Для улучшения наших знаний о клеточной и молекулярной neotissue образования, мышиным модель TEVG Недавно был разработан. В трансплантаты были имплантированы как инфраренальной полой вены вмешательство трансплантатов в C57BL / 6 мышей. Эта модель достигает подобных результатов тем, которые достигаются в нашем клиническом исследовании, но за гораздо меньшее время цикла.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Имплантация нижней полой вены вмешательство трансплантат в мышиной модели
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Биологически леса, посеянные с одноядерных клеток костного мозга (контроллеров BMC) часто используются для реконструктивной хирургии для лечения врожденных сердечных аномалий. Долгосрочные клинические результаты показали отличные цены проходимости, однако, со значительным заболеваемости стеноза. Для исследования клеточных и молекулярных механизмов neotissue формирования сосудистой и предотвратить развитие стеноза в тканевых инженерии сосудистых трансплантатов (TEVGs), мы разработали модель мыши трансплантата с примерно 1 мм с внутренним диаметром. Во-первых, TEVGs были собраны из биоразлагаемых трубчатых лесов, изготовленных из нетканого материала полигликолевая кислоты чувствовал сетка с покрытием с ε-капролактона и L-лактида сополимера. Каркасах помещали в лиофилизатор, пылесосом в течение 24 ч и хранили в эксикаторе до посева клеток. Во-вторых, костный мозг брали из мышей-доноров и мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием в градиенте плотности. В-третьих, приблизительно один миллион клеткивысевают на эшафоте и инкубировали O / N. И, наконец, отобранные леса были затем имплантируют в качестве инфраренального полой вены трансплантатов вмешательство в C57BL / 6 мышей. Имплантированные трансплантаты продемонстрировал отличную проходимость (> 90%) без признаков тромбоэмболических осложнений или образование аневризмы. Это мышиной модели поможет нам в понимании и количественной клеточные и молекулярные механизмы neotissue образования в TEVG.
Введение
Врожденные пороки сердца серьезные условия, которые влияют почти 8% живорожденных в США. Примерно 25% из тех детей с врожденными пороками сердца или 2,4 на 1000 живорожденных, требуют инвазивных методов лечения в первый год их жизни 1. Наиболее эффективным средством для лечения врожденных пороков сердца является реконструктивная хирургия. К сожалению, осложнения, связанные с использованием имеющихся в настоящее время сосудистых трубопроводов являются наиболее существенной причиной послеоперационной заболеваемости и смертности.
Для решения этой проблемы мы разработали первые ткани инженерии сосудистых трансплантатов (TEVGs) для клинического применения 2. TEVGs были построены из биоразлагаемых полиэфирных труб посеянных с аутологичных костного мозга производного мононуклеаров (BM-МНК) и имплантированных как венозных каналов для врожденной сердечной хирургии. Результаты показали отличные показатели проходимости на 1-3 лет последующей деятельности, но со значительным заболеваемости стеноза 3,4. Было ясно, что лучшее понимание формирования сосудистого neotissue и механизма, лежащего в основе развития TEVG стеноза было необходимо. Для того, чтобы лучше понять развитие TEVGs и механизм развития стеноза, модель овец была создана 5,6. В этой модели, TEVGs успешно преобразован в живых судов и были подобны в обеих морфологии и функции родных вен. Это использование большого животной модели было хорошим первым шагом в предоставлении важную доклинических информацию, которые помогли клиническую использование TEVGs. Тем не менее, полное понимание клеточных и молекулярных механизмов сосудистой neotissue образования в TEVGs, использующих большие животные модели ограничен из-за ограничений в области молекулярной характеристики клеточных фенотипов сосудистых из-за отсутствия видов конкретных молекулярных инструментов. Чтобы преодолеть эти недостатки, на мышиной модели TEVGs была разработана по причине быстрого развития в области генетики мыши и их обширной молекулег характеристика с дополнительным преимуществом укороченной масштабе времени.
