Методическая статья

Мониторинг Активация противовирусной Распознавание Рецепторы RIG-I И PKR По ограниченной протеазы Пищеварение и Native СТРАНИЦЕ

11.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51415

⸱

29 июля 2014 г.

 , 
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

В этой статье

Краткое содержание

Врожденные защиты в вирусных инфекций вызываются распознающих рецепторов (РРСС). Два цитоплазматические РРСС RIG-I и PKR связываются с вирусными подписи РНК, изменение конформации, олигомеризоваться и активируйте антивирусную сигнализацию. Описаны методы, которые позволяют легко контролировать конформационное переключение и олигомеризации этих цитоплазматических PRRS.

Аннотация

Защитные силы организма вирусной инфекции зависят от быстрого обнаружения по распознающих рецепторов (РРСС) врожденной иммунной системы. В цитоплазме, что РРСС RIG-I и PKR связываются со специфическими вирусными РНК лигандов. Этот первый посредником конформационную коммутации и олигомеризации, а затем позволяет активацию противовирусного ответа интерферона. В то время как методы измерения противовирусной экспрессию генов хозяина, хорошо известны, методы непосредственно отслеживающие активации состояния RIG-I и PKR лишь частично и не прижилось.

Здесь мы описываем два метода для мониторинга RIG-I и PKR стимуляции при инфицировании установленном индуктор интерферона, вирус лихорадки долины Рифт мутант клона 13 (Cl 13). Общество с ограниченной трипсин-переваривание позволяет анализировать изменения в чувствительности протеазы, указывая конформационные изменения в PRRS. Трипсин переваривание лизатов макет инфицированных клеток приводит к быстрой деградации RIG-I и PKR, где ас Cl 13 инфекция приводит к появлению протеазы устойчивостью RIG-I фрагмента. Также PKR показывает вирус-индуцированной частичное сопротивление трипсина пищеварения, который совпадает с Его отличительной чертой фосфорилирования в Thr 446. Формирование RIG-I и PKR олигомеры была подтверждена с помощью электрофореза родной полиакриламидном геле (PAGE). При заражении существует сильная накопление RIG-I и PKR олигомерных комплексов, в то время как эти белки оставались в качестве мономеров в ложном зараженных образцов.

Общество с ограниченной протеазы пищеварение и родной СТР, как в сочетании с Вестерн-блоттинга, позволяют чувствительный и прямое измерение двух различных ступенях RIG-I и PKR активации. Эти методы могут быть сравнительно легко и быстро выполнять и не требует дорогостоящего оборудования.

Введение

Важнейшим событием в противовирусной защиты организма является быстрое обнаружение возбудителя на так называемых распознающих рецепторов (РРСС) 1,2. Внутриклеточный обнаружение вируса РНК-инфекции зависит от двух цитоплазматической РНК геликаз, RIG-I (ретиноевой кислоты индуцируемый ген I) и MDA5 (дифференциация меланома ассоциированный белок 5) 3-5. RIG-I состоит из двух N-концевых доменов набора каспазы (карты), центрального типа Dech ящик РНК геликазы области, и С-концевого домена (CTD) 4,6. В то время как КТР и геликазного домена необходимы для признания неавтомодельных (вирусных) РНК, карты посредником нижестоящую передачу сигналов, ведущих к созданию противовирусного статуса хозяина.

