Методическая статья

Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса

DOI:

10.3791/51406

⸱

23 апреля 2014 г.

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем наш стандартный метод перепрограммирования соматических клеток человека в трансгенных без человека ИПСК с вирусом Сендай, который показывает последовательное исход и повышенную эффективность.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько лет назад, создание человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) открыла новую эпоху в биомедицине. Потенциальные области применения человеческих ИПСК включают моделирования патогенеза генетических заболеваний человека, аутогенной клеточной терапии после коррекции гена, и персональная проверка лекарств, предоставляя источник конкретного пациента и симптомов соответствующих клеток. Тем не менее, существует несколько препятствия для преодоления, такие как устранение оставшегося фактор перепрограммирования трансгена выражение после производства человека ИПСК. Что еще более важно, остаточная трансгенная экспрессия в недифференцированных человека ИПСК может помешать надлежащие дифференциации и дезинформировать интерпретацию болезни-соответствующей в фенотипов пробирке. С этой причине интеграция свободной и / или трансгенные свободного человека ИПСК были разработаны с использованием нескольких методов, таких как аденовирус, системы PiggyBac, minicircle вектор, эписомные векторы, прямой доставки белков и синтезированы мРНК. Тем не менее, эффективность reprogramming помощью интеграции без методов является довольно низким в большинстве случаев.

Здесь мы представляем метод, чтобы изолировать человека ИПСК с помощью Сендай-вирус (РНК вируса) на основе системы перепрограммирования. Этот метод перепрограммирования показывает стабильные результаты и высокую эффективность в экономически эффективным образом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) имеют мощность до самообновлению в пробирке и есть плюрипотентности, который может быть потенциально полезными для моделирования заболевания, для скрининга лекарственных средств, а также разработки клеточной терапии для лечения заболеваний и повреждения тканей. Тем не менее, ЭСК имеют ограничение для заместительной клеточной терапии из-за иммунологических, онкологических и этических барьеров, а также для изучения генов заболеваний, связанных, по конкретным болезням ЭСК могут быть выделены через предимплантационной генетической диагностики (ПГД) приближается, но он по-прежнему технически сложными и эмбрион пожертвования довольно редки. Эти вопросы связаны с прогрессом в биологии стволовых клеток, что привело к развитию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs).

Человека ИПСК генетически перепрограммировать от взрослых соматических клетках человека и гавань плюрипотентных клеток-подобные функции стволовых подобные ЭСК, что делает их полезным источником для регенеративной медицины, таких как гОткрытие ковер, моделирование болезней и клеточной терапии в пациент-специфической манере 1,2.

До сих пор, есть несколько методов для создания человека ИПСК, в том числе вирус-опосредованной (ретровируса и аденовируса) 3, не вирус опосредованной (система БАК и векторы трансфекции) 4 гена каскадов, и белок система доставки 5-7.

Хотя поставка вирус-опосредованной генов может обеспечить определенный уровень эффективности, вирусные векторы могут оставить генетический след, потому что они интегрироваться в хромосомы хозяина, чтобы выразить гены перепрограммирования неконтролируемым образом. Даже когда вирусный интеграция факторов транскрипции может активировать или инактивировать гены хост-8, это может вызвать неожиданное генетической аберрации и риск онкогенеза 5,9. С другой стороны, сообщалось прямое введение белков или РНК в соматических клетках, но имеют некоторые недостатки, такие как трудоемкий, при неоднократном TransfАЗДЕЛ, и низкий уровень перепрограммирования 7,10. Даже эписомными и не интеграции аденовирус, вирус адено-ассоциированный, и плазмидные векторы все еще ​​относительно менее эффективным 11. По этим причинам, то вполне вероятно, чтобы выбрать не-интеграционные методы перепрограммирования с высокой эффективностью генерации IPSC и меньше генетических аномалий. В этом исследовании, мы используем перепрограммирование Сэндай вирус основе. Этот метод, как известно, не-интегрированы в геном хозяина и последовательно производит человека ИПСК без трансгенных интеграции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка Cell и СМИ (день 1)

  1. Культура и расширить фибробластов человека с DMEM среде, содержащей 10% FBS.
  2. Пластинчатые фибробласты человека (рис. 1) на 24-луночный планшет при соответствующей плотности на лунку в день перед трансдукции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие серийные разведения рекомендуется (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K и 6.25K), потому что разные типы клеток имеют разные способности вложений.
  3. Инкубируйте клетки для еще одного дня в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора, обеспечивая клетки полностью придерживался и расширена.