Мышиный IVC вмешательство модель добросовестно перечислил процесс neovessel образования, что происходит в больших животных и человека, но за гораздо более короткое время, конечно 6-9. Здесь подробный протокол для малого трансплантата производства с использованием биологически леса, сбор урожая БМ-MNC и изоляция, БМ-MNC посев на эшафот, и трансплантат имплантации в мышиной модели были описаны.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные процедуры были одобрены комитетом больницы Уходу за животными и использовать Национальная детская мимо.
1. Прививка Производство
- Сделать ε-капролактон и L-лактид сополимер P (LA / CL) решение, добавив 100 мг P (LA / CL) в 2 мл диоксана под вытяжкой. Поместите решение на вихрь и смешать непрерывно в течение 1-1,5 ч до полного растворения.
- В то же время, удалить лист полигликолевой кислоты (PGA) чувствовал из морозильника и вырезать несколько 5 х 8 мм разделов. Также отрезать кончик 0,1-10 мкл пипетки чуть выше фильтра.
- Вставка 19 G иглу (1,5 длина) в дистальный конец наконечника пипетки и обернуть PGA чувствовал вокруг иглы с помощью микро щипцы.
- Осторожно вставить войлок к дистальному концу наконечника пипетки, где просвет ровнее, чем проксимальной части, с помощью тупой иглы 18 G, в то время как 19 G игла вставлена в него.
- Пипетка40 мкл P (CL / LA) раствор в наконечник пипетки сверху. Насытить PGA чувствовал с решением. Затем нажмите пузырьки воздуха с помощью пипетки дозатор. Повторите этот процесс, если это необходимо.
- Место прививки в 50 мл трубки и поместить его в -80 ° C морозильник на 20 мин. Убедитесь, что глава игл лицом вниз.
- Передача трубку в лиофилизатор и вакууме в течение 24 часов. Убедитесь в том, чтобы открыть крышку трубки иметь воздушный поток.
- Выньте трансплантатов и удалить их из хвои. Отрежьте оба конца трансплантата, оставляя мм раздел ~ 5 и положил их обратно на иглы, чтобы сохранить свою форму. Держите трансплантатов в эксикаторе.
- Поместите на эшафот под УФ-светом в области биобезопасности капот O / N до посева клеток.
2. Костного мозга мононуклеарных клеток Заготовка и Изоляция
- Усыпить мышей с кетамин / ксилазина передозировки (кетамин, 200 мг / кг и ксилазина, 20 мг / кг).
- Удалить кости (бедраг Большеберцовые кости) от 3 мышей в течение 10 привитых имплантаций и поместить в чашку Петри с 10 см RPMI. Отрежьте оба конца костей и флеш костного мозга с помощью шприца с 25 G иглой в новую чашку Петри с 3 см RPMI. Сбор костный мозг и решение RPMI в 15 см трубки и мыть чашку Петри с дополнительным 2 см RPMI собрать оставшуюся часть BM.
- Возьмите образец (5-10 мкл) и количество клеток с использованием автоматического счетчика клеток или гемоцитометра. Запись результат.
- Положите 5 см Ficoll в 15 см трубки центрифуги и добавить костный мозг и решение RPMI. Добавить решение очень осторожно, чтобы не допустить его смешения с фиколла.
- Центрифуга в 528 мкг в течение 30 мин с "НИ Тормоз" при 24 ° С
- Снимите верхнюю розовый слой. Сбор средний прозрачный слой рисунок 1, который является слой MNC, и разбавить его с PBS 1:1.
- Центрифуга разбавленный MNC решение на 528 мкг в течение 10 мин при 24 ° С
- Удалить супернатант и дилютневая осадок с 5 мл PBS.
- Центрифуга гранул решение на 528 мкг в течение 10 мин при 24 ° С
- Удалить супернатант. Развести гранул с соответствующим объемом RPMI (~ 200 мкл).
- Возьмите 5-10 мкл пробы и подсчета клеток с использованием автоматического счетчика клеток или гемоцитометра. Запись результат. Повторите ячейку считая еще раз и рассчитать среднее количество клеток.
- Развести концентрации клеток до 1000000 cells/10 мкл с использованием RPMI.
3. Сотовый Посев
- Предварительно смочите эшафот добавлением 5 мкл RPMI люминально в течение 5 мин, затем снимите RPMI.
