Для того чтобы понять клеточные и молекулярные механизмы, лежащие neotissue формирование и развитие стеноза в ткани инженерии клапанов сердца, была разработана мышиной модели гетеротопической трансплантации сердца клапана. Легочное сердце клапан был пересажен получателю с помощью гетеротопической технику трансплантации сердца.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трансплантация клапана легочной артерии с помощью мыши Модель гетеротопической Трансплантация сердца
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тканевые инженерии клапанов сердца, особенно decellularized клапаны, начинают набирать обороты в клинического использования реконструктивной хирургии со смешанными результатами. Тем не менее, клеточные и молекулярные механизмы развития neotissue, клапана утолщения и развития стеноза не исследовал экстенсивно. Чтобы ответить на эти вопросы, мы разработали мышиный гетеротопической клапана сердца модель трансплантации. Клапана сердца собирали из клапана мыши-донора и пересадить к сердечному мыши-донора. Сердце с новым клапаном был пересажен гетеротопически к мыши-реципиента. Пересаженного сердца показали свой сердцебиение, независимо от сердцебиения получателя. Кровоток измеряют, используя высокую ультразвуковую систему частоты с помощью импульсного волнового Доплера. Поток через имплантированного клапана легочной артерии показал вперед поток с минимальным срыгивания и пиковый поток был близок к 100 мм / сек. Это мышиной модели трансплантации сердечного клапана является Highlу универсальным, так что он может быть модифицированы и адаптированы, чтобы обеспечить различные гемодинамические сред и / или могут быть использованы с различными трансгенных мышей для изучения neotissue развитие в ткани инженерии клапанов сердца.
Введение
Врожденные сосудистые дефекты являются одним из ведущих причин детской смертности в западном мире 1,2. Среди них, стеноз легочной артерии клапана и двустворчатый аортальный дефекты клапанов часто встречающиеся формы 3. Замена клапанов сердца хирургия является рутинной выбор реконструктивных операций; Однако осложнения, включая стеноз и кальцификации клапана сердца, и на протяжении всей жизни зависимость от антикоагулянтов являются существенным источником хронического нездоровья и смерти 4-7. Кроме того, отсутствие потенциала роста требуется операции редактирования, который еще больше увеличивает смертность этих молодых пациентов 4,8,9.
В попытке разработать функциональную замену сердечного клапана с потенциалом роста, Shinoka др.. Сеяных аутологичных клеток на биоразлагаемых синтетических сердечного клапана 8. Синтетический клапан трансформируется в родном сердечного клапана, как структура с Potenti ростадр.. Предварительные крупные исследования на животных показали возможность использования этой методологии для создания функциональной сердечный клапан 10. Однако долговременные имплантации исследования показали плохую прочность из-за прогрессирующего утолщения neotissue клапана в результате сужения клапана сердца. Работа с Sodian соавт. Использовали методологию Shinoka, но в конечном счете заменить матрицу PGA с биоразлагаемым эластомера, который дал биомеханические свойства ткани инженерных клапана построить более физиологический профиль 9,11,12. В исследовании в естественных условиях, несмотря на успех имплантации, сливающийся эндотелиальных клеток подкладка была не сформирована, которые могли бы ограничить долгосрочный успех этого эшафот 12.
Для того, чтобы рационально проектировать улучшенное второе поколение синтетического сердечный клапан, на мышиной модели трансплантации клапана сердца была создана для расследования клеточные и молекулярные механизмы underlyinформирование г neotissue, клапан утолщение, и развитие стеноза. Мышиные модели предлагают широкий спектр молекулярных реагентов, в том числе трансгенных, которые не являются легкодоступными для других видов 7. В этом сердечной трансплантации клапана модели, экс естественных сингенными замена легочное сердце клапана была выполнена первая; и тогда сердце с имплантированным сердечным клапаном был имплантирован гетеротопически в сингенной хозяина с помощью микрохирургической техники. Эта модель позволяет замену клапана сердца без необходимости искусственного кровообращения.