Если RIG-I находится в состояние молчания, то есть в отсутствие конкретного РНК лиганда, вторая карта взаимодействует с центральной области геликазы и держит RIG-I в автомобильной ингибирования конформации 7-11. RIG-I связывается с коротким дваждынить (DS) РНК, несущий 5'-трифосфат (5'PPP), длинные дцРНК, и полиУ / UC-богатую РНК, классические подписи структур, которые присутствуют на геномах многих РНК-содержащих вирусов 12-16. Два основных характеристики активации RIG-I являются переход к закрытой конформации 6,17 и гомо-олигомеризации 6,18,19. Конформационное переключатель усиливает связывание РНК, предоставляет карты для передачи сигнала, и воссоздает активное АТФазную сайт 8,9,11,20. Формирование олигомерных комплексов RIG-I приводит к увеличению набора последующих молекул адаптера сигнализации, чтобы сформировать платформу для противовирусной передачи сигнала 11. RIG-I-регулируется цепи сигнализации в конечном счете активирует фактор транскрипции IRF-3 для повышающей регуляции интерферона (IFN-alpha/beta) генов и, следовательно, экспрессии генов интерферона стимулируется генов (ISGs) для полного противовирусного ответа 21,22 . Один из лучше всего характеризует ISGs является РНК-активированный Протейн киназы (PKR) 23. PKR принадлежит к семейству эукариотической инициации трансляции фактор 2 альфа (eIF2α) киназ и состоит из N-концевого двухцепочечной РНК-связывающего домена и С-концевого домена киназы. Киназный домен представляет собой интерфейс димеризации решающее значение для PKR активации и осуществляет каталитические функции белка. Связывание PKR вирусной дсРНК приводит к ее изменение конформации разрешений димеризацию и авто-фосфорилирования в Thr 446 среди других остатков. PKR затем согласует фосфорилирования eIF2α, тем самым блокируя перевод вирусной мРНК 23-27.

Оба RIG-I и PKR претерпит серьезных структурных перестроек, образуют олигомерные комплексы и посттрансляционно изменены фосфорилирования / дефосфорилирования и убиквитинирования 10,11,19,23,24,26-29. Для лучшего понимания которых вирусные РНК структуры активации RIG-I и PKR (и на какой стадии вирусные антагонисты могли Bе вмешательства), важно, чтобы точно определить состояние активации. Для обоих РРСС было ранее описано, что активация приводит к появлению трипсиноподобных устойчивы фрагментов белков 6,17,30 и более высокого порядка олигомеров 6,18,19. Однако, учитывая богатство литературы об этих ключевых факторов противовирусного ответа хозяина 1,2,24, применение прямых методов кажется сравнительно редко. В надежде стимулирования более широкого использования, мы предоставляем удобные и чувствительные протоколы решительно анализирующих активации состояния RIG-I и PKR. ИФН компетентным А549 линия клеток человека заражен с установленным активатором RIG-I и PKR, в ослабленный вирус лихорадки долины Рифт мутантного клона 13 (Cl 13) 31,32. После простой процедуры лизирующего, экстракты из инфицированных клеток испытаны ограниченной трипсин-переваривание / Вестерн-блот анализ, чтобы оценить конформационное переключение, и синим электрофореза в полиакриламидном геле с нативной (PAGE) / Western блот Analysзаключается в измерении образование олигомеров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Посев А549 для инфекции

  1. Культивируйте T75 колбу клетках А549 при 37 ° С и 5% СО 2 в среде культуры клеток (DMEM с добавлением 10% FCS, 526,6 мг / л L-глутамина, 50,000 ед / л пенициллина и 50 мг / л стрептомицина).
  2. Перед началом сбора клеток, разогреть среду клеточной культуры, PBS и 0,05% трипсин-ЭДТА в водяной бане, нагретой до 37 ° С.
  3. Снимите среды и промыть клетки с 10 мл PBS. Снимите PBS снова.
  4. Добавить 3 мл трипсин-ЭДТА и распространять в равной степени в колбе. Перенесите колбу в инкубаторе с 37 ° С и 5% СО 2.
  5. Когда все клетки отделяют, добавляют 7 мл среды культуры клеток, ресуспендирования клеток, и передачи клеточной суспензии в 15 мл сокола трубки.
  6. Центрифуга клетки при 800 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл свежей среды культуры клеток.
  7. Граф клеток с счетной камере.
  8. Добавить 2,5 х 10 6 клеток в 5 мл среды культуры клеток в двух флаконах T25 каждый. Инкубировать в течение 16 часов при 37 ° С и 5% СО 2. Один флакон служит для макета управления и один для Cl 13 инфекции.