- Добавить 10 мкл костного мозга, полученных моно ядерных клеток в RPMI с шага 2.12 до лесов просвета и ждать 10 минут, чтобы позволить клеткам прикрепляться на эшафот.
- Вырежьте иглу 19 G 1 см длиной и положил иглу в просвет эшафот, чтобы держать форму на эшафот. Поместите образец в 24-луночный планшет.
- Добавить 1000 мкл RPMI в каждую лунку и инкубировать O / N в инкубаторе.
4. Прививка Имплантация
- Автоклав все хирургические инструменты перед операцией: 1x тонких ножниц, 3x микро щипцы, 2x микро сосудистые зажимы, 1x зажим, применяющие щипцы, 1x микро держатель иглы, 1x весенние ножницы, 1x втягивающим.
- 6-8 недель женский C57BL / 6 используются в качестве ткани инженерии сосудистых получателей привитых. Удалить мыши из клетки и взвешивают его, а затем анестезию путем внутрибрюшинной инъекции в правом нижнем квадранте живота с кетамин / ксилазина коктейль (кетамин, 100 мг / кг и ксилазина, 10 мг / кг). Кетопрофен (5 мг / кг, внутрибрюшинно) используется в качестве предварительной анестезии анальгетик.
- Проверьте уровень седации по сказке щипать, то клип брюшной волосы. Смажьте глаза стерильной глазной мази, и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Лечить живот бетадином и алкогольной колодки. КолорадоVer мышь с стерильной драпировки и разоблачить область разреза только.
- Сделайте срединный лапаротомии разрез от ниже xyphoid к надлобковой области, и вставить самоудерживающиеся втягивающим. Оберните кишечник в солевом смоченной марлей. Грубо определить инфраренальной аорту и полую вену.
- Поместите два микро сосудистые зажимы на обоих проксимальных и дистальных сторон аорты и полой вены, то тупо отделить аорты от полой вены Разрез полой вены. При необходимости перевязывать брюшной аорты ветви с 10-0 мононити швов на конических игл.
- Имплантировать нижней полой вены вмешательство трансплантата с проксимального и дистального конца до конца анастомозов с помощью стерильного 10-0 шов. Обрежьте трансплантата, как правило, 1-2 мм, в зависимости от анатомии мыши. Закрепите трансплантата с одной строчкой на обоих ближним и дальним концами и начать сшивать непрерывно с 4-5 Stiches с другой стороны трансплантата. После окончания переднюю сторону, перевернуть зажимы и трансплантатовна другую сторону и шов заднюю сторону трансплантата. Во время имплантации, промойте трансплантат раствором гепарина часто, чтобы предотвратить острый тромбоз.
- Снимите ближний зажим и контролировать кровотечение, применяя актуальные рассасывающиеся стерильную кровоостанавливающего средства. Когда кровотечение останавливается полностью, удалить дистальный зажим и контролировать кровотечение так же. Убедитесь, что потоки крови через трансплантат.
- Закройте брюшной мускулатуры и кожи в два слоя с использованием 6-0 черный полиамид мононити шов с включенным резьбовым иглы.
- Введите 0,5 мл физиологического раствора подкожно и поместите курсор в восстановление клетке на потепление площадку, пока мышь не является полностью мобильным. После восстановления, возвращения мышь на новую клетку с бумажной постельные принадлежности. Дайте обезболивающее (ибупрофен, 30 мг / кг, питьевой воды) в течение 48 часов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Схема TEVG имплантации показано на рисунке 1. Костный мозг был собран из мыши-донора и моно ядерные клетки выделяли с помощью центрифугирования плотности, а затем высевали на биоразлагаемого строительных лесов. В очищенных от семян леса инкубировали O / N и имплантировали в мыши-реципиента в качестве нижней полой вены разъединительных трансплантата.