2. Выполните трансдукция (День 2)

  1. В день трансдукции, проверьте плотность клеток и выбрал наиболее эффективные скважин плотности (рис. 2). Лучше выбрать три различных плотностей: высокая (80 ~ 90%), средний (50 ~ 70%) и низкий (20 ~ 40%).
  2. По крайней мере, 1 час до трансдукции, аспирации fibroblАСТ носители из клеток и изменение новых 300 мкл фибробластов среды.
  3. Удалить один набор 4-х различных вирусных Сендай труб от -80 ° C хранения. Оттепель каждую пробирку в то же время в водяной бане при 37 ° в течение нескольких секунд, а затем извлечь пробирки из водяной бане. После этого оттаивают их до комнатной температуры; центрифужные пробирки на 6000 мкг в течение 10 сек и разместить их на льду до использования. Не повторно при замораживании и оттаивании вирус, так как титры не будет поддерживать.
  4. Добавить указанные объемы каждой из четырех труб вирус Сендай (OCT-4, Klf-4, с-Myc и Sox-2) в микро-центрифужную пробирку. Убедитесь, что раствор хорошо перемешивают с помощью пипетки осторожно.
    Например, если 50K клеток / одна скважина из пластины lookwell 24-а для трансдукции:
    (Титр на основе сертификата анализа от Life Technologies, может отличаться от партии к партии)
    Труба hOct-4 = 6,0 х 10 7 CIU, 3 МВД = 5 мкл
    Труба hSox-2 = 6,5 х 10 7 CIU, 3 МВД = 4,6 μ; Л
    Труба hKlf-4 = 6,3 х 10 7 CIU, 3 МВД = 4,8 мкл
    Труба жк-Мус = 7,8 х 10 7 CIU, 3 МВД = 3,8 мкл
    Всего = 18.2 мкл четырех вирусных факторов смесь / один а (50K ячеек) 24-луночный планшет
  5. В зависимости от плотности клеток; добавить 2X, 1X, и 0.5x объем вируса смеси в скважину. Аккуратно встряхните планшет спереди назад, влево и вправо (2X: 36,4 мкл вируса смеси, 1X: 18,2 мкл и 0.5x: 9.1 мкл).
  6. Поместите клетки в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора и инкубировать в течение ночи.

3. Замена культуральной среды (День 3 & 5-й день)

  1. 24 часа после трансдукции, замените носитель с 500 мкл свежей среды фибробластов.
  2. На 5-й день, изменить Средний свежим фибробластов СМИ.

4. Подготовьте MEF Посуда для сотрудничества культуры (День 8)

  1. Подготовка MEF клеток в 60 мм чашки для культивирования с 10% FBS содержится среде ДМЕМ один DAу до пассажей Трансдуцированные фибробластов на MEF фидерных клеток.
    Примечание: Мы используем 5 х 10 5 из MEF в каждом 60 мм блюдо.

5. Первая Со-культуры трансдуцированных клеток с MEF фидерных клеток (День 9)

  1. Перед покрытием трансдуцированных клетки, аспирации 10% FBS содержится DMEM СМИ от MEF фидерных блюд и добавить свежий 10% FBS, содержащуюся DMEM среду.
  2. Удаление среды из трансдуцированных фибробластов, которые находятся в 24-луночный планшет и промыть клетки один раз D-PBS. Добавить 200 мкл 0,25% трипсина / EDTA в клетках фибробластов InThe 24-луночный планшет. После менее 5 мин инкубации с трипсином / EDTA, когда клетки начинают отделяться от пластины, собирают клетки с ростовой среды в 15 мл коническую трубку. Тогда отцентрифугированы в 6000 мкг в течение 4 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объединение 2X, 1X, и вирус 0.5x трансдуцировали фибробластов рекомендуется.
  3. Удалить супернатантной среды и мыть повторно приостановитьОсадок клеток с 4-5 мл свежего фибробластов среды для нейтрализации с трипсином. Тогда отцентрифугированы при 135 мкг в течение 4 мин.
  4. Пластина клеток как последовательный плотности разбавления и начинают сотрудничать культуры с фибробластов СМИ на MEF: такие, как 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 и 1/128 с 60 мм блюдо. В зависимости от уровня смертности клеток в течение первой недели трансдукции, не может потребоваться развести на 1/2 или 1/128 плотности. Поместите в сторону остальные ячейки для извлечения суммарной РНК в качестве положительного контроля для Transgene RT-PCR.
  5. Наведите 60 мм блюда в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора в течение ночи.