2. Заражение Лихорадка Рифт-Валли Вирус Clone 13 (Cl 13)

  1. ПРИМЕЧАНИЕ: Cl 13 ослабленный вирус мутант, который в Германии могут быть обработаны в соответствии с BSL-2 условий. Пожалуйста, обратитесь к соответствующим национальным рекомендациям. Другие типичные индукторов ИФН будет вирус Сендай (штамм Кантелл) или вирус болезни Ньюкасла.
  2. Предварительно теплой PBS, содержащей сыворотки среде, и клеточная культуральная среда, содержащей 5% FCS.
  3. Подготовить 1,25 х 10 7 PFU / мл Cl 13 в среде без сыворотки, чтобы заразить 2,5 х 10 6 клеток А549 с множественностью заражения (МВД) 5. Подготовьте несколько (примерно 10%) большее количество, чем необходимо для учета ошибки пипеток.
  4. Промывают клетки с PBS, как описано в 1.3.
  5. Добавьте 1 мл разведения Cl 13 илибессывороточной среде (контроль неинфицированных, макет) к клеткам и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С и 5% CO 2. Перемещение колбу тщательно каждые 15 мин, чтобы обеспечить равномерное распределение Cl 13 разбавления и сыворотки среде, соответственно.
  6. Через 1 ч инфекции, удалить инокулята, добавляют 5 мл подогретого клеточной культуральной среде с 5% FCS, и инкубировали в течение 5 ч при 37 ° С и 5% CO 2.

3. Подготовка клеточных лизатов

  1. Подготовка PBS / 0,5% Triton X-100 при 4 ° С. Не добавляйте ингибиторы серин-протеазы.
  2. Промывают клетки с холодным PBS и добавляют 10 мл свежей PBS.
  3. Собрать клетки с, передачи клеточной суспензии в трубки сокола, и центрифуге при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 30 мкл PBS / 0,5% Triton X-100. Передача лизата в свежую 1,5 мл пробирку и инкубируют в течение по крайней мере 10 мин при 4 ° С.
  5. Центрифуга лизата в 10.000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и передавать осветленной лизата клеток (надосадочную) в свежую пробирку.
  6. Определить концентрацию белка по Бредфорда, как описано в другом месте 33.
  7. Хранить при -20 ° С или перейти к трипсина пищеварения (4.1) или родной СТР (5.1).