На рисунке 2 показан сканирующей электронной микроскопии в PGA-Р (CL / LA) эшафот. Внутренний диаметр был приб...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Модель мыши TEVG является ценным инструментом для изучения клеточных и молекулярных механизмов neotissue формирования и развития стеноза. Отобранный БМ-MNC было показано в обоих гистологических и SEM образов сеяных клеток на трансплантата 11. Эффективность посева клеток было также показано, с использованием анализа ДНК 7. Используя эту модель системы мы показали, что клетки посев снижает заболеваемость развития TEVG стеноза, который был основным путем отказа в нашем человеческом клиническом испытан...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана, в частности, за счет гранта от НИЗ (РВЫХ1 HL098228) в ЦКБ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Полигликолевая кислота (PGA) войлок | биомедицинских структур | Custome заказал | |
| наконечник пипета, 0,1-10 мкм; l | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Лиофилизатор | Labconco | 7070020 | |
| RPMI medium 1604 | Gibco | 11875-093 | |
| чашка Петри | BD | 353003 | |
| 24-луночной пластине | Corning | 3526 | |
| 15cc tube | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100мл | Также называется 'Histopaque'DPBS |
| Gibco | 14190-144 | ||
| Литтауэрский косторез 4,5" Прямой | Roboz | RS-8480 | Для сбора БМ |
| Щипцы 4,5 | Roboz | RS-8120 | Для сбора БМ |
| Ножницы 4,5" | Roboz | RS-5912 | Для сбора БМ |
| Микроскоп | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 недель |
| Кетамина гидрохлорид для инъекций | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Ксилазин стерильный раствор | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Кетопрофен | Форт Додж Здоровье животных | NDC 0856-4396-01 | |
| Ибупрофен | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Гепарин | натрия Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Физиологический раствор (стерильный 0,9% натрия хлорид) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0,9% хлорида натрия для инъекций | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Петролатумовая офтальмологическая мазь | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Йодные прокладки | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Салфетки для приготовления алкоголя | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Аппликаторы с хлопчатобумажными наконечниками | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| Ножницы тонких FST | 14028-10 | ||
| Микроадсонский щипцы | FST | 11018-12 | |
| Зажим для нанесения щипцов | FST | 00072-14 | |
| S& T Сосудистый зажим | FST | 00396-01 | |
| Пружинные ножницы | FST | 15008-08 | |
| Colibri ретракторы | FST | 17000-04 | |
| Дюмон #5 щипцы | FST | 11251-20 | |
| Дюмон #7 - тонкие щипцы | FST | 11274-20 | |
| Дюмон #5/45 щипцы | FST | 11251-35 | |
| Тиш иглодержатель/ щипцы | Micrins | MI1540 | |
| Черный полиамидный монофиламентный шовный материал, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | Для наложения швов на трансплантат |
| Черный полиамидный монофиламентный шовный материал, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | Для мускулатуры и закрытия кожи |
| Нетканые губки | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Рассасывающийся гемостат | Ethicon | 1961 | |
| 1 мл Шприц | BD | 309659 | |
| 3 мл Шприц | BD | 309657 | |
| 10 мл Шприц | BD | 309604 | |
| 18 Г 1,5 дюйма, Игла | BD | 305190 | |
| 25 Г 1 дюйм, Игла | BD | 305125 | |
| 30 Г 1 дюйм, Игла | BD | 305106 | |
| Рециркулятор теплой воды | Gaymar | TP-700 | |
| Грелка | Gaymar | TP-22G | |
| Триммер | Wahl | 9854-500 |
Ссылки
- Heart Association, A. merican Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update. Circulation. 125, (2012).
- Shinoka, T., et al. Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).
- Hibino, N., et al. Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).
- Shin'oka, T., et al. Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).
- Brennan, M. P., et al. Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model. Ann Surg. 248, 370-377 (2008).
- Roh, J. D., et al. Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques. Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).
- Hibino, N., et al. Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel. The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).
- Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).
- Naito, Y., et al. Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Eng. Part A. 20, (2013).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter. Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).
- Roh, J. D., et al. Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model. Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).
- Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice. Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Тканеинженерный сосудистый трансплантатмононуклеарные клетки костного мозгацентрифугирование в градиенте плотностиимплантация в нижнюю полую венуизготовление биоразлагаемого скаффолдапротокол заселения клеткамимикрохирургические методыгистологический анализформирование неотиканипредотвращение стеноза
