Этот протокол описывает процедуру серийного отбора проб бедренного костного мозга (БМ) без необходимости жертвоприношения мышей. Эта процедура облегчает лонгитюдные исследования состава КМ мышей с течением времени и обеспечивает последовательный доступ к клеткам внутри КМ для исследований ex vivo и трансплантации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Костном мозге бедра Стремление в живых мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Серийный отбор проб клеточного состава костного мозга (КМ) является рутинной процедурой, имеющей решающее значение для клинической гематологии. Этот протокол описывает подробную пошаговую техническую процедуру для аналогичной процедуры на живых мышах, которая позволяет проводить серийную характеристику клеток, присутствующих в БМ. Эта процедура облегчает исследования, направленные на обнаружение присутствия экзогенно вводимых клеток в КМ мышей, как это было бы сделано, например, в исследованиях ксенотрансплантатов. Кроме того, эта процедура позволяет извлекать и характеризовать клетки, обогащенные БМ, такие как гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (ГСКС), без жертвоприношения мышей. Учитывая, что клеточный состав периферической крови не обязательно отражает пропорции и типы стволовых и прогениторных клеток, присутствующих в костном мозге, процедуры, которые обеспечивают доступ к этому компартменту без необходимости уничтожения мышей, являются очень полезными. Здесь проиллюстрировано использование аспирации костного мозга бедренного костного мозга для цитологического анализа клеток костного мозга, проточной цитометрической характеристики гемопоэтического стволового/прогениторного компартмента, а также культивирования отсортированных ГСК, полученных с помощью аспирации бедренного мозга по сравнению с обычным забором костного мозга.
Введение
Все клетки крови получены из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Процедуры, которые обеспечивают доступ к костному мозгу (КМ), месту расположения подавляющего большинства ГСК у мышей и людей, не требуя жертвоприношения животных, обеспечивают ресурс для серийного мониторинга источника кроветворения. Общая цель описанной здесь процедуры состоит в том, чтобы предоставить подробный протокол отбора проб клеток КМ из бедренной кости живых мышей, который обеспечивает материал, репрезентативный для клеток, который был бы получен при обычном сборе клеток КМ путем жертвоприношения мышей. Преимущество этой процедуры по сравнению с обычным забором клеток КМ заключается в том, что эта процедура не требует жертвоприношения мышей и, следовательно, позволяет проводить продольное исследование компартмента костного мозга мышей с течением времени.
Хотя эта процедура аспирации костного мозга мышей использовалась в ряде исследований и описана ранее (см. Sundberg et al. Для исторического обзора1) формальные пошаговые процедуры, иллюстрирующие эту технику, ранее не публиковались. Этот протокол позволяет проводить регулярный серийный отбор проб КМ для таких целей, как оценка приживления в КМ экзогенных клеток, введенных мышке (как это было бы сделано в исследованиях ксенотрансплантатов, например, 2,3), анализ химеризма в КМ для сравнения с химеризмом в периферической крови (где результаты не обязательно совпадают), мониторинг обилия специфических типов клеток, обычно обогащенных в костном мозге, таких как гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники. и извлечение клеток КМ для культивирования ex vivo и/или трансплантации. Кроме того, оценка содержимого костного мозга может быть очень полезной в мышиных моделях гематологических заболеваний, поскольку аспирация полезна для оценки бремени гематологических заболеваний в моменты времени, когда заболевание может не проявляться в периферической крови3-5. Кроме того, эта методика может быть использована для оценки реакции гематологического заболевания костного мозга на препараты, вводимые в терапевтических исследованиях. Таким образом, описанная здесь процедура идеально подходит для исследователей, желающих получить доступ к гемопоэтическим клеткам костного мозга мышей для цитологического анализа, проточного цитометрического анализа, культивирования in vitro и/или исследований трансплантации in vivo без необходимости жертвовать или причинять вред мышам.
Протокол отбора проб БМ, описанный здесь, очень похож на технику, используемую для внутрибедренного введения материала непосредственно в полость костного мозга3,6. Ключевое отличие заключается в том, что в этом протоколе подробно описана процедура удаления клеток из костного мозга, в отличие от закапывания материала непосредственно в пространство полости костного мозга, как это делается при внутрибедренной инъекции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все животные процедуры, описанные в данном протоколе были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUCs) на Мемориал Слоан-Кеттеринг онкологический центр на.
