мин при комнатной температуре, прежде чем снова вращается в течение 7 минут при 300 х г в. В колбе для культивирования 150 мл, добавить стерильную клеточную культуральную среду (395 мл IMDM среднего, 5 мл ручка / стрептококковая, 100 мл FBS) и семян клетки.
6. Изменение среднего второй день, чтобы удалить прилипших клеток.
   1. Выполнение средних изменений каждый второй день в течение 2-3 недель, пока не будет получен желаемый количество клеток.
   2. Кроме того, подготовить biograft семенамичисле клеток на твердой матрице по мере необходимости и описано в другом месте ^3.
7. День сердечной имплантации, подготовки клетки или урожай biograft перед эпикардиальной применения.
   1. Сбор клеток с использованием Accutase открепления клеток решение. Граф клеток. Наполните 1,5 мл центрифужную пробирку с объемом суспензии клеток рассчитанное так, чтобы получить требуемое количество клеток. Центрифуга в течение 7 минут при 300 мкг в и удалите супернатант.
   2. Кроме того, урожай biograft от клеточной культуральной среды, промыть в стерильной PBS, и держать в свежей культуральной средой без сыворотки.

2 первых Торакотомия и ЛАД Лигирование

1. Взвесьте крысу. Включите грелку при 37 ° С. Обезболить крысу с 5% изофлуран и 5 л / мин 100% O ₂ в индукционной камере 5-7 мин. Выполните ног или хвоста щепотку, чтобы подтвердить седации. Поместите крысу на грелку.
2. Интубировать животное с 14G внутривенный катетер. Подключение интубации катетер к вентилятору, запрограммированного для грызунов 2,5 л / мин кислорода, 2,5% изофлуран, дыхательного объема 2 мл, и частота дыхания 90 вдохов / мин.
3. Подготовьте бупренорфин решение в 0,1 мг / кг. Введите подкожно треть решения. Бритье левую часть грудной клетки. Лечить с 1% раствором Бетадин.
4. Надрезать кожу перпендикулярно к грудине на четвертом межреберье. Отделите 3 слоев грудной мышцы (грудная, по возрастанию грудной и наружной косой грудной). Откройте четвертую межреберье (между ребрами 4 и 5).
5. Используйте маленькую втягивающим распространяться ребра и подвергать сердце. Осторожно откройте перикарда. Найдите и перевязывать передней нисходящей коронарной артерии (LAD) с 7,0 шов 4 мм ниже атриуме.
6. Закройте межреберье с двумя стежками с использованием 3,0 швов. Расположите два швы проксимально и дистально от грудины. Во-первых, тighten дистального шва. Зажмите выпускной трубы вентилятора для 2 сек для того, чтобы раздуть грудь и избежать пневмоторакс. Затяните вторую шва. Расположите слои мышц на место (не швы не нужны). Закройте кожу с 5,0 шва.
7. Лечить шва с 1% раствором Бетадин. Введите остальную часть раствора бупренорфина. Выключите систему анестезии. Удалить интубации катетер.
8. Держите крысу в клетке под теплым лампы в течение 1-2 часов. Хранить термометр в клетку и контролировать расстояние между лампой и теплой клетке, чтобы избежать перегрева. Вернуться крысу в блоке IVC. Введите подкожно бупренорфина 0,05-0,1 мг / кг Опубликовать -operatively каждый 6-12 ч в течение 48 ч.

3 эпикардиальной Администрация лечения через второй Торакотомия

1. Повторите шаги 2.1-2.3.
2. Надрезать кожу перпендикулярно к грудине в пятом межреберье. Отделите 3 слояс грудной мышцы (большой грудной мышцы, по возрастанию грудная и наружная косая грудной). Откройте пятом межреберье (между ребрами 5 и 6).
3. Используйте маленькую втягивающим распространяться ребра и подвергать сердце. Если есть следование, тщательно удалить их с тонким пинцетом.
4. Найдите площадь инфаркта, который появляется в виде бледно-области ниже лигатуры. ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте 10 см кусок шва (7,0), вставленный в вершине, чтобы лучше представить себе в левый желудочек. Аккуратно потяните к шву поддерживается слабо зажимом подвергать сердце.
5. Применить один из следующих процедур:
   1. Расположите biograft на поверхности сердца. С помощью предварительно заполненный шприц фибринового герметика подогретую при комнатной температуре в течение 10 мин. Нанесите каплю (50-100 мкл) фибринового герметика под biograft с помощью иглы 25 G Luer. Убедитесь, что biograft является полностью герметичным.
   2. Кроме того, применяются осадок клеток, собранных с кончика пипетки на поверхности Ое сердце на бледно области ниже лигатуры. Нанесите каплю (50-100 мкл) фибринового герметика на осадку клеток.
6. Извлеките часть шовного материала от вершины.
7. Повторите шаги 2.6-2.8.