В данной работе, подробное объяснение урожай клапана сердца, препараты донорской сердце, трансплантация сердца клапан, и гетеротопическая трансплантация сердца описывается. Результаты показали непрерывный сердцебиение от донорского сердца, которая была независимой от сердцебиения получателя. Кровоток через имплантированного клапана легочной артерии измеряли с помощью высокой ультразвуковую систему частот с импульсно-волновом лиppler.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Все животные процедуры были одобрены комитетом больницы Уходу за животными и использовать Национальная детская мимо.
1. Легочная клапана сердца Добывается из донорского сердца Valve Mouse
- Автоклав все хирургические инструменты перед операцией: 1x тонких ножниц, 3x микро щипцы, 2x микро сосудистые зажимы, 1x зажим, применяющие щипцы, 1x микро держатель иглы, 1x весенние ножницы, 1x втягивающим.
- 6-8 недельных самок C57BL / 6 мышей используют в качестве доноров легких сердечного клапана. Отключив мышь из клетки и взвесить его, то эвтаназии с кетамин / ксилазина коктейля (Кетамин, 200 мг / кг и ксилазина, 20 мг / кг, IP) передозировка.
- Клип грудь и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Затем сделайте торакотомию. Expose сердце, сделать небольшой разрез на правом предсердии, и заливать левого желудочка с ледяной физиологический раствор.
- Грубо рассекают легочной артерии (ПА) из восходящего аОрта. Вырежьте легочного клапана (PV) наряду с 2 мм манжеты легочной артерии. Утилизировать оставшейся части сердца.
- Хранить PV в холодной гепарина и солевым раствором (100 единиц / мл). Примечание: PV может храниться в растворе в течение двух часов перед трансплантацией в донорского сердца.
2. Донорское сердце Подготовка
- 6-8 недельных самок C57BL / 6 мышей используют в качестве доноров сердца. Отключив мышь из клетки и взвесить его, то эвтаназии с кетамин / ксилазина коктейля (кетамина, 200 мг / кг и ксилазина, 20 мг / кг, IP) передозировки. Это процедура терминал.
- Клип грудь и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Затем сделайте торакотомию. Грубо отделить сердце, нижнюю полую вену (IVC), верхней полой вены (SVC), восходящей аорты, PA, и легочную вену. Заливать IVC ледяной стерильного физиологического раствора.
- Лигируют IVC, SVC, и легочную вену с 6-0 шелковой нити затем разрезают превосходитлигатуры.
- Разрежьте аорты и ПА с 2 мм манжеты.
- Вырежьте PV и распоряжаться им.
3. Клапана сердца Трансплантация на донорское сердце
- Сразу после шага 2.5, поместите клапан сердца, начиная с шага 1.5 в донорского сердца и ориентировать сердечный клапан.
- Закрепите PV с стежка на правой стороне клапана, используя 10-0 мононити швов на конических игл и начать сшивать непрерывно с 5-6 Stiches от другой стороны PV.
- После окончания переднюю сторону, повернуть сердце горизонтально и начать сшивать заднюю сторону ФВ на донорского сердца.
- Хранить сердце в холодном стерильного раствора гепарин / физиологического раствора. Примечание: донорское сердце может храниться в растворе в течение двух часов перед имплантацией к мыши-реципиента.
4. Гетеротопическая Трансплантация сердца на Получателю Mouse
- 6-8 недельных самок C57BL / 6 мышей использовали в качестве RECIpient. Удалить мыши из клетки и взвешивают его, а затем анестезировали кетамином / ксилазина коктейль (кетамин, 100 мг / кг и ксилазина 10 мг / кг). Кетопрофен (5 мг / кг) используют в качестве предварительных мероприятий по наркозу анальгетик.
- После проверки уровня седации хвостом щипать, обрезать брюшного пресса и волосы на груди. Смажьте глаза стерильной глазной мази, и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Лечить живот бетадином и алкогольной колодки. Затем накрыть мышь с стерильной драпировки и разоблачить область разреза только.
