Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Первичная культура Mouse дофаминергических нейронов

39.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51751

⸱

8 сентября 2014 г.

 ,  , 
1CNRS, UMR-5203, Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier, 2Inserm, U661, Montpellier, 3Universités de Montpellier

В этой статье

Краткое содержание

Дофаминергические нейроны играют жизненно важную регуляторную роль в мозге. Их потеря связана с болезнью Паркинсона. В этом видео мы покажем, как получить первичные культуры центральных дофаминергических нейронов из эмбрионального мезенцефалона мыши. Такие культуры полезны для изучения крайней уязвимости этих нейронов к различным стрессам.

Аннотация

Дофаминергических нейронов составляют менее 1% от общего количества нейронов в головном мозге. Это низкое количество нейронов регулирует важные функции мозга, такие как управление двигателем, мотивации и рабочей памяти. Нигростриатальных нейроны допаминергические выборочно вырождаются при болезни Паркинсона (PD). Эта прогрессивная потеря нейронов однозначно связаны с моторами симптомов патологии (брадикинезию, отдыхая тремор, и мышечная ригидность). Основной агент отвечает дофаминергической дегенерации нейронов до сих пор неизвестно. Тем не менее, эти нейроны, как представляется, чрезвычайно уязвимы в различных условиях. Первичные культуры представляют собой один из наиболее важных моделей для исследования свойств и характеристик дофаминергических нейронов. Эти культуры могут быть представлены в различных стрессовых агентов, которые имитируют PD патологии и нейропротекторами для того, чтобы остановить или замедлить дегенерации нейронов. Многочисленные трансгенные мышиные модели из PD, которые были Generованные в течение последнего десятилетия еще больше увеличило интерес исследователей для дофаминергических нейронов культур. Вот, протокол видео фокусируется на важных рассечения эмбриональных мозга мышей. Точное удаление вентральной среднего мозга имеет решающее значение для получения культур нейронов достаточно богатые дофаминергических клеток, чтобы позволить последующие исследования. Этот протокол может быть реализован с эмбриональными трансгенных мышей и подходит для иммунофлуоресцентного окрашивания, количественной ПЦР, второй мессенджер количественной оценки, или гибель нейронов / выживания.

Введение

Допамин, одним из важнейших нейротрансмиттеров мозга 1,2, в основном освобожден от дофаминергических нейронов среднего мозга (DA). Большинство нейронов да находиться в вентральной части среднего мозга 2-6. Схематически среднего мозга нейроны DA можно разделить на три анатомически и функционально различных проекционных систем: mesostriatal, мезолимбической и мезокортикальных пути 2,5. Нигростриатной путь участвует в поведении двигателя, мезолимбическом пути играют важную роль в армирования, мотивации, обучения и, в то время как дофаминергические пути выступающие в префронтальной коры головного мозга вовлечены в познании 2.

DA нейроны участвуют в нескольких неврологических расстройств человека, таких как шизофрения, синдром дефицита внимания, гипер расстройство деятельности, и болезнь Паркинсона (БП) 2,4. PD характеризуется прогрессивным и селективной дегенерации нейронов да соединяющей черной субстанцииPars компакты (SNC) в стриатуме. Потеря Nigro-полосатой да нейронов приводит к серьезному истощению дофамина в полосатом теле, который отвечает из двигательных симптомов БП (брадикинезия, опираясь тремор, и жесткость) 7. Начальное причиной идиопатической БП не было установлено, и в настоящее время лечение только симптоматическое, направленный на восстановление уровня допамина в полосатом теле. Наиболее предписано препарат L-ДОФА (леводопа), естественный предшественник дофамина. Хотя администрация леводопа компенсирует потерю допамина в течение определенного времени, осложнения моторные произойти после длительного лечения (дискинезия и включение / выключение состояния) 8,9.

Исследование дофаминергических нейронов и PD находится в постоянном прогрессии и интенсивные усилия к тому, чтобы развивать процедуры, основанные на трансплантации клеток, генной терапии, или нейропротекторы 10,11. Тем не менее, главной проблемой остается не-выяснено: то, что является причиной крайнего vulnerability из DA нейронов? Часть ответа можно найти в деятельности DA нейронов. Снижение электрической активности и возбудимости нейронов DA-видимому, чтобы увеличить их склонность к вырождению 12. Тем не менее, сложность PD патогенезе требует дальнейших исследований, чтобы определить механизмы, участвующие в DA нейроны дегенерации 13-15.