Все животные восстанавливается в течение 1 часа после торакотомии. Заживление ран было быстрым. Не наблюдалось инфекция или отек.

Двойной левый торакотомия разрешено оптимальный доступ к сердцу (Рисунок 1). Боль и послеоперационной смертности был низким. Животное быстро оправились от операции и прибавил в весе (Рисунок 2). Каплан Меир выживание процентов было 96% в первый торакотомии. Четыре крысы более 104 умерли в течение следующего приложения обработки 24 ч через второй торакотомии. Каплан-Меир процентов выживаемости колебалась от 100%, когда животное получало второй торакотомия, но не лечения (обман), 96% для MSC и фибрина герметика группы, или 86%, если животное получало MSC впрыскивается непосредственно в миокарде (рисунок 3).

Оценка эхокардиографии в М-режиме выполняется 2 недели после ЛАД перевязки показали снижение фракции укорочения (FS) от 44 ± 3%до 22 ± 4%. Представление частота FS, записанных на 104 животных 2 недели после ЛАД лигирования предусмотренных доказательства повторяемости метода (Рисунок 4). Коэффициент вариации (CV) составила 17%. Кроме того, эхокардиография выполняется в 2 и 6 недель после ЛАД перевязки показал прогрессия к сердечной недостаточности, предложенной к уменьшению фракции выброса (ФВ) и увеличением объемов ЛЖ в диастолы и систолы (рисунки 4 и 5). Развитие трансмурального инфаркта в группе ложнооперированных было подтверждено окрашиванием Goldner поперечных сечений сердца (рисунок 6).

Рисунок 1 (А) Использование втягивающего разрешается доступ к сердцу следующей торакотомия. ЛАД перевязки проводили на 2 недели раньшеи шов виден (стрелка). Эпикарда приложение Обработку проводили с минимальным экстериоризацию сердца. (Б) Клетки фиксировали на пеллетах фибринового герметика поддерживали на поверхности области инфаркта.

Рисунок 2 Daily послеоперационный период наблюдения показал потерю веса в течение 2 дней после операции. Восстановление сопровождалось усилением веса у всех животных. Изменения веса не зависели от типа обработки.

Рисунок 3 Каплан-Меир график, представляющий процентов сообщение выживание ЛАД перевязка (А) и после лечения с помощью Второй торакотомия (B) показали, что оба операции привело к снижению потери животных. Контрольная группа представляет здоровое животное, что не имел хирургию. Через две недели после первого торакотомии, животные получали либо имитации операции, но не лечения (обман), фибринового герметика один, клетки фиксированные с фибринового герметика, или клетки, непосредственно вводится в миокард (MSC вводили).

Фигура 4 (А) представитель M-режим эхокардиография изображения, зарегистрированные до (здоровый) и 2 недели после ЛАД перевязка (инфаркту). Распределение (B) Частота дробных значений укорочение записаны две недели после ЛАД перевязка (п = 104).

390fig5highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок функция 5 Сердце оценивали по 2dimentional эхокардиографии (метод биплан Симпсона) и записал 2 и 6 недель после ЛАД перевязки. Животное было два торакотомии, но не получил никакого лечения. Среднее ± SD, а также отдельные значения представлены для фракции выброса (A) объемом ЛЖ в систолу (B) и диастолы (С). Статистический анализ проводился с использованием парного непараметрического критерия Вилкоксона.

Рисунок 6 Представитель Голднер окрашивания показывая фиброзный рубец (зеленый) и жизнеспособного миокарда (красный) на 2 недели (А) и 6 недель (B) сообщение ЛАД лигирования.

Авторам нечего раскрывать.