- Сделайте срединный лапаротомии разрез от ниже xyphoid к надлобковой области, и вставить самостоятельно стопорное втягивающим. Оберните кишечник в солевом смоченной марлей. Грубо определить инфраренальной аорту и полую вену.
- Поместите два 6-0 шелковые швы проксимально и дистально вокруг аорты и нижней полой вены сдерживать кровообращение.
- Поместите донорского сердца на правой стороне брюшной аорты и покрыть ее стерильной Гауге. Увлажнение его физиологическим раствором.
- Сделать aortotomy в брюшной аорты с использованием 30 г иглы и расширить отверстие с помощью ножниц до размера доноров аорты.
- Выполните конца в сторону анастомоза с использованием стерильных 10-0 мононити швов на конических игл. Безопасность донорской аорты с одним швом на проксимальном конце отверстие в брюшной аорты и начинают шов непрерывно с 4-5 Stiches от дистального конца брюшной аорты.
- Флип сердце с левой стороны, покрыть ее солевым придают марли, и начинают шов непрерывно с 4-5 Stiches от дистального конца брюшной аорты.
- Сделайте венотомия в НПВ, используя 30 г иглы и расширить отверстие до размеров доноров легочной артерии.
- Выполните конец в сторону анастомоза с использованием стерильных 10-0 мононити швов на конических игл. Безопасный донор ПА с одним швом на проксимальном конце отверстие в нижней полой вены и начинают шов непрерывно с 4-5 Stiches издистальный конец нижней полой вены. На этот раз, потому что аорта находится в пути, убедитесь, ушивание левой стене ПА донора находится на внутренней нижней полой вены.
- Флеш просвет IVC с гепарином и солевым раствором (100 единиц / мл). Закройте правую стену доноров ПА и получателя IVC сшиванием их постоянно к дальнему концу.
- Удалить дистального лигатуры и контролировать кровотечение, применяя актуальные рассасывающиеся стерильную кровоостанавливающего средства. Когда кровотечение останавливается полностью, удалить проксимального шва и контролировать кровотечение так же.
- Вернуться кишечник и закрыть брюшную мускулатуру и кожу в два слоя с использованием 6-0 черный полиамид мононити шов.
- Введите 0,5 мл физиологического раствора подкожно и поместите курсор в восстановление клетке на потепление площадку, пока мышь не является полностью мобильным. После восстановления, возвращения мышь на новую клетку с бумажной постельные принадлежности. Дайте обезболивающее (ибупрофен, 30 мг / кг, питьевой воды) в течение 48 часов. Делатьне возвращать животное, которое претерпела операцию по компании других животных, пока полностью не выздоровел.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1 показаны схемы клапана трансплантации модели сердца с помощью гетеротопической трансплантации сердца. Клапана сердца собирали из донорского сердца и имплантируют в сердце из второго мыши-донора. Затем сердце с новым сердечного клапана имплантировали в брюшную полость мыши-реципиента. Рисунок 2 показывает иллюстрацию имплантированного сердца на брюшной полости (А), сразу после трансплантации сердца (B), и через 5 мин после трансплантации. По...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Смертность этой процедуры близка к 20%, что в основном вызванной кровотечением в месте трансплантации PV и анастомоза на донорской аорты получателю брюшной аорты. В большинстве случаев, смертность значительно снижает 48 ч после операции. Мыши выживания показал сильные удары сердца и кровоток через имплантированный PV. Весь процесс занимает четыре часа для опытного микро хирурга. Это займет примерно 250 мышей освоить технику. Гетеротопическая трансплантация сердца является относительно прямой по сравнению с PV имплантаци...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана, в частности, за счет гранта от НИЗ (РВЫХ1 HL098228) в ЦКБ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Микроскоп | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 недель |
| Кетамина гидрохлорид для инъекций | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Стерильный раствор ксилазина | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Кетопрофен | Форт Додж Здоровье животных | NDC 0856-4396-01 | |