1. Аспирации костного мозга (КМ) Клетки из бедренной кости
- Обезболить мышь, которая будет проходить бедренной стремление костного мозга изофлураном (1-4%), которой вводили прецизионного испарителем. Глубину анестезии следует контролировать каждые 5-10 мин в течение всей процедуры, заметив, что нет никаких изменений в частоте дыхания, связанного с хирургического вмешательства и / или уха, пальца, а хвостовой шнура. Анестезия индуцируется изофлураном а также поддерживается на протяжении всей процедуры изофлураном. Упреждающий предварительно процессуальное доза бупренорфина в дозе 0,05-0,1 мг / кг подкожно каждые 6-12 ч может быть использован для предотвращения боли, связанные с процедурой как прилАгентства ООН в Carprofen.
- Применить глазной мази для глаз мыши следующей вводного наркоза для предотвращения роговицы сушки.
- Мех тщательно вырезанные из области кожи около 150% больше, чем площадь предполагаемого аспирации сайте. Свободные мех удаляется влажной марлевой салфеткой. Пожалуйста, держать мышь на циркулирующей теплой подушки воды или другого безопасного термостатом поверхности, чтобы предотвратить переохлаждение во время процедуры.
- Лечить всю ногу, содержащий бедренную кость, которая будет проходить стремление с тремя наборами чередующихся скрабы (переменный или с повидон-йодом (Betadine) или хлоргексидином (Nolvasan) скраб и 70% изопропилового спирта или 70% этанола всасывается марлевые тампоны).
- Влажный 0,5 мл туберкулина шприц (объем: 0,5 CC; Калибр: 27,5 г) со стерильным фосфатно-солевом буфере (PBS) перед аспирации BM. Заполните шприц с 200-500 мкл PBS и немедленно изгнать PBS. Повторите эту процедуру 2-3 тРедакторы IME.
- Держите голени согнуты из бедренной кости, нажав на голени или с безымянного пальца или пятого пальца. Убедитесь, что подходит анестетик самолет была достигнута. Шприц держат используя большой палец и указательный палец. Это позволяет мыщелков быть подвержены и облегчает введение иглы.
- После смачивания шприц, вставить иглу через связки надколенника, чтобы игла подал надежно между двумя мыщелков бедренной кости. Путем проведения диафизе близко к эпифиза бедренной кости с большим пальцем и указательным пальцем, игла вставлена в бедренной кости легко.
- Поворотный иглу наружу и вверх так, чтобы он был параллелен валу бедренной кости. Это действие облегчает поиск содержимого костного мозга с бедренной вала.
- Поверните иглу по часовой стрелке и против часовой стрелки, нажимая на него медленно в бедренную полости мозга. Подтвердите правильное позиционирование иглы, осторожно перемещая сиRINGE боков.
- Осторожно потяните иглы поршень назад, создавая отрицательное давление, при перемещении иглы назад и вперед внутри полости BM. Примечание: Объем BM придыхательных будет примерно 5 мкл который обычно соответствует 0,4-0,8 х 10 6 мононуклеаров. Успешное стремление будет подтверждена визуально по внешнему виду крови в верхней части иглы в базе шприца. Если кровь не видно в шприце вполне вероятно, что небольшая кость или ткани фрагмент застрял в иглу. Это может быть удалена из иглы, перемещая поршень вверх и вниз в PBS (это одна из причин, почему шприц должен быть предварительно заполнен PBS до аспирации BM). Если ткань не может быть выбит из шприца, используйте новую иглу и шприц (снова смачивать шприц с 200-500 мкл PBS).
- После того, как Б.М. успешно отсасывают из бедренной кости, извлеките иглу и шприц из бедренной кости и мыши.
- Перемещение атмосферный BM к пробирке пр.efilled с 500 мкл PBS. Для большинства приложений, клетки BM затем следует хранить на льду до дальнейшей обработки, если это возможно.
- После завершения процедуры, управлять анальгетик с карпрофена 5 мг / кг подкожно. Затем снимите мышь от наркоза и поместить на нагретую площадку до полного восстановления. ПРИМЕЧАНИЕ: Там не должно быть никаких осложнений или теснота испытали в соответствии с процедурой аспирации если все сделано правильно.