6. Поток человеческих эмбриональных стволовых клеток Средний и монитор клеток (день 10)

  1. На следующий день, изменить фибробластов СМИ для человеческого ES СМИ с 10 мкМ Y-27632. После этого изменить средний ежедневно с человеческим ES среды: 800 мл DMEM/F12 + 200 мл Нокаут заменитель сыворотки + 10 мл L-глютамина + 10 мл 10 мМ MEM минимальных несущественных аминокислот+ 1 мл 2-меркаптоэтанола + 10 нг / мл основного фактора роста фибробластов.
  2. У ежедневная смена СМИ со свежими человека СМИ ES. Через неделю, проверить посуду раз в 2 ~ 3 дней под микроскопом для формирования ES колониеобразующих как сгустки клеток. В зависимости от типа клеток, культуры займет больше или меньше времени перед колонии найдено.

7. Выбор индуцированных плюрипотентных стволовых клеток колоний и Развернуть клеток (день 20 ~)

  1. Через три недели после трансдукции, колонии должны появиться выросли должным образом для сбора.
  2. За день до сбора колонии, подготовить MEF подачи в 24-луночный планшет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем 12,5 х 10 5 из MEF в одном 24-луночный планшет.
  3. На следующий день, изменить среду MEF блюд из фибробластов СМИ для человеческого ES СМИ с 10 мкМ Y-27632. Вручную выбрать одну колонию в каждый момент времени под микроскопом в захватывающего капотом и сделать меньше сгустки с помощью пипетки и передавать ихна недавно подготовлен MEF dishes.Try подобрать несколько клонов.
  4. Прохождение и расширить каждую лунку с 24-луночный планшет для луночный планшет первоначально 6. Тогда из 6-луночный планшет до 60 мм блюд до дальнейшего размножения.

8. Характеристика человека ИПСК (после 10 пассажей)

