Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса

22.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51406

⸱

23 апреля 2014 г.

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем наш стандартный метод перепрограммирования соматических клеток человека в трансгенных без человека ИПСК с вирусом Сендай, который показывает последовательное исход и повышенную эффективность.

Аннотация

Несколько лет назад, создание человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) открыла новую эпоху в биомедицине. Потенциальные области применения человеческих ИПСК включают моделирования патогенеза генетических заболеваний человека, аутогенной клеточной терапии после коррекции гена, и персональная проверка лекарств, предоставляя источник конкретного пациента и симптомов соответствующих клеток. Тем не менее, существует несколько препятствия для преодоления, такие как устранение оставшегося фактор перепрограммирования трансгена выражение после производства человека ИПСК. Что еще более важно, остаточная трансгенная экспрессия в недифференцированных человека ИПСК может помешать надлежащие дифференциации и дезинформировать интерпретацию болезни-соответствующей в фенотипов пробирке. С этой причине интеграция свободной и / или трансгенные свободного человека ИПСК были разработаны с использованием нескольких методов, таких как аденовирус, системы PiggyBac, minicircle вектор, эписомные векторы, прямой доставки белков и синтезированы мРНК. Тем не менее, эффективность reprogramming помощью интеграции без методов является довольно низким в большинстве случаев.

Здесь мы представляем метод, чтобы изолировать человека ИПСК с помощью Сендай-вирус (РНК вируса) на основе системы перепрограммирования. Этот метод перепрограммирования показывает стабильные результаты и высокую эффективность в экономически эффективным образом.

Введение

Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) имеют мощность до самообновлению в пробирке и есть плюрипотентности, который может быть потенциально полезными для моделирования заболевания, для скрининга лекарственных средств, а также разработки клеточной терапии для лечения заболеваний и повреждения тканей. Тем не менее, ЭСК имеют ограничение для заместительной клеточной терапии из-за иммунологических, онкологических и этических барьеров, а также для изучения генов заболеваний, связанных, по конкретным болезням ЭСК могут быть выделены через предимплантационной генетической диагностики (ПГД) приближается, но он по-прежнему технически сложными и эмбрион пожертвования довольно редки. Эти вопросы связаны с прогрессом в биологии стволовых клеток, что привело к развитию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs).

Человека ИПСК генетически перепрограммировать от взрослых соматических клетках человека и гавань плюрипотентных клеток-подобные функции стволовых подобные ЭСК, что делает их полезным источником для регенеративной медицины, таких как гОткрытие ковер, моделирование болезней и клеточной терапии в пациент-специфической манере 1,2.

До сих пор, есть несколько методов для создания человека ИПСК, в том числе вирус-опосредованной (ретровируса и аденовируса) 3, не вирус опосредованной (система БАК и векторы трансфекции) 4 гена каскадов, и белок система доставки 5-7.

Хотя поставка вирус-опосредованной генов может обеспечить определенный уровень эффективности, вирусные векторы могут оставить генетический след, потому что они интегрироваться в хромосомы хозяина, чтобы выразить гены перепрограммирования неконтролируемым образом. Даже когда вирусный интеграция факторов транскрипции может активировать или инактивировать гены хост-8, это может вызвать неожиданное генетической аберрации и риск онкогенеза 5,9. С другой стороны, сообщалось прямое введение белков или РНК в соматических клетках, но имеют некоторые недостатки, такие как трудоемкий, при неоднократном TransfАЗДЕЛ, и низкий уровень перепрограммирования 7,10. Даже эписомными и не интеграции аденовирус, вирус адено-ассоциированный, и плазмидные векторы все еще ​​относительно менее эффективным 11. По этим причинам, то вполне вероятно, чтобы выбрать не-интеграционные методы перепрограммирования с высокой эффективностью генерации IPSC и меньше генетических аномалий. В этом исследовании, мы используем перепрограммирование Сэндай вирус основе. Этот метод, как известно, не-интегрированы в геном хозяина и последовательно производит человека ИПСК без трансгенных интеграции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка Cell и СМИ (день 1)

  1. Культура и расширить фибробластов человека с DMEM среде, содержащей 10% FBS.
  2. Пластинчатые фибробласты человека (рис. 1) на 24-луночный планшет при соответствующей плотности на лунку в день перед трансдукции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие серийные разведения рекомендуется (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K и 6.25K), потому что разные типы клеток имеют разные способности вложений.
  3. Инкубируйте клетки для еще одного дня в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора, обеспечивая клетки полностью придерживался и расширена.