- Перед возвращением мышей в области жилищного строительства, чтобы они в состоянии передвигаться и достичь пищу и воду. Соблюдайте мышей на наличие признаков бедствия или процедуры инфекция сообщению в следующем 24 часов. Симптомы включают в себя: постоянной кровотечения, анемия, вялость. Если какие-либо из этих признаков видны сообщению процедуру, животное (ы) должны быть умерщвлены. Примечание: BM стремление / отбора проб может быть повторен, но процедура повтор должна быть выполнена на противоположной бедренной кости, чтобы предотвратить повторное травму той же ноги. Существует мало информации относительно фрequency, что БМ стремление может быть выполнена. Бедренной стремление костного мозга как правило, не повторяются не чаще, чем раз в 2 недели.
2. Оценка Cellular Материалы в засос BM клеток
- Гранул клетки, извлеченные из БМ аспирации и место в пробирке путем центрифугирования при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С или комнатной температуры.
- Аспирируйте супернатант и затем ресуспендируют осадок в 500 мкл ACK красных кровяных буфера для лизиса клеток (лизирующего буфера "аммоний-хлорида калия»).
- Инкубируйте клетки в красной буфера для лизиса клеток в течение 10 мин, а затем добавить 1 мл PBS и спином вниз смесь снова при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С или комнатной температуры. Примечание: красных кровяных клеток лизируют гранул в настоящее время состоит из БМ мононуклеаров. Они могут быть ресуспендировали для FACS окрашивания, подсчета клеток, трансплантации, анализа Cytospin и / или любого другого использования (так же, как BM клетки, собранные из жертвенных мышей будет использоваться).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Бедренной БМ стремление живого C57/B6 мыши была использована для получения мононуклеарных клеток BM следуют обычным урожая BM того же мыши после жертвоприношения. BM мононуклеарные клетки, полученные обоими методами затем анализировали (1) цитологического анализа BM клеток, (2) определения относительной частоты гемопоэтических стволовых клеток / клеток-предшественников (HSPCs) и (3) экс виво культура отсортированных HSPCs. В последнем эксперименте, Lineage-отрицательных СЦА1 + C-KIT + (LSK) клетки были классифи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Серийный БМ стремление рутинной процедурой решающее значение для клинических испытаний гематологические заболевания у человека. Возможность выполнять аналогичную серийный выборки BM у мышей для характеристики клеточного состава и составляющих BM всей длительных экспериментов также очень ценно. Эта процедура полезна для характеризации HSPC без ущерба для мыши, но и для обнаружения присутствия дополнительных типов клеток в BM в тех случаях, когда содержимое периферической крови не может быть отражающей клеток, проживающих...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
O.A.-W. поддерживается премией NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01), премией постдокторанта Министерства обороны США в области исследований недостаточности костного мозга (W81XWH-12-1-0041), программой исследователей Джози Роберстон и премией Дэймона Раньона Clinical Investigator Award при поддержке Фонда Эвана.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Бычий сывороточный альбумин | PAA | K41-001 | |
| ACK буфер для лизиса | Домашний | в 1 л. Отрегулируйте pH 7,2 ~ 7,4 и отфильтруйте стерильно с 0,22 μ м вакуумный фильтр. | |
| 8,3 г хлорида аммония | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 г Гидрокарбонат калия | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μ l 0,5 м ЭДТА pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0,5 мл туберкулиновый шприц 27,5 г | Becton Dickinson | 305620 | |
| Стерильный клеточный ситечко 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Игла с тупым концом | Stemcell Technologies | 28110 | |
| Игла PrecisionGlide 23 г | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 мл Шприц с наконечником Luer-Lok | Becton Dickinson | 309657 | |
| Планшет, обработанный без культуры тканей, 6 лунок | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 мм 5 мл тубы | Бактон Дикинсон | 352054 | FACS окрашивание |
| 12 x 75 мм 5 мл тубы с крышкой клеточного фильтра | Becton Dickinson | 352235 | FACS окрашивание |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G и Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | ||
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-фенилиндола дигидрохлорид) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | Для культуры метоцеллюлозы |
| Carprofen | Crescent Chemical Компания | C11045850 | 1 доза (5мг/кг) |
| Проточный цитометр, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet мазь (стерильная петролатумная офтальмологическая мазь) | Dechra-US | 17033-211-38 |
Ссылки
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