  1. Иммунофлюоресценция
    1. Пластинчатые человека ИПСК в 24-луночный планшет и культуры в течение 4-5 дней с ежедневной сменой СМИ.
    2. Для запуска иммунофлуоресцентной, мыть тарелку с D-PBS один раз. Затем зафиксировать клетки немедленно в 0,4% параформальдегидом в течение 30 мин. После этого мыть три раза в D-PBS в течение 5 мин.
    3. Treat фиксированные клетки с 0,1% Тритон Х-100 в ЗФР ​​раствора в течение 15 мин при комнатной температуре.
    4. Аспирируйте permeablization раствор (0,1% Х-100 раствор тритона), затем добавляют 0,5%-ный раствор блокирующего BSA в течение 1 часа при комнатной температуре.
    5. Выполните обнаружение Nanog, Oct-4, SSEA (этап-эмбриональный antigен) и TRA-1-81 (опухоль отказ антиген) с использованием анти-человеческого антитела в 0,5%-ном растворе БСА (проверить материал таблицу для скорости разбавления антитела). Инкубировать первичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем промыть три раза в D-PBS в течение 5 минут каждый.
    6. Проверка с помощью флуоресцентной микроскопии после 1 часа инкубации с Alexa Fluor 488 козьего антитела против мышиных IgG антител в качестве 2-го антитела, которые разбавленного 1:2000 в 0,5%-ном растворе БСА при комнатной температуре. Пятно все ядра каждого MEF фидерных клеток и hiPSCs с DAPI.
  2. ОТ-ПЦР трансгенных Подтверждение
    1. Выписка общее мРНК из клеточного осадка с помощью экстракции РНК реагентов.
    2. Выполните обратную транскрипцию на аликвоты (1 мкг) общей РНК и полученную кДНК для ПЦР-амплификации с помощью обратной транскриптазы.
    3. Подготовка смеси ПЦР, содержат 2 мкл кДНК-матрицей, 10 мкл 2X PCR Master Mix, 2 мкл 2 пмоль праймеров(Вперед: 1 мкл и обратного: 1 мкл) и 6 мкл DW. Для обнаружения экспрессии гена, делают ОТ-ПЦР с праймерами, перечисленных в таблице 1.
    4. Выполните RT-МКП с геном GAPDH в качестве контроля для эффективности реакции амплификации. Визуализации и анализа ПЦР-продукта на 1% агарозном геле.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обычно зараженные фибробласты не показывают морфологические изменения в несколько дней после вирус Сендай трансдукции, но через пять дней, они начинают иметь различные формы (рис. 1). Как описано в правой панели, показанной на фиг.1, клетки не имеют типичную морфологию фибробластов больше. Они имеют круглую форму и большую ядро, чем цитоплазме. Даже когда трансдукции выполняется в 80% сотовой слияния, похоже, они менее сливающийся в колодце после они начинают перепрогра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перепрограммирование соматических клеток человека в hiPSCs проводит беспрецедентные обещания в фундаментальной биологии, личной медицине и трансплантации 12. Ранее человека поколений ИПСК требуется вирус ДНК, которая имеет интеграционный риск в геном хозяина, который может создать нежелательные генетические мутации, которые ограничивают дальнейшие клинические приложения, такие как лекарства разработки и трансплантации терапии 13. С этой причине, многие исследования были зарегистрированы для получен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Ли за ценные обсуждения по рукописи. Работа в лаборатории Ли была поддержана грантами от Robertson следователь премии Нью-Йорк Фонда стволовых клеток и из Мэриленда Исследования стволовых клеток фонд (TEDCO).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для перепрограммирования CytoTune-iPSInvitrogenA1378002
CF-6, MEFs, неомицин-резистентный, митомицин С обработанный Глобальный стволGSC-6105M5 x 105/6 см или 12,5 x 105/24-луночный планшет
Trypsin EDTA 0,25% Трипсин с EDTA 4Na 1XInvitrogen25200114
DMEM/F-12 mediumInvitrogen11330-032
24-луночный планшет для клеточных культур, плоскодонный с крышкойBD353935
Y-27632TOCRIS125410 μ M (Запас: 10 mM)
Основной фактор роста фибробластовLIFE TECHNOLOGIESPHG026310 нг (Запас: 100 мкг)
Нокаут-заменитель сывороткиGibco10828028
Dulbecco' s Модифицированная среда Eagle (D-MEM, DMEM) (1X), жидкая (с высоким содержанием глюкозы)Invitrogen11965118
фетальная бычья сывороткаThermo Scientific FermentasSH30071,03
L-глютамин-200 мМ (100X), жидкаяGIBCO25030-0811/100
MEM раствор заменимых аминокислот, 100XLIFE TECHNOLOGIES1/100
2-меркаптоэтанол (1,000X), жидкийGIBCO219850231/1,000
Хауссер фазово-контрастный гемацитометрHausser Scientific02-671-54
EmbryoMax 0,1% раствор желатинаMilliporeES-006-B
SSEA-4DSHBMC-813-701/200
анти-Tra-1-81Клеточная сигнализация4745S1/200
мышиное моноклональное антитело Oct4Santa CruzSC-52791/1,000
NanogR& DAF19971/1,000
Alexa Flouor 488 козий антимышиныйInvitrogen9484921/2,000
DPBS (Dulbecco' s фосфатно-солевой буфер), 1X без кальция и магнийCellgro21-031-CV
QuantiTect Набор для обратной транскрипцииQIAGEN205313
PCR Master Mix [2X]Thermo Scientific FermentasK0171
TrizolInvitrogen15596018
колпак для сбораNuAireNU-301
область препарирования НиконSMZ745
11140050

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  2. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
  3. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
  4. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  5. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  6. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
  7. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  8. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  9. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  10. Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
  11. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
  12. Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
  13. Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
  15. Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
  16. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Human iPSCsSendai VirusReprogramming EfficiencySomatic CellsFibroblast TransductionMouse Embryonic FibroblastImmuno LabelingRT PCR AnalysisStem Cell MarkersColony Expansion

Похожие статьи