| Ибупрофен | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Гепарин натрия | Агент Фармацевтики | NDC 25021-400 | |
| Физиологический раствор (Стерильный 0,9% натрия хлорид) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0,9% натрия хлорид для инъекций | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Петролатум Офтальмологическая мазь | Дехра Ветеринарные продукты | NDC 17033-211-38 | |
| Йодные прокладки | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Прокладки для приготовления алкоголя | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Аппликаторы с хлопчатобумажными наконечниками | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Тонкие ножницы | FST | 14028-10 | |
| Микро-адсонский щипец | FST | 11018-12 | |
| Зажим для нанесения щипцов | FST | 00072-14 | |
| S& T Сосудистый зажим | FST | 00396-01 | |
| Пружинные ножницы | FST | 15008-08 | |
| Colibri Ретракторы | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Щипцы | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Тонкие щипцы | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Щипцы | FST | 11251-35 | |
| Tish Needle Holder/ Щипцы | Micrins | MI1540 | |
| Черный полиамид Монофиламент Шовный материал, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | Для наложения швов на трансплантат |
| Черный полиамид Монофиламент Шовный материал, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | Для мускулатуры и закрытия кожи |
| Нетканые губки | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Кровоостанавливающееся средство рассасывающееся | Ethicon | 1961 | |
| 1 мл Шприц | BD | 309659 | |
| 3 мл Шприц | BD | 309657 | |
| 10 мл Шприц | BD | 309604 | |
| 18 г 1 1/2 дюйма, игла | BD | 305190 | |
| 25 г 1 дюйм, игла | BD | 305125 | |
| 30 г 1 дюйм, Игла | BD | 305106 | |
| Рециркулятор теплой воды | Gaymar | TP-700 | |
| Грелка | Триммер Gaymar | TP-22G | |
| Wahl | 9854-500 | ||
| VEVO2100 Высокочастотный ультразвук | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | Каталожный номер и цены можно получить у торговых представителей. |
| Гель для пропускания ультразвука | Parker Laboratories, INC. | 01-02 | |
| Настольная система анестезии лабораторных животных | VetEquip, INC. | ||
| Изофлуран | Бакстера | 1001936060 |
Ссылки
- Polito, A., et al. Increased morbidity and mortality in very preterm VLBW infants with congenital heart disease. Intens Care Med. 39, 1104-1112 (2013).
- Wren, C., Reinhardt, Z., Khawaja, K. Twenty year trends in diagnosis of life threatening neonatal cardiovascular malformations. Arch Dis Child Fetal. 93, F33-F35 (2008).
- Vacanti, J. P. Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture. Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).
- Tudorache, I., et al. Orthotopic replacement of aortic heart valves with tissue-engineered grafts. Tissue engineering Part A. 19, 1686-1694 (2013).
- van Geldorp, M. W., et al. Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis weighing lifetime anticoagulant related event risk against reoperation risk. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 137, 881-886 (2009).
- El Oakley, R., Kleine, P., Bach, D. S. Choice of prosthetic heart valve in today's practice. Circulation. 117, 253-256 (2008).
- Quinn, R. W. Animal Models for Bench to Bedside Translation of Regenerative Cardiac Constructs. Progress in Pediatric cardiology. 35, (2013).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineering heart valves valve leaflet replacement study in a lamb model. The Annals of thoracic surgery. 60, S513-S516 (1995).
- Sodian, R., et al. Tissue engineering of heart valves in vitro experiences. The Annals of thoracic surgery. 70, 140-144 (2000).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model. Circulation. 94, II164-II168 (1996).
- Sodian, R., et al. Evaluation of biodegradable three dimensional matrices for tissue engineering of heart valves. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs. 46, 107-110 (1992).
- Sodian, R., et al. Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves). Circulation. 102, III22-III29 (2000).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