2. Выполните трансдукция (День 2)

  1. В день трансдукции, проверьте плотность клеток и выбрал наиболее эффективные скважин плотности (рис. 2). Лучше выбрать три различных плотностей: высокая (80 ~ 90%), средний (50 ~ 70%) и низкий (20 ~ 40%).
  2. По крайней мере, 1 час до трансдукции, аспирации fibroblАСТ носители из клеток и изменение новых 300 мкл фибробластов среды.
  3. Удалить один набор 4-х различных вирусных Сендай труб от -80 ° C хранения. Оттепель каждую пробирку в то же время в водяной бане при 37 ° в течение нескольких секунд, а затем извлечь пробирки из водяной бане. После этого оттаивают их до комнатной температуры; центрифужные пробирки на 6000 мкг в течение 10 сек и разместить их на льду до использования. Не повторно при замораживании и оттаивании вирус, так как титры не будет поддерживать.
  4. Добавить указанные объемы каждой из четырех труб вирус Сендай (OCT-4, Klf-4, с-Myc и Sox-2) в микро-центрифужную пробирку. Убедитесь, что раствор хорошо перемешивают с помощью пипетки осторожно.
    Например, если 50K клеток / одна скважина из пластины lookwell 24-а для трансдукции:
    (Титр на основе сертификата анализа от Life Technologies, может отличаться от партии к партии)
    Труба hOct-4 = 6,0 х 10 7 CIU, 3 МВД = 5 мкл
    Труба hSox-2 = 6,5 х 10 7 CIU, 3 МВД = 4,6 μ; Л
    Труба hKlf-4 = 6,3 х 10 7 CIU, 3 МВД = 4,8 мкл
    Труба жк-Мус = 7,8 х 10 7 CIU, 3 МВД = 3,8 мкл
    Всего = 18.2 мкл четырех вирусных факторов смесь / один а (50K ячеек) 24-луночный планшет
  5. В зависимости от плотности клеток; добавить 2X, 1X, и 0.5x объем вируса смеси в скважину. Аккуратно встряхните планшет спереди назад, влево и вправо (2X: 36,4 мкл вируса смеси, 1X: 18,2 мкл и 0.5x: 9.1 мкл).
  6. Поместите клетки в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора и инкубировать в течение ночи.

3. Замена культуральной среды (День 3 & 5-й день)

  1. 24 часа после трансдукции, замените носитель с 500 мкл свежей среды фибробластов.
  2. На 5-й день, изменить Средний свежим фибробластов СМИ.

4. Подготовьте MEF Посуда для сотрудничества культуры (День 8)

  1. Подготовка MEF клеток в 60 мм чашки для культивирования с 10% FBS содержится среде ДМЕМ один DAу до пассажей Трансдуцированные фибробластов на MEF фидерных клеток.
    Примечание: Мы используем 5 х 10 5 из MEF в каждом 60 мм блюдо.

5. Первая Со-культуры трансдуцированных клеток с MEF фидерных клеток (День 9)

  1. Перед покрытием трансдуцированных клетки, аспирации 10% FBS содержится DMEM СМИ от MEF фидерных блюд и добавить свежий 10% FBS, содержащуюся DMEM среду.
  2. Удаление среды из трансдуцированных фибробластов, которые находятся в 24-луночный планшет и промыть клетки один раз D-PBS. Добавить 200 мкл 0,25% трипсина / EDTA в клетках фибробластов InThe 24-луночный планшет. После менее 5 мин инкубации с трипсином / EDTA, когда клетки начинают отделяться от пластины, собирают клетки с ростовой среды в 15 мл коническую трубку. Тогда отцентрифугированы в 6000 мкг в течение 4 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объединение 2X, 1X, и вирус 0.5x трансдуцировали фибробластов рекомендуется.
  3. Удалить супернатантной среды и мыть повторно приостановитьОсадок клеток с 4-5 мл свежего фибробластов среды для нейтрализации с трипсином. Тогда отцентрифугированы при 135 мкг в течение 4 мин.
  4. Пластина клеток как последовательный плотности разбавления и начинают сотрудничать культуры с фибробластов СМИ на MEF: такие, как 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 и 1/128 с 60 мм блюдо. В зависимости от уровня смертности клеток в течение первой недели трансдукции, не может потребоваться развести на 1/2 или 1/128 плотности. Поместите в сторону остальные ячейки для извлечения суммарной РНК в качестве положительного контроля для Transgene RT-PCR.
  5. Наведите 60 мм блюда в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора в течение ночи.

