Формирование биомембрана Microarrays с Ракель основе метода Ассамблеи

Summary

Поддерживаемые липидных бислоев и природные частицы мембран являются удобными системы, которые можно аппроксимировать свойства клеточных мембран и быть включены в различных аналитических стратегий. Здесь мы показываем, способ получения микрочипов, состоящие из поддерживаемых липидных двухслойных покрытием SiO ₂ бусины, фосфолипидов пузырьков или природных частицы оболочки.

Abstract

Липидного бислоя мембраны образуют плазменные мембраны клеток и определить границы субклеточных органелл. В природе эти мембраны гетерогенные смеси многих видов липидов, содержат мембраной белков и оформлены с углеводами. В некоторых экспериментах, желательно, чтобы отделить биофизических или биохимические свойства липидный бислой от тех природного мембраны. Такие случаи требуют использования модельных систем, таких как гигантские пузырьки, липосомы или поддерживаемых липидного бислоя (SLBS). Массивы SLBS особенно привлекательны для зондирования и подражая межклеточные взаимодействия. Здесь мы опишем новый способ формирования массивов SLB. Субмикронного диаметра SiO ₂ гранулы сначала покрывают липидных бислоев с образованием сферических SLBS (SSLBs). Затем гранулы хранение в массив микролунок субмикронного диаметра микро-сфабрикованы. Методика подготовки использует "швабру" для очистки поверхности подложки, в то время оставляешьг за SSLBs, которые поселились в лунки. Этот метод не требует химической модификации микропланшетным субстрата, ни особых таргетинга лигандов на SSLB. Микролунки занимают отдельных шариков, поскольку диаметр хорошо настроен, чтобы быть просто больше, чем диаметр шарика. Как правило, более 75% скважин заняты, а остальные остаются пустыми. В буфере массивы SSLB отображения долгосрочную стабильность больше, чем за одну неделю. Несколько типов SSLBs могут быть размещены в одном массиве по последовательным осаждением, и массивы могут быть использованы для зондирования, который мы показали, характеризуя взаимодействие холерного токсина с ганглиозидов GM1. Показано также, что фосфолипидов пузырьки без бортов опор и биомембран от клеточных источников может быть облечена с тем же методом и клеточно-специфические липиды мембран могут быть идентифицированы.

Introduction

Липидов двухслойные мембраны являются важными структуры в природе. Сотовый плазменные мембраны и органелл мембраны состоят из липидного бислоя, которые включают ряд молекул, которые необходимы для жизни. Многие процессы поддержания жизни происходить на поверхности клеток или опосредованы молекул, ассоциированных с липид-двухслойных мембран. В самом деле, многие фармацевтические препараты целевые процессы или молекулы находятся на или в мембранах ^1,2. Поэтому необходимо, чтобы аналитически исследовать процессы, такие, как химические реакции или нековалентными обязательных событий, которые происходят на поверхности мембраны. Потому что природные мембраны может быть трудно изолировать и / или интерфейс с датчиками, многие исследователи используют упрощенные модели мембраны проводить аналитические исследования. Ряд модельных мембранных систем описаны в литературе, начиная от гигантских везикул, которые могут быть от десятков до сотен микрон в диаметре до липосом с наноразмерными размеры ^3,4. Alternнительно, плоский бислоев, нанесенные на твердых подложках, то есть поддерживается бислоев (SLBS), может быть сформирован на нескольких различных поверхностей и были широко использованы в биофизических, биохимических и аналитических приложений ^5. Соединительная SLBS с электрическими или оптическими материалов позволяет исследовать мембранной биохимии и биофизики с использованием различных аналитических методик. Флуоресцентная микроскопия ^6, электрохимии ^7, оптическая спектроскопия ^8, сканирующей зондовой микроскопии ^9, поверхностного плазмонного резонанса ^10, и масс-спектрометрии ¹¹ все были использованы для изучения структуры и свойств SLBS.

Массивы SLB обеспечивают дополнительную гибкость при проектировании датчиков для мультиплексов анализов ^12,13. Другие приложения используют массивы SLB, чтобы имитировать переход, который формирует между иммунными клетками ^14. Методы обработки для массивов SLB менялись от microfluIDic подходы ¹⁵ тем, которые используют физические барьеры между соседними пятнами SLB. ¹⁶ Другие группы использовали методы печати ^17, фотохимический рисунка ¹⁸ и различные наноинженерии приближается ¹⁹ для создания массивов SLB.