Первичные культуры особенно актуальны для изучения DA нейронов свойства 16-19 и оспорить эти нейроны в различных напряжений для оценки нейропротекторы 20-24. Модели крысы культуры чаще всего используются, как рассечение эмбриона крысы среднего мозга легче, по сравнению с мышью, и более высокие количества нейронов может быть получена на крысах. Однако поколение трансгенных мышиных моделях болезни 25 значительно возросла заинтересованность невролога сообщества для первичных культур от мыши 26-29. Хотя культур прepared от новорожденных животных можно использовать, лучше подготовить их из эмбрионов на пост-митотического этапе (E13.5 для среднего мозга нейронов), когда нейроны сохранили способности к дифференциации. Следующий протокол представляет изолированные среднего мозга нейроны в первичной культуре от эмбрионов мыши (E13.5), которые наиболее трудно получить. Примечательно, мы предоставляем протокол, используя бессывороточной культуральной среды для лучшего воспроизводимости. Два наиболее важных шагов в подготовке культуры (рассечение и механической диссоциации) будет тщательно описано в соответствующей видео.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Мыши, используемые в этой работе были заботятся и обрабатываются в соответствии с руководящими принципами Совета Европейского союза (86/609 / ЕС) для использования лабораторных животных.

1 Получение нужных решений

  1. Биржевые Решения
    1. 10x поли-L-орнитин (ООП) Решение: отвесить 10 мг гидробромида ООП (молекулярная масса = 30,000-70,000) и растворяют в 70 мл стерильной воды. Фильтр решение, используя 0,2 мкм шприцевой фильтр кратный, и хранить при температуре -20 ° C.
    2. 30% раствора глюкозы: отвесить 30 г D (+) - Глюкоза и растворить в стерильной водой до общего объема 100 мл. Фильтр, аликвоту, и хранят при температуре 4 ° С.
    3. Модифицированной среде Дульбекко 5x Игла (DMEM) / питательной смеси F-12 Ham: отвесить 6 г DMEM / F-12 Ham порошка и растворить в стерильной водой до общего объема 100 мл. Фильтр, аликвоту, и хранят при температуре 4 ° С.
    4. 7,5% бикарбонат натрия (NaHCO 3) Solutiна: взвесить 7,5 г NaHCO 3 и растворить в стерильной водой до общего объема 100 мл. Фильтр, аликвоту, и хранят при температуре 4 ° С.
    5. 1 М HEPES Решение: Взвесить 23,8 г HEPES и растворить в стерильной водой до общего объема 100 мл. Фильтр, аликвоту, и хранят при температуре 4 ° С.
    6. 70% (об / об) этанола: Развести 70 мл абсолютного этанола с 30 мл стерильной воды.
  2. Забуференный фосфатом физиологический раствор с глюкозой и антибиотики (PBS-GAB): добавляют 10 мл 30% раствора глюкозы и 5 мл пенициллина-стрептомицина раствора до 500 мл Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором. Хранить при 4 ° С.
  3. Инактивированной фетальной бычьей сыворотки (IFBS): Оттепель бычьей сыворотки в течение ночи при 4 ° С и инактивируют при 56 ° С в течение 30 мин. Алиготе в 50 мл и хранят при температуре -20 ° C.
  4. Культуральная среда: в стерильной воде, смешать последовательно 40 мл 5-кратным DMEM / Ham F12-1 мл 1 М HEPES, 2 мл 200 мМ L-глутамина, 2 мл пенициллина-стрептомицина, 4 мл 30% глюкозый 3 мл 7,5% NaHCO 3 до конечного объема 180 мл. Фильтр и использовать в тот же день.
  5. Гормон Mix
    1. Приготовьте 180 мл культуральной среды. Растворить 200 мг апо-трансферрина в этой среде.
    2. Взвесить 50 мг инсулина и растворяют в 2 мл 0,1 М HCl. Добавить медленно 8 мл стерильной воды при перемешивании осторожно. Развести это решение в культуральной среде.
    3. Взвесить 19,3 мг дигидрохлорида путресцина и растворяют в 10 мл стерильной воды. Добавить раствор 10 мл в смесь гормона.
    4. Подготовка 3 мМ раствор селенита натрия в стерильной воде и 2 мМ раствор прогестерона в абсолютном этаноле. Добавить 20 мкл каждого раствора в смесь гормонов.
    5. Фильтр смесь гормона, Алиготе в 10 мл и хранить при температуре -20 ° C.

2 Получение культуры пластин и инструменты

  1. FBS Покрытие из пластин культуры: За день до вскрытия, подготовки 180 мл культуральной среды. Добавьте 10 млIFBS в 90 мл культуральной среды. Добавить 300 мкл / лунку культуральной среды / 10% IFBS минуте поли-D-лизина вклеивания 24-луночных планшетах. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С. Хранить оставшиеся носители (с и без IFBS) при 4 ° С.
  2. Стерилизовать инструменты и пипетки Пастера. Соберите оборудование, указанное в материалах таблицы, а также класса II ламинаре и CO 2 инкубаторе.

3 Рассечение Mouse среднего мозга

  1. Жертвоприношение в E13.5 беременную мышь (в соответствии с ведомственным руководящим принципам). Очистите живот мыши с 70% этанола и открыть брюшную стенку. Соберите рога матки, открыть их с помощью деликатных ножницы, препарировать каждый эмбрион от рогов матки, и удалить амниотической мембраны. Поместите эмбрионов в 100 мм чашки Петри, содержащей стерильную ПБС-ГСЗ и мыть их переводом в 3 последовательных идентичных ванн с помощью щипцов. Для вскрытия, разместить эмбрионов на 3 в 60 мм стерильную чашку Петри.
  2. Movэлектронной окончательный чашку Петри под стереомикроскопом. Не обезглавить эмбрионов. Использование Vannas ножницы, вырезать мозги.
    1. Осторожно снимите и выбросьте передних и заднего мозга регионы. Для ростральной стороны, срезаны близко к таламуса области, до хвостового срезом на области перешейка, снимите верхний бугорок.
    2. После того, как брюшной средний мозг изолирован, тщательно удалить мозговые оболочки, используя ультра тонкий пинцет. Сбор рассеченные сегменты, без мозговых оболочек, в стерильную пробирку, заполненную 13 мл с PBS-GAB.
  3. Очистите трубку, содержащий mesencephala тщательно с 70% этанола и привести его под капотом.

4 диссоциации клеток

  1. Вымойте mesencephala 3x стерильной PBS-ГСЗ. Разрешить фрагменты мозга урегулировать между каждой стирки и избежать нарушения ткани. После последней промывки удалить как можно больше тщательно раствор, насколько это возможно, и инкубировать сегментов головного мозга в 3 мл трипсина / EDTA в течение 15 мин при 37 ° С вСО 2 инкубатора.
  2. Fire-польский Пастера пипетки, чтобы максимизировать выживание нейронов, как в конце не-полированного стекла пипетки остро и может привести к повреждению клеток во время стадий диссоциации. Слегка уменьшить диаметр верхней его части (до 0,5 мм) из пипетки Пастера в то время пожара полировки его.
  3. Осторожно снимите столько трипсин / ЭДТА решение как можно и добавить 10 мл культуральной среды / 10% IFBS. Вымойте сегменты мозга 3x с культурой средних / 10% IFBS.
  4. Использование огневой полировкой пипетки Пастера, начинают диссоциации mesencephala в 6 мл культуральной среды / 10% IFBS. Triturate 10x (избежать воздушных пузырей), позволяют куски урегулировать, то собрать среду в новой стерильной 13 мл трубки.
  5. Добавить 6 мл культуральной среды, повторите предыдущий шаг раз и собрать средства, содержащие разложенных клетки в той же пробирке 13 мл.
  6. Центрифуга клетки при 160 г в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в культуральной среде, содержащей10% гормона микс.

5 Сотовый Покрытие

  1. Граф клеток в суспензии в ячейку Malassez и регулировки громкости среде до концентрации 600000 клеток / мл. Около 1700000 клетки могут быть получены из одной мыши среднего мозга.
  2. Удалить ФБС, содержащего покрытия среды из 24-луночных планшетах и ​​добавить в каждую лунку 1 мл клеточной суспензии (600000 клеток / лунку, 2-4% от Th + клеток).
  3. Инкубируйте планшет при 37 ° С и 5% СО 2/95% воздуха. Нет среднего изменения не являются необходимыми. Дофаминергических нейронов являются зрелыми примерно через 5-7 дней в пробирке (последовательное выражение переносчика дофамина). Держите клеток в культуре до 15 дней без среднего замены.

6 Иммунофлуоресцентное протокол

  1. Очистка покровные
    1. За день до вскрытия, добавляют 10 мл 1 М HCl в чашку Петри. Lay на поверхности жидкости покровные стекла 12-15 и ждать 15 мин.
    2. Раковина крышкупроскользнуть в жидкости и ждать в течение 15 мин.
    3. Удалить HCl и промыть 3 раза водой.
    4. Промыть покровные быстро с чистым этанолом один раз, а затем добавить чистый этанол на блюдо и ждать в течение 30 мин.
    5. Под капотом, удалить очищенные покровные из этанола и добавьте 1 покровное на лунку для культивирования клеток пластины 12-скважины с использованием стерилизованные щипцы.
    6. Промывочный покровные два раза стерильной водой (1 мл / лунку). Тогда, мыть их раз стерильным PBS.
  2. Покрытие покровные
    1. Удалить PBS и добавляют 500 мкл / лунку 2 раза ООП (разбавленный в PBS). Инкубировать в течение 4 ч при 37 ° С в СО 2-инкубаторе.
    2. Снимите решение ООП и промыть 3 раза стерильной PBS.
    3. Удалить PBS и добавить 500 мкл / лунку 20% IFBS / 1 г / мл ЛАМИНИНА. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С в СО 2-инкубаторе.
  3. Покрытие клетки для иммунофлуоресценции
    1. Удалить покрытия среды из 12-луночных планшетах.
    2. Добавить 900,000 клеток / лунку в объеме 2 мл и роста клеток при 37 ° С в инкубаторе. Клетки могут быть сохранены в культуре до 15 дней без среднего замены.
  4. Иммуноокрашивание
    1. Удалить среды из 12-луночных планшетах и ​​промывают 500 мкл / лунку DMEM, предварительно нагретую при 37 ° С.
    2. Добавить 500 мкл / лунку DMEM предварительно нагревают при 37 ° С, а затем осторожно добавляют 160 мкл / лунку 8% параформальдегида (PFA, 2% конечная концентрация) и инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
    3. Удалить PFA и промыть 3 раза с PBS / 0,1 М глицина в течение 10 мин.
    4. Удалить PBS, добавляют 300 мкл / лунку PBS / 0,05% Тритона Х-100/20% козьей сывороткой и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.
    5. Удалить среды, добавляют 300 мкл / лунку первичного антитела разводили в PBS / 0,05% Тритона Х-100/1% козья сыворотка и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Первичные антитела, которые можно использовать для выявления дофаминергических нейронов и характеристик культуры, указаны в таблице материалов. Держите1 и без первичного антитела на предмет фоне различных вторичных антител.
    6. Удалить среды и промыть 3 раза с PBS / 0,2% желатина в течение 10 мин.
    7. Удалить среды, добавляют 300 мкл / лунку вторичное антитело разводили в PBS / 0,05% Тритона Х-100/1% козья сыворотка и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, в темноте. Вторичные антитела, используемые указаны в таблице материалов.
    8. Удалить среды и промыть 3 раза с PBS / 0,2% желатина в течение 10 мин.
    9. Удалить среднего и промыть 3 раза с PBS.
    10. Установите покровные на стороне стекла горки клеток вниз в капле Vectashield. Держите слайды при комнатной температуре в течение ночи, чтобы монтажную полусухое, хранить их при температуре 4 ° С.
    11. Получение изображений с помощью конфокальной микроскопии или фаза-контрастного микроскопа оборудованная для эпифлуоресцентной. Типичные изображения были приобретены с конфокальной микроскопии Leica SP2 УФ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Показано блок-схема последовательности этапов культуры среднего мозга показана на рисунке 1. Вкратце, после сбора эмбрионов E13.5 от беременной швейцарской мыши, вентральной среднего мозга иссекают из всего эмбриона. Выделенные фрагменты мозга последовательно представлены ферментативного расщепления и механической диссоциации. Диссоциированные клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в культуральной среде и высевали в предварительно покрытых пластин 12 или 24-луночных. Клетки поддерживают до...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол представляет процедуры и реагенты, необходимые для получения первичной культуры нейронов среднего мозга от эмбриональной мыши и процедуры иммунофлюоресценции для выявления дофаминергических нейронов. Критические этапы процедуры являются рассечение эмбрионов и механическая диссоциация собранных фрагментов мозга. Высокие рассечение инструменты качества помогает освоить технику вскрытия. DA нейроны составляют небольшую долю среднего мозга. Соответственно, сбор правую часть брюшной среднего мозга имеет важное ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

При поддержке грантов CNRS и INSERM. Премьер-министр выражает признательность за поддержку со стороны Фонда медицинских исследований во Франции (Equipe FRM 2009). SC выражает признательность за поддержку со стороны Фонда Франции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фетальная бычья сывороткаLonza14-801F
DMEM 4,5 г/л глюкоза с L-глутаминомLonzaBE12-604F
0,05% Трипсин-ЭДТА (1x), фенол красныйLife Technologies25300-054
Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл)Life Technologies15140122
L-глутамин, 200 мМ растворLife Technologies
Дульбекко» s Фосфатный буферный физиологический растворSigma-Aldrich D8537
Дульбекко s Модифицированный Eagle' s Смесь сред/питательных веществ F-12 ВетчинаSigma-Aldrich D0547Порошок
ламинина - 1 мг/мл в трис-буферизованном NaClSigma-Aldrich;L2020
Поли-L-орнитин гидробромидSigma-Aldrich P3655
Инсулин из поджелудочной железы свиньиSigma-Aldrich I5523
апо-Трансферрин человеческийСигма-Олдрич T1147
Путресцина дигидрохлоридSigma-Aldrich P5780
Прогестеронсигма-Олдрич P8783
Селенит натрияSigma-Aldrich S5261
HEPESСигма-Олдрич H4034 
ГлицинСигма-Олдрич G7126Стоковый раствор 1 м в воде
Желатин Sigma-Aldrich G9391Стоковый раствор 2% (мас./об.) в воде
Triton X-100Sigma-Aldrich T8532
Параформальдегид 16% в водеЭлектронная микроскопия наукиRT 15710-S
Бикарбонат натрия (NaHCO3)Merck Millipore106329
D(+)-глюкоза, моногидратMerck Millipore4074-2
Соляная кислота - c(HCl) = 1 моль/л (1 N) ТитрипурMerck Millipore109057
Вода стерильная - Aqua B. Braun Braun
Этанол абсолютный NORMAPUR аналитический реактивVWR20821.321
Стерильные чашки ПетриVWR82050-566
Пастеровские пипетки простого стекла - Wilhem Ulbrich GdbR.VWR612-2297
Счетная камера MalassezVWR631-0975
Сыворотка Acrodisc Шприцевой фильтр с мембраной Supor, стерильный, GF/0.2 &; m, 37 ммPALL Life science4525
Хирургические ножницы - Прямые, острые-острые, длиной 14,5 смИнструменты для тонкой науки14002-14Для вскрытия брюшной стенки
Ножницы - Прямые, заостренные, нежные, длиной 10 смMORIA4877AДля вскрытия стенки матки
Щипцы - Изогнутые, обычные, зубчатые челюсти 1 ммMORIA2183Для манипуляций с эмбрионами
Ножницы Vannas - Изогнутые, заостренные, лезвия 7 ммMORIAMC50Для извлечения мезенцефалона
Ультратонкие щипцы - Изогнутые, нежные, длиной 13 смMORIA9987Для удаления мозговых оболочек
BD BioCoat Poly-D-лизин 24-луночные многолуночные пластиныBD Bioscience356414
BD Falcon 12-луночный планшет для клеточной культуры, плоскодонный с крышкойBD Bioscience353043
Предметные стекла микроскопа SuperFrost, шлифовальные края 90°ordm;MENZEL-GLÄ SERAG00008032E
Прецизионная крышка стекла толщина No 1,5H круглая 18 мм øMARIENFELD117580
Поликлональное антитело кролика к микротрубочкам-ассоциированному белку 2 (MAP2)Chemicon MilliporeAB56221/200
Антитело моноклональной мыши к антиглутаматдекарбоксилазе (GAD67), клон 1G10.2Chemicon MilliporeMAB54061/400
Антитело к моноклональному крысиному транспортеру (DAT), клон DAT-Nt Chemicon MilliporeMAB3691/500
Моноклональное мышиное антитело1/8,000 - Щедрый подарок от Ива Шарне (Швейцария, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Козья сыворотка, Новая Зеландия OriginLife Technologies16210-064
Alexa Fluor 405 Козий антикролик IgG (H+L) АнтителаLife TechnologiesA-315561/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) АнтителаLife TechnologiesA-110011/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-крысы IgG (H+L) АнтителаLife TechnologiesA-110071/1,000
VECTASHIELD HardSet Крепление MediumVector LaboratoriesH-1400
СтереомикроскопCarl Zeiss МикроскопияStemi-2000C
Bunsen Горелка FIREBOYВВР451-0136
25030123 к 5-HT

Ссылки

  1. Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
  2. Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
  3. Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
  4. Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
  5. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  6. Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
  7. Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson's disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
  8. Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
  9. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
  10. Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
  11. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
  12. Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
  13. Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
  14. Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
  15. Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson's disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
  16. di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
  17. Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
  18. Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
  19. Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
  20. Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
  21. Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
  22. Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
  23. Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
  24. Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
  25. Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
  26. Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
  27. Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
  28. Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
  29. Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
  30. Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  31. Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
  32. Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
  33. Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
  34. Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
  35. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
  36. Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Головной мозг эмбриона мышидиссекция среднего мозгаферментативная диссоциациямеханическая диссоциацияиммунофлуоресцентное окрашиваниетирозингидроксилазапосев клетоккультуральная среда
Первичная культура Mouse дофаминергических нейронов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.