6. Поток человеческих эмбриональных стволовых клеток Средний и монитор клеток (день 10)

  1. На следующий день, изменить фибробластов СМИ для человеческого ES СМИ с 10 мкМ Y-27632. После этого изменить средний ежедневно с человеческим ES среды: 800 мл DMEM/F12 + 200 мл Нокаут заменитель сыворотки + 10 мл L-глютамина + 10 мл 10 мМ MEM минимальных несущественных аминокислот+ 1 мл 2-меркаптоэтанола + 10 нг / мл основного фактора роста фибробластов.
  2. У ежедневная смена СМИ со свежими человека СМИ ES. Через неделю, проверить посуду раз в 2 ~ 3 дней под микроскопом для формирования ES колониеобразующих как сгустки клеток. В зависимости от типа клеток, культуры займет больше или меньше времени перед колонии найдено.

7. Выбор индуцированных плюрипотентных стволовых клеток колоний и Развернуть клеток (день 20 ~)

  1. Через три недели после трансдукции, колонии должны появиться выросли должным образом для сбора.
  2. За день до сбора колонии, подготовить MEF подачи в 24-луночный планшет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем 12,5 х 10 5 из MEF в одном 24-луночный планшет.
  3. На следующий день, изменить среду MEF блюд из фибробластов СМИ для человеческого ES СМИ с 10 мкМ Y-27632. Вручную выбрать одну колонию в каждый момент времени под микроскопом в захватывающего капотом и сделать меньше сгустки с помощью пипетки и передавать ихна недавно подготовлен MEF dishes.Try подобрать несколько клонов.
  4. Прохождение и расширить каждую лунку с 24-луночный планшет для луночный планшет первоначально 6. Тогда из 6-луночный планшет до 60 мм блюд до дальнейшего размножения.

8. Характеристика человека ИПСК (после 10 пассажей)