В данной работе и сопровождающей видео мы продемонстрируем способ формирования массивов SLB путем сдачи на хранение SLB-покрытием SiO ₂ шарики в упорядоченных массивов лунок ^20. Мы ссылаемся на SLB-покрытых SiO ₂ шариков в виде сферических поддерживаемых липидного бислоя (SSLBs). Этот метод является расширением предыдущей работы, который создал массивы фосфолипидных везикул и биомембран, полученных из природных источников ^21, из которого мы также показывают примеры результатов. Другие способы выстроив частицы биомембрана или везикулы полагались на моделях конкретных, ориентированных на лигандов на поверхности, которые связывают с дополнительными лигандами, содержащихся на поверхности пузырьков. Примеры включают биотин-авидин ассоциация ^22,23 и гибридизации ДНК схемы ^24. Наш подход требует только массив микролуночные без каких-либо таргетинга или распознавания фрагментов, необходимых. Размер SSLBs определяется диаметром SiO ₂ бортовых опор, которые имеют низкую поли-дисперсность. Настраивая диаметр микролуночные просто больше, чем диаметр SSLB, только один SSLB оседает в каждую микролунку. Поли (диметилсилоксан) (PDMS) скребок затем удаляет с поверхности все SSLBs, которые не иммобилизованных в лунках. Микролунки и полученные массивы SSLB имеют высокую плотность (~ 10 ⁵ SSLBs / мм ²⁾ с 3 мкм от центра до центра расстояние и гексагональной периодичности. По серийно нанесения SSLBs с различными составами липидов, можно создать многокомпонентных массивов с случайно расположенных SSLBs. Чтобы продемонстрировать зондирования возможности массивов SSLB, мы использовали взаимодействие холерного токсина (CTX) с ганглиозида (GM1) включенного в SSLBs. Сприродные частицы мембран, мы смогли обнаружить клеточные специфические липиды в многокомпонентных массивов, содержащих мембранный материал из двух различных типов клеток.

Protocol

1. Микротехнологий из Microwell подложки матрицы

1. Начните с 4 дюйма кремниевой пластины с 100 нм термически выращенного оксида.
2. Спин SPR-955 0,7 фоторезиста на пластине при 4000 оборотах в минуту в течение 30 сек.
3. Выпекать на электрической плитке при 115 ° С в течение 90 сек.
4. Expose фоторезиста.
   1. Используйте маску, которая будет создавать 1 мкм отверстия, расположенные в гексагональной решетки с периодом 3 мкм, где массив охватывает 2 мм х 2 мм площадь.
   2. Expose пластины в я-линии степпер, используя размер шага 6 мм и экспозиции 200 мДж / см ^2.
5. Выпекать на электрической плитке при 115 ° С в течение 90 сек.
6. Разработка с использованием спиновой проявитель для нанесения 2 лужи CD-26 на пластине в течение всего времени развития 90 сек.
7. Тщательно промойте сверхчистой дистиллированной воды и сухой с N _2.
8. Протравите оксид в реактивно-ионного гравер в течение 6 мин с 50 кубических сантиметров в минуту аргона, 25 кубических сантиметров в минуту из CF ₄ и 50 кубических сантиметров в минуту швейцарских франков ₃ флокрыло при давлении 75 мТорр.
9. Протравите кремний в ПМС глубокой траншеи реактивный-ионной офортист в течение 2 мин с 63 SCCM С ₄ F _8, 27 SCCM в SF _6, 40 SCCM аргона и 10 станд из O _2, протекающий при давлении 14 мТорр.
10. Полоскание в ацетон, метанол и изопропанол, чтобы удалить сопротивляться.
11. Место в ванну с H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ 1:01 в течение 10 мин для очистки поверхности.
12. Тщательно промойте сверхчистой дистиллированной воды и сухой с N _2.
13. Депозит 1080 А Al ₂ O ₃ путем осаждения атомных слоев при температуре 250 ° С.

2. Получение поли (диметилсилоксан) Ракель

1. Если это возможно, работать в чистом помещении. В противном случае работать в чистейшей возможной среде.
2. Получить пластиковую чашку Петри (или другой чистый одноразовый контейнер) с ≥ 13 мм сторон.
3. В этом блюде, вылить 5 г PDMS отвердитель, затем 50 г PDMS барельефэ агент (или что-нибудь с соотношением 1:10, который будет в основном заполнить чашку Петри). Тщательно перемешать с одноразовой пластиковой пипетки или стержня.
4. Удалить пузырьки путем размещения смешанные PDMS в камере с вакуумной линии, применяя вакуум до пузырьков выйти из смеси (примерно 30 мин).
5. Если не уже в чашке Петри, залить PDMS в чашки Петри, избегая создания воздушных пузырьков.
6. Лечение ночь на электрической плитке в> 50 ° C (выше тепла в течение меньшего времени также работает).
7. С новым / чистым лезвием бритвы, аккуратно вырезать прямоугольный кусок примерно 2,5 х 2,5 см, сохраняя верхнюю поверхность как можно более чистым. Пил с чистого пинцета. Аккуратный от одного края (вплоть до 1,5 см), нажав на лезвие бритвы одним движением, чтобы сделать верхний край острый, как возможно (это будет край используется в швабры процесса).
8. Чистый с ацетон, метанол, изопропиловый спирт, и сверхчистой деионизированной воды, а затем сушить с чистой газообразного азота. Храните в чистом чашке Петри.