4. Определение конформационные изменения распознаванию рецепторов

  1. ТРСК-трипсин Лечение клеточных лизатов
    1. Развести L-1-tosylamido-2-фенилэтил хлорметилкетона обработке (ТРСК) трипсин в PBS до конечной рабочей концентрации 2 мкг / мкл.
    2. Регулировка в двух новых труб конечной концентрации белка 25 мкг каждого белкового лизата (макет или Cl 13) в конечном объеме 9 мкл ЗФР. Следовательно, она должна быть в четыре пробирки с 25 мкг лизата каждой, два раза макет и два раза Cl 13 инфекции. Один установлен как входного контроля (необработанной) и один набор для лечения ТРСК-трипсина.
    3. Добавить 1 мкл PBS (без лечения)или 1 мкл 2 мкг / мкл ТРСК-трипсином (конечная концентрация: 0,2 мкг / мкл) к клеточных лизатов и смешивать реакции с помощью пипетки. НЕ замораживать и оттаивать ТРСК-трипсин аликвоты, потому что это поставит под угрозу эффективность пищеварения.
    4. Инкубируйте лизатов при 37 ° С в течение 25 мин. Остановить реакцию, добавив 5x денатурации образца буфера (250 мМ Трис-HCl рН 6,8, 10% SDS, 50% глицерина, 25% β-меркаптоэтанол, 0,5% бромфенолового синего) и кип чением в течение 5 мин при 95 ° С. Это важно, чтобы не продлить время трипсин инкубации. В случае, если нет протеазы устойчивостью фрагменты не могут быть обнаружены, время трипсина пищеварения должен быть сокращен.
    5. После кипячения образцы можно хранить при -20 ° С.
  2. SDS полиакриламидном геле (PAGE) и вестерн-блоттинга
    1. Загрузка образцов на додецилсульфата натрия (SDS) полиакриламидном геле, содержащем 5% укладку над 12% разрешающей геле. не Отделите белки при 25 мА на гель, покабромфенолового синего иссякнут.
    2. Активировать поливинилиденфторид (PVDF) мембрану в течение 30 сек с метанолом и поместить его в буфере для переноса (48 мМ Трис, 39 мМ глицина, 1,3 мМ SDS, 20% метанол).
    3. Подготовьте блоттинга с полусухого системы промокательной и позволяют передавать белков на 10 В в течение 1 часа. Возьмите мембрану из ополосните кратко водой, и дайте ему высохнуть.
    4. Повторная активация мембрану кратковременным передачи в метанол. Вымойте в течение 5 мин с TBS. Блок 10% обезжиренным молоком в TBS в течение 1 ч при комнатной температуре или при 4 ° CO / N. Вымойте мембраны 3 раза в течение 5 мин каждого с TBS.
    5. Подготовка разбавления антител, как рекомендовано в таблице 1 и инкубировать мембрану в течение 1 часа при комнатной температуре или при 4 ° CO / N.
    6. Промыть 3 раза мембраны в течение 10 мин с каждой TBS-T. Добавить соответствующий вторичного антитела в сочетании с пероксидазой хрена в разведении 1:20000 в 1% обезжиренным молоком в TBS. Инкубировать 45 мин при комнатной температуре.
    7. Вымойте мембраны 3 раза в течение 10 мин каждого с TBS-T, и опе дополнительное время с TBS.
    8. Для обнаружения сигнала использования коммерческого набора хемилюминесценции и цифровой системы визуализации гель.
  3. Кумасси бриллиантовый синий G-250 Окрашивание
    1. Выполните SDS-PAGE, как описано в п. 4.2.1. Образцы нагрузка на полиакриламидном геле SDS и запустить гель при 25 мА на гель, пока бромфенолового синего не иссякнут.
    2. Выполните Кумасси Бриллиантовый окрашивание Синий G-250 при комнатной температуре. Все ли инкубации при постоянном встряхивании.
    3. Передача гель для фиксации раствором, содержащим 40% метанола и 10% уксусной кислоты в течение 30 мин.
    4. Заменить буфер обесцвечивани раствора (25% этанола и 8% уксусной кислоты) и инкубируют в течение 5 мин.
    5. Пятно гель с 0,2% кумасси голубой Brillant G-250 в 40% метанола и 10% уксусной кислоты в течение 1 часа.
    6. Destain гель с обесцвечивани раствора и обмена буфера через 10 мин, 30 мин, и 60 мин.
    7. Хранить гель в 25%-ном этаноле, 8% уксусной кислоты и 4% глицерина при 4 ° С.
    8. Выполните визуализацию и анализ, как описано в 4.2.8.