  1. Иммунофлюоресценция
    1. Пластинчатые человека ИПСК в 24-луночный планшет и культуры в течение 4-5 дней с ежедневной сменой СМИ.
    2. Для запуска иммунофлуоресцентной, мыть тарелку с D-PBS один раз. Затем зафиксировать клетки немедленно в 0,4% параформальдегидом в течение 30 мин. После этого мыть три раза в D-PBS в течение 5 мин.
    3. Treat фиксированные клетки с 0,1% Тритон Х-100 в ЗФР ​​раствора в течение 15 мин при комнатной температуре.
    4. Аспирируйте permeablization раствор (0,1% Х-100 раствор тритона), затем добавляют 0,5%-ный раствор блокирующего BSA в течение 1 часа при комнатной температуре.
    5. Выполните обнаружение Nanog, Oct-4, SSEA (этап-эмбриональный antigен) и TRA-1-81 (опухоль отказ антиген) с использованием анти-человеческого антитела в 0,5%-ном растворе БСА (проверить материал таблицу для скорости разбавления антитела). Инкубировать первичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем промыть три раза в D-PBS в течение 5 минут каждый.
    6. Проверка с помощью флуоресцентной микроскопии после 1 часа инкубации с Alexa Fluor 488 козьего антитела против мышиных IgG антител в качестве 2-го антитела, которые разбавленного 1:2000 в 0,5%-ном растворе БСА при комнатной температуре. Пятно все ядра каждого MEF фидерных клеток и hiPSCs с DAPI.
  2. ОТ-ПЦР трансгенных Подтверждение
    1. Выписка общее мРНК из клеточного осадка с помощью экстракции РНК реагентов.
    2. Выполните обратную транскрипцию на аликвоты (1 мкг) общей РНК и полученную кДНК для ПЦР-амплификации с помощью обратной транскриптазы.
    3. Подготовка смеси ПЦР, содержат 2 мкл кДНК-матрицей, 10 мкл 2X PCR Master Mix, 2 мкл 2 пмоль праймеров(Вперед: 1 мкл и обратного: 1 мкл) и 6 мкл DW. Для обнаружения экспрессии гена, делают ОТ-ПЦР с праймерами, перечисленных в таблице 1.
    4. Выполните RT-МКП с геном GAPDH в качестве контроля для эффективности реакции амплификации. Визуализации и анализа ПЦР-продукта на 1% агарозном геле.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Обычно зараженные фибробласты не показывают морфологические изменения в несколько дней после вирус Сендай трансдукции, но через пять дней, они начинают иметь различные формы (рис. 1). Как описано в правой панели, показанной на фиг.1, клетки не имеют типичную морфологию фибробластов больше. Они имеют круглую форму и большую ядро, чем цитоплазме. Даже когда трансдукции выполняется в 80% сотовой слияния, похоже, они менее сливающийся в колодце после они начинают перепрогра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Перепрограммирование соматических клеток человека в hiPSCs проводит беспрецедентные обещания в фундаментальной биологии, личной медицине и трансплантации 12. Ранее человека поколений ИПСК требуется вирус ДНК, которая имеет интеграционный риск в геном хозяина, который может создать нежелательные генетические мутации, которые ограничивают дальнейшие клинические приложения, такие как лекарства разработки и трансплантации терапии 13. С этой причине, многие исследования были зарегистрированы для получен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Ли за ценные обсуждения по рукописи. Работа в лаборатории Ли была поддержана грантами от Robertson следователь премии Нью-Йорк Фонда стволовых клеток и из Мэриленда Исследования стволовых клеток фонд (TEDCO).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для перепрограммирования CytoTune-iPSInvitrogenA1378002
CF-6, MEFs, неомицин-резистентный, митомицин С обработанный Глобальный стволGSC-6105M5 x 105/6 см или 12,5 x 105/24-луночный планшет
Trypsin EDTA 0,25% Трипсин с EDTA 4Na 1XInvitrogen25200114
DMEM/F-12 mediumInvitrogen11330-032
24-луночный планшет для клеточных культур, плоскодонный с крышкойBD353935
Y-27632TOCRIS125410 μ M (Запас: 10 mM)
Основной фактор роста фибробластовLIFE TECHNOLOGIESPHG026310 нг (Запас: 100 мкг)
Нокаут-заменитель сывороткиGibco10828028
Dulbecco' s Модифицированная среда Eagle (D-MEM, DMEM) (1X), жидкая (с высоким содержанием глюкозы)Invitrogen11965118
фетальная бычья сывороткаThermo Scientific FermentasSH30071,03
L-глютамин-200 мМ (100X), жидкаяGIBCO25030-0811/100
MEM раствор заменимых аминокислот, 100XLIFE TECHNOLOGIES1/100
2-меркаптоэтанол (1,000X), жидкийGIBCO219850231/1,000
Хауссер фазово-контрастный гемацитометрHausser Scientific02-671-54
EmbryoMax 0,1% раствор желатинаMilliporeES-006-B
SSEA-4DSHBMC-813-701/200
анти-Tra-1-81Клеточная сигнализация4745S1/200
мышиное моноклональное антитело Oct4Santa CruzSC-52791/1,000
NanogR& DAF19971/1,000
Alexa Flouor 488 козий антимышиныйInvitrogen9484921/2,000
DPBS (Dulbecco' s фосфатно-солевой буфер), 1X без кальция и магнийCellgro21-031-CV
QuantiTect Набор для обратной транскрипцииQIAGEN205313
PCR Master Mix [2X]Thermo Scientific FermentasK0171
TrizolInvitrogen15596018
колпак для сбораNuAireNU-301
область препарирования НиконSMZ745
11140050

Ссылки

  1. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  2. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
  3. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
  4. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  5. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  6. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
  7. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  8. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  9. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  10. Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
  11. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
  12. Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
  13. Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
  15. Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
  16. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.