3. Подготовка пузырьков

1. Сбор липидов исходные растворы 25 мг / мл яичного фосфатидилхолина (PC) и 1 мг / мл 1,2-дипальмитоил-SN-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N - (lissamine родамина B сульфонил) соль аммония (Ро-DPPE) в хлороформе и 0,5 мг / мл стоковый раствор monosialoganglioside GM1 в смеси хлороформ / метанол (2:1 объем / объем).
2. В небольшой стеклянный флакон сделать смесь, что приводит к 97% мол ПК, 2 моль% GM1 и 1 моль% Rho-DPPE добавлением 18,9 мкл 25 мг / мл ПК, 39,6 мкл 0,5 мг / мл GM1 и 7,9 мкл 1 мг / мл Rho-DPPE с использованием стеклянных шприцев.
3. Примечание:. Дополнительный материал для Наир и др. ²⁵ содержит превосходный настраиваемый Excel таблицу для расчета количества липидов, необходимые для создания пузырьков любой желаемой композиции.
4. Поместите флакон в вакуумном эксикаторе и удалить растворитель, оставив флакон под вакуумом в течение 6 часов.
5. Сделать водный раствор 0,1М NaCl. Добавить 0,5 мл 0,1 М раствора NaCl во флакон, содержащий высушенный липидной пленки.
6. Разрешить водный липидов смесь на отдых в течение ночи.
7. Кратко вихрь смеси для создания суспензии везикул, а затем разрушать ультразвуком в течение 20 мин в ванне для обработки ультразвуком при комнатной температуре.
8. Экструдируйте суспензии везикул через поликарбонатную мембрану с 100 нм размера пор. Передайте суспензии везикул через фильтрующий 17x.
9. Храните экструдированных пузырьки в стеклянном флаконе при 4 ° С.

4. Формирование сферических поддерживаемых липидного бислоя

1. Соберите 700 нм в диаметре SiO ₂ бусинки. Шарики поставляются в дистиллированной воде с концентрацией фондовом 1,4 х 10 ¹¹ бусин / мл.
2. В 1,5 мл пробирку Эппендорфа подготовить 1 мл шарик суспензии с концентрацией 1,5 х 10 ¹⁰ бисер / мл добавлением 107 мкл исходного раствора шарик в 893 мкл 0,1 М NaCl.
3. Vortex подвеску, чтобы убедиться, что он хорошо мильнеподвижной.
4. Центрифугируют суспензию с 1700 мкг в течение 20 минут, затем отбросить супернатант. Ресуспендируют бусины в 1 мл 0,1 М NaCl. Повторите этот шаг еще дважды тщательно мыть шарики.
5. Для формирования SSLBs, в 1,5 мл пробирку Эппендорфа добавить 25 мкл SiO ₂ шарик суспензии в 200 мкл 1 мг / мл суспензии везикул. Vortex смесь и выдержать в течение 1 часа при комнатной температуре. На этой стадии концентрация SSLB должно быть 1,7 × 10 ⁹ / мл SSLBs.
6. Центрифуга при 1700 мкг в течение 20 мин для осаждения SSLBs. Осадок должен появиться розовый из-за разрыва пузырьков с Ро-DPPE на бусы.
7. Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют в 225 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), рН 7,4. Повторите шаги 4.6-4.7 два более раз, чтобы удалить любые неразорвавшихся пузырьки из суспензии SSLB.

5. Ассамблея SSLB массива

1. Клив пластины из микролуночных массивов в результате на прямоугольные куски с 4-6 микрофономRowell массивы за штуку.
2. Vortex смешать подвеска SSLB, затем поместите 10 мкл SSLB подвески на каждом массиве микропланшетным. Дабы остальные в течение 1 часа, чтобы позволить SSLBs оседают на поверхности.
3. Осторожно промыть чип микролуночный массива с PBS из бутылки мыть, то погружаться в ванну PBS, подготовленный в неглубокую посуду.
4. В то время как под водой, осторожно положите PDMS швабры флеш на чипе микролуночный массива и аккуратно сдвиньте ее вдоль поверхности 5x удалить SSLBs, которые не иммобилизованных в лунках.
5. Возьмитесь за чип микролуночный массив с помощью пинцета и осторожно встряхните в ванне PBS, чтобы удалить лишнюю SSLBs.
6. Быстро удалить обломок от швабры бане и не размещать в свежем PBS бане до дальнейшего использования. Убедитесь, что верхняя поверхность чипа остается влажной, чтобы сохранить SSLBs.