5. Анализ олигомерных Штатов распознаванию рецепторов

  1. Родной СТРАНИЦА
    1. Подготовка 50 мкг клеточного лизата в конечном объеме 10 мкл с PBS и добавляют 5 × родной буфер выборки (250 мМ Трис-HCl рН 6,8, 1% дезоксихолат натрия, 50% глицерина, 0,5% бромфенолового синего) до конечной концентрации 1x.
    2. Загрузите образцы НЕМЕДЛЕННО на родном полиакриламидном геле с 5% в качестве укладки и 8% в качестве решения гель. Любая задержка приведет к потере родных комплексов 34.
    3. Запуск гель при 20 мА на гель при 4 ° С с 50 мМ трис-NaOH рН 9,0, 384 мМ глицин как в качестве анода и 50 мМ Трис, рН 8,3, 384 мМ глицина, 1% дезоксихолата натри в качестве катода буфера. После 1,5-2 часов (бромфенолового синяя полоса покинул гель примерно 45 мин раньше) электрофорез закончена.
  2. Вестерн блот
    1. Активировать polyvinylidene (ПВДФ) мембрану в течение 30 сек с метанолом и поместить его в Towbin буфера (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 0,1% SDS, 20% метанол).
    2. Соберите мокрый пятно камеру в соответствии с инструкциями изготовителя и заполнить бак с Towin буфера.
    3. Выполните блоттинга с 250 мА в течение 1,5 ч при 4 ° С.
    4. Когда промокательной закончена действуйте, как описано в п. 4.2.3 на.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Признание вирусной агониста по RIG-I или PKR вызывает конформационные переключение 6,17,30 и олигомеризацию 6,18,27. Мы анализировали эти два маркера активации ограниченным пищеварения протеазы и электрофореза родной полиакриламидном геле (PAGE), соответственно.

Клетки человека А549 были инфицированы вирусом лихорадки долины Рифт клона 13 (Cl 13), который характеризуется мутацией антагониста IFN АПЛ 35,36. В связи с отсутствием функциональной НЗ, клон 13 силь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Почувствовав присутствие вирусов и активацию противовирусного IFN типа I системы имеют решающее значение для успешных врожденных иммунных реакций 22. Обнаружение Вирус тем самым опосредовано рецепторами распознавания патогена (РРСС), как RIG-I и PKR, что позволяет в кратчайшие сроки и активацию противовирусных защитных механизмов. Здесь мы описываем два метода, чтобы непосредственно оценить состояние активации RIG-I и PKR.

Общество с ограниченной протеазы пищеварения в качестве ин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарим Алехандро Brun от CISA-INIA для обеспечения защиты от лихорадки Рифт-Валли Вирус сывороток. Работа в нашей лаборатории поддерживается Forschungsförderung камень. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Университетская Гиссен унд Марбург, Лейбниц Высшая школа для развивающихся вирусных заболеваний (Эйдис), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, и DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Cell culture
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s medium (DMEM)Gibco21969-035
OptiMEMGibco31985-47
L-глутаминPAA25030-024
Пенициллин-стрептомицинPAA15070-063
Фетальная сыворотка теленка (FCS)PAA10270
0,05% Трипсин-ЭДТАGibco25300-054
Chemicals
>L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethylketone-handled (TPCK) трипсинSigma AldrichT1426
Antibodies
Mouse моноклональное антитело против RIG-I (ALME-1)Enzo Life SciencesALX-804-849-C100WB: 1:500 в 1% обезжиренном молоке у мыши TBS
моноклональный анти-PKR (B10)Santa Cruzsc-6282WB: 1:500 в 1% обезжиренном молоке в TBS
Кролик моноклональный анти-P-PKR (Thr446)Epitomics1120-1WB: 1:1,000 в 5% BSA в TBS
Кролик поликлональный анти-IRF-3Santa Cruzsc-9082WB: 1:500 в 1% обезжиренном молоке в TBS
Кролик моноклональный анти-P-IRF-3 (Ser386)IBLog-413WB: 1:100 в 1% обезжиренном молоке в TBS
Гипериммунная сыворотка против ЛРВ кролика "C2" (MP-12)Любезно предоставлено Алехандро Бруном CISA-INIAWB: 1:2,000 в 1% обезжиренном молоке в
TBS Мышиный моноклональный анти-бета-актин (8H10D10)Клеточная сигнализация3700WB: 1:1,000 в 1% обезжиренном молоке в TBS
Поликлональная пероксидаза-конъюгированная козья анти-кроличьяThermo Fisher0031460 1892914WB: 1:20,000 в 1% обезжиренном молоке в TBS
Поликлональная пероксидаза-конъюгированная козья антимышьThermo Fisher0031430 1892913WB: 1:20 000 в 1% обезжиренном молоке в TBS

Ссылки

  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032(2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287(2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RIG IPKR

Похожие статьи