Была разработана с высокой пропускной анализ, чтобы в пробирке фенотипа сальмонеллами или другой бактериальной ассоциации, вторжения и репликации в фагоцитов с высокой пропускной способностью. Метод был использован для оценки Salmonella ген нокаут мутантных штаммов для их вовлеченности в хозяин-патоген взаимодействий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокая пропускная Анализ фенотипу Salmonella enterica Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Salmonella виды патогенов и ведущими причинами продуктами болезней у людей и скота 1. Понимание механизмов, лежащих в основе сальмонеллы -host взаимодействия важны для выяснения молекулярного патогенеза сальмонеллеза. Анализ защиты гентамицин фенотипу Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в фагоцитирующих клеток был адаптирован, чтобы позволить высокой скрининг для определения роли мутантов с делецией Salmonella enterica серотипа Typhimurium в принимающих взаимодействий с использованием RAW 264,7 мышиных макрофагов. Согласно этому протоколу, дисперсию измерений существенно снижается по сравнению со стандартным протоколом, так как дикого типа, и множество мутантные штаммы могут быть проверены в той же культуральной чашке, и в то же время. Использование многоканальных пипеток увеличивает пропускную способность и повышает точность. Кроме того, опасения в связи с использованием менее хоул клеток на лунку в культуральной чашке 96-а были адресованы. Вот, протокол модифицированного пробирке Salmonella вторжения анализа при помощи фагоцитоза клетки был успешно применен для фенотип 38 индивидуальных Salmonella делеционных мутантов для объединения, вторжения и внутриклеточной репликации. В фенотипы в пробирке представлены, некоторые из которых впоследствии были подтверждены, чтобы иметь в естественных фенотипов в животной модели. Таким образом, изменение, стандартные тесты на фенотип Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в макрофагах с высокой пропускной мощности могут быть использованы в более широком смысле для изучения бактериально-хост взаимодействий.
Введение
Nontyphoidal Salmonella являются важными причинами кишечных заболеваний у всех позвоночных. Сальмонеллез у человека является одним из главных бактериальных болезней пищевого происхождения 1. Характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия Salmonella со своими хозяевами животных в основном достигается через изучение Salmonella enterica серотипа Typhimurium (СТМ) в культуре ткани и животных моделях инфекции. Получение понимание в STM-хост взаимодействий поможет нам понять, как Salmonella выжить и развиваться внутри клеток-хозяев. Первая задача в изучении этих взаимодействий является определить, как много участвующих факторов, а от хозяина и патогена, но эти усилия в значительной степени препятствуют значительные трудности дело с двумя независимыми сложных биологических систем одновременно, то есть, хост и сальмонеллы, при физиологических условиях. Кроме того, большое Repertoire сальмонеллы и гены хозяина потенциально кодирующие факторы, участвующие в принимающих взаимодействий требуют высокой пропускной биологическую платформу для решения этой проблемы.
Изменение, стандартные тесты на фенотип Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в макрофагах с высокой пропускной способностью был разработан для изучения большой набор генов, вероятно, занимающихся Salmonella -host взаимодействий. Анализ защиты гентамицин был разработан в 1973 году 2, но впервые была тщательно описывается Elsinghorst в 1994 3,4. Теперь это стало стандартным инструментом для изучения многих внутриклеточных бактериальных патогенов экс естественных условиях, в том числе сальмонеллы 5,6. Интернализованная бактерии избегают гибели от некоторых антибиотиков, таких как гентамицин, что не могут проникнуть эукариотических клеток 3. Воспользовавшись этим явлением, анализ защиты гентамицин измеряет выживания и роста внутриклеточных баcterial патогены. Три события в период инфекции, т.е. связь с эукариотических клеток, инвазии и репликации, может быть оценена для внутриклеточных бактериальных патогенов на основе временного интервала между инфекции, лечения гентамицин, и дальнейшей инкубации (рисунок 1). Эукариотической клетки линии обеспечивают физиологическую среду, которая является менее сложным, чем соответствующих животных моделях для исследования взаимодействия хост-патогена.
Защита анализа Гентамицин является подходящей платформой для изучения СТМ-хост взаимодействий, но стандарт анализа в культуральной чашке 24-луночного имеет низкую пропускную способность. Автоматическая обработка естественных условиях наборов данных в идентифицированы 149 генов сальмонеллы продукты, которые, по прогнозам, взаимодействовать с приблизительно 300 генов хозяина продукции (неопубликованные данные). Стандарт гентамицин анализ защиты не имеют возможности фенотип это число мутантов эффективно.
В Additионный, анализ защиты гентамицин теоретически может обнаружить вторжение даже одной бактерии. Из этой присущей чувствительности, необработанные данные восприимчивы к техническим дисперсий, когда повторяется в разные моменты времени. Внутренние органы управления и относительная представление данных после нормализации имеют важное значение для содержательной интерпретации результатов. Учитывая эти соображения, изменение, стандартизированная гентамицин защиты был разработан анализ, чтобы добавлять потенциала по тестированию и повышают точность.
Следующий протокол подробно и показано для выполнения измененного гентамицина защиты анализа, используя блюда культуры 96-а и мышиный линию макрофагов RAW264.7 клеток. По сравнению со стандартным протоколом в чашки для культивирования с 24 лунками, модифицированный протокол имеет следующие преимущества: 1) Использование тарелки культуры 96-а позволяет до 10 различных мутантных штаммов, которые будут phenotyped в том числе внутренних положительных и отрицательных контролей с достаточной статистической мощности;2) Дисперсия результатов значительно снижается, потому что мутантные штаммы тестируют в той же культуральной чашке, и в то же время; 3) Использование многоканальных пипеток увеличивает пропускную при одновременном снижении утомляемости оператора. Наконец, по сравнению с блюдами культуры 24-а, опасения менее клетках-хозяевах на лунку в культуральной чашке 96-а были адресованы путем оптимизации протокола и стандартизации.
Таким образом, изменение, стандартные тесты, чтобы в пробирке фенотипа Salmonella или другой бактериальной ассоциации, инвазию и репликации в фагоцитирующих клеток повышает точность и достигает высокой пропускной способности при одновременном снижении усталости оператора.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 Мышиные макрофагов RAW264.7 Культура клеток
- Grow с низким числом пассажей мышиных макрофагов, RAW264.7 (АТСС номер ®, TIB-71) в Т-75 колбу для культивирования клеток вентилируемые крышки фильтра в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , 0,5% NaHCO 3, и 1% 100x заменимые аминокислоты (NEAA) при 37 ° С, в 5% CO 2 инкубаторе.
- После того, как клетки достигают 60-80% слияния в колбе, использовать клеточным скребком для сбора клеток и подсчета клеток в гемацитометре и рассчитать концентрацию клеток.
- Ресуспендируют клеток и разбавить концентрацию клеток в 2,5 х 10 5 / мл в свежей DMEM среде для культивирования клеток. Использование многоканальные пипетки к пластине 200 мкл DMEM клеточной культуральной среде, содержащей 5 × 10 4 клеток в каждую лунку клеточных культур 96-луночных планшетах.
- Тарелка четыре лунки каждого штамма Salmonella. Настройте три отдельные пластины для одного наборафагоцитарной клетки вторжения анализа, и отмечать их с "ассоциации", "вторжения" и "репликации", соответственно.
- Место пластин в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C ON, чтобы позволить макрофагов клеткам прикрепляться к нижней части скважины.
2 Получение Salmonella дикого типа и мутантов
- В тот же день подготовки макрофагов RAW264.7 клетки, подобрать отдельных колоний дикого типа (WT) Salmonella enterica серотипа Typhimurium 14028s, DinvA мутантные, DphoP мутантные, и желаемые штаммы тест мутантные, и культура их в Лурия-Bertani ( LB), в бульоне с добавлением антибиотиков по мере необходимости. С помощью каждого набора из фагоцитирующих клеток вторжения анализов, чтобы проверить до 10 мутантных штаммов (DinvA мутанта и DphoP мутант являются дефектными в инвазии и внутриклеточной репликации, соответственно).
- Расти бактерии в течение 14 ч при 37 ° С с Shaking при 220 оборотах в минуту в 5 мл каждого из LB бульоне в слабо ограничен 14 мл полипропилена в трубе с круглым дном. LB бульон содержит соответствующие антибиотики, в нашем случае, большинство мутантных штаммов устойчивы к канамицину, 50 мкг / мл
- На следующий день, субкультура каждый из О культур штаммов Salmonella в равнинных 5 мл LB бульонов в соотношении 1:50 в течение дополнительного 4 ч при встряхивании при 220 оборотах в минуту.
- Считайте ОП 600 значения каждого бактериальной культуры на спектрофотометре, и каждый чтения должна составлять от 0,6-1,2 оптимизировать Salmonella патогенности остров-1 Тип III системы секреции (SPI-1 ЧТС) экспрессию генов для вторжения.
- С помощью формулы 1 OD 600 = 7,5 х 10 8 КОЕ / мл для оценки бактериальной концентрации, а затем разбавленным бактерий в концентрации 5 × 10 6 КОЕ / мл в свежей DMEM среде для культивирования клеток.
3 Вторжение анализа в культуре 96-луночного планшета
- Удалите три CEL 96-ал культуральные планшеты от CO 2 инкубаторе и мыть каждый хорошо раз с 200 мкл 1x PBS буфера.
- После промывки и полного удаления PBS, 200 мкл бактерий в среде DMEM (смотри выше) в каждую лунку. Это приводит к 1 × 10 6 Salmonella клеток в каждой лунке и множественности инфекции (MOI) 20: 1.
- Центрифуга пластин при 1000 мкг в в запечатанном перевозчика в течение 10 мин, затем заменить пластины (нулевое время) в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора в течение 30 мин. Для каждого штамма, настроить по меньшей мере четыре дублирующих скважин.
- Через 30 мин удалить пластины из инкубатора и мыть три раза 200 мкл 1х PBS, чтобы удалить связанные с отпе- чатками бактерии.
- После мытья, сохранить пластину с надписью с "ассоциации" для дальнейшего лечения. Добавить 200 мкл DMEM среде, содержащей 100 мкг / мл гентамицина в каждую лунку на планшетах со значком "вторжения" и "репликации" для того, Tо убить внеклеточный сальмонеллы. Вернуться пластин до 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора для дополнительного часа.
- Сохранить один хорошо от каждого зараженного штаммом для записи количество макрофагов клеток, лечения остальную часть скважин на "объединение" пластины с 200 мкл 1x PBS, содержащим 1% Triton X-100 в течение 10 мин. Решение Triton будет лизировать макрофагов клетки и выпустить связанный сальмонеллы.
- Урожай сальмонеллы из каждой лунки и поместить их в 1,5 мл пробирки Эппендорфа. Выполнение три 10-кратный серийных разведений с 900μl 1x PBS на собранных образцов из каждой лунки, вихревое выполняется между каждого разведения.
- Тарелка третий разбавление, 10 -3, по обе LB (WT) или LB Кан (мутанты) пластин. Этикетка плиты с соответствующим названием Salmonella штамма, номер разбавления, момент времени и даты.
- После встряхивания третий трубку разбавления, обойтись образца 10 мкл на поверхность агара и повторного Fнаши раз в общей сложности 5 капель. Обязательно пространстве пять 10 мкл капли равномерно на блюдо чашки Петри 7.
- После капель впитаться в агаре, повернуть пластины снова и инкубировать в течение ночи при 37 ° С, 5% СО 2 инкубаторе.
- Treat скважин, сохраненные для подсчета макрофагов с 150 мкл 1xPBS, содержащей 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 10 мин.
- После обработки трипсином, макрофаги место в 1,5 мл пробирки Эппендорфа и относиться к ним с 50 мкл ФБС, чтобы нейтрализации трипсина / EDTA раствора, краситель клеток с 0,4% трипанового синего и оценка их через помощью гемацитометра.
- Когда один час инкубации истекло, удалить "вторжение" и "репликации" тарелки из CO 2 инкубаторе, и мыть каждый также "Шаг 3,4".
- Сохраните "вторжение" пластины для дальнейшего лечения, как "Шаг 3.6-3.12".
- Добавить 200 мкл DMEM, содержащей 10 мкг / мл гентамицина к"репликация" пластина для поддержания зазора внеклеточного Salmonella в среде. Вернуться пластину до 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора для дополнительного 22,5 часов.
- На следующий день, удалить "репликации" тарелку от 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора, и мыть каждый также "Шаг 3,4" и рассматривать их как "Шаг 3.6-3.12".
- Наконец, удалите агаром после инкубации в течение ночи в 37 ° С инкубатор и забьет количество бактериальных колоний.
- Хорошее распределение колония должна быть между 10 и 100 колоний, каждое пятно примерно содержит от 2 до 20 колоний, было бы трудно забить, если бы было больше, чем 20 колоний на одном месте. Если количество слишком низко или слишком высоко, replate образца с 10-кратным высокие или более низкие разведения по мере необходимости.
Анализ 4. данных
- Вычислить (единиц формирования колонии на мл) КОЕ каждого пластины, основанные на обшивкеОбъем и коэффициент разбавления.
- Определить количество Salmonella в макрофагах путем записанного подсчета клеток макрофагов из каждого штамма.
- Рассчитать геометрические средства КОЕ на макрофагах, по крайней мере в трех независимых экспериментах на ассоциации клеток, инвазии или репликации, соответственно, и нормализовать дальше на WT для относительной стоимости.
- Проанализируйте данные для объединения, вторжения и репликации от Студенческого т -test соответственно, путем сравнения каждого штамма к WT, и определения статистической значимости по р-значение.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Смотреть репрезентативные результаты (Рисунок 2) после того, как данные представлены на основе модифицированного фагоцитарной вторжения клеток анализа. Данные включают в себя пять различных штаммов, Вт, ΔinvA, ΔphoP, мутант A, и мутант Б. Δ Инва, как известно, неисправен для вторжения, и ΔphoP известные дефектным для репликации 8, используются в качестве положительного контроля для оценки экспериментального действительность . В самом деле, в модифицированном вторжен...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ защиты Гентамицин широко используется для изучения вторжение и репликации внутриклеточных бактериальных патогенов внутри клетки-хозяина, и это особенно важным биологическим инструментом для изучения патогенов, как сальмонелла, чьи вторжение является предпосылкой шаг для установления инфекции 1. Стандартный анализ защиты Гентамицин в Salmonella научного сообщества реализован в культуральной чашке 24-луночного 5. Хотя использование 48 или даже 96-луночных планшетах были обсуж...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Этот проект был поддержан частично грантом на Национальных Институтов здравоохранения NIAID (для AJB и LGA, R01 AI076246). Мутант коллекция Salmonella была частично поддержана Национальными Институтами грантов здравоохранения (для ММ, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 и R01 AI075093-01), частично Национальными Институтами грантов здравоохранения (для ГАП, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Мы благодарим Штеффен Prowollik для реплик и подтверждения мутантов в коллекции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Фетальная бычья сыворотка | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 Колба для клеточных культур вентилируемая крышка фильтра | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100x заменимых аминокислот | Life Technologies | 11140 | |
| Скребок для клеток | BD Falcon | 353086 | |
| 96-луночный планшет для клеточных культур | Corning Incorporated | 3595 | |
| Бульон Лурия-Бертани (LB) | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 мл Полипропиленовая трубка с круглым дном | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH 7,4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Канамицин раствор | Sigma | K0254 | |
| Раствор гентамицина | Sigma | G1272 | |
| 0,25% Трипсин-ЭДТА | Life Technologies | 25200 | |
| Трипановый синий