Примечание: Метод сборки описано выше, могут быть использованы для создания массивов природных частицы оболочки, как миелиновых частиц, выделенных из мозга мыши, или фотоновspholipid пузырьки без SiO ₂ бортовых опор. Эта работа подробно описана в Виттенбергского соавт. ²¹ и репрезентативные результаты приведены ниже.

6. Холерного токсина Анализ Binding

1. Подготовка 2 мг / мл раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS.
2. Готовят раствор с требуемой концентрации Alexa 488-конъюгированного холерного токсина B-субъединицы в ЗФР ​​с 2 мг / мл BSA.
3. Извлеките чип массива SSLB из ванны PBS и фитиль наиболее раствора PBS далеко с использованием лабораторной салфеткой. Оставьте достаточно PBS на чипе сохранить массив SSLB увлажненной.
4. Для предотвращения неспецифического связывания, добавьте 200 мкл 2 мг / мл BSA решение чипа массива SSLB. Пусть остальное в течение 1 часа в увлажненной коробки.
5. С помощью микропипетки, удалить 200 мкл раствора из верхней части чипа массива SSLB.
6. Добавить 200 мкл раствора токсина холеры на чип массива SSLB и оставьте в течение 1 часа в увлажненной коробки.
7. Осторожно промыть чип массива SSLB с PBS из бутылки мытья для удаления несвязанного холерный токсин.
8. Вика от избытка PBS с использованием лабораторного протрите. Перед визуализации чип крышку с скольжения 24 мм х 40 мм крышкой.
9. Массивы Изображение с прямой микроскоп с помощью фильтра устанавливает подходит для флуорофоров интересов.
10. Анализ интенсивности флуоресценции отдельных SSLBs в массиве с использованием автоматизированного анализа частиц функцию программного обеспечения ImageJ.
11. Компиляция средние интенсивности флуоресценции от отдельных SSLBs в гистограмм, которые обобщают интенсивности SSLBs найденные на данном массиве.

Results

Когда SiO ₂ гранулы смешивают с раствором везикул, состоящих из фосфолипидов, флуоресцентные липидов и других липидов, таких как ганглиозиды, пузырьки разрыву на SiO ₂ бортовых поверхности, чтобы сформировать SSLBs, как схематически показано на фиг.1а. После промывки SSLBs, капли раствора SSLB помещают на массив микропланшета, и гранулы дают осесть на поверхность. (Рис. 1B1) Это также может быть сделано с суспензией фосфолипидных везикул или стихийных частицы оболо...

Discussion

В этой работе показано, что монодисперсные SiO ₂ шариков, покрытых поддерживаемых липидных бислоев могут быть выстроены в микротитровальных массивов без необходимости ориентации лигандов на липидных бислоев или поверхности подложки, и массивы могут быть использованы для определения характеристик токсин-липидных взаимодействий. Константа диссоциации были рассчитаны для связывания CTx/GM1 выгодно, учитывая широкий несоответствие значений в литературе, с предыдущим доклада Winter и соавт., Где был испол...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-дюймовые кремниевые пластины	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0,7 фоторезист	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 проявитель	MicroChem	CD-26
i-line степпер	Canon	2500 i3 степпер
Vision 320 реактивный ионный травитель	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Глубокоранный реактивный ионный травитель	Plasma Therm	SLR-770
Система атомного слоевого депостирования	Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 поли(диметилсилоксан) набор	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0,5 КГ
Яйцо фосфатидилхолин	Avanti Polar Lipids	840051C
1,2-дипальмитоил-<ЭМ>СН-глицеро-3-фосфоэтаноламин-<ЭМ>N-(лиссамин родамин В сульфонил) аммонийная соль	Аванти Полярные липиды	810158C
Монозиалоганглиозид GM1	Аванти Полярные липиды	860065P
Гранулы диоксида	кремния Bangs Laboratories	SS03N/4666	На упаковке контейнера с шариками указано, что бусины имеют диаметр 900 нм. Однако после светорассеяния и электронной микроскопии мы определили, что бусины имеют диаметр примерно 700 нм.
В-субъединица холерного токсина, Alexa 488-конъюгированные	молекулярные зонды	C-34775
Антитела к олигодентроцитам IgM O4, конъюгат NorthernLights 557	R& D Systems	NL1326R
FM1-43	Молекулярные зонды	T-3136
Eppendorf MiniSpin центрифуга	Fisher Scientific	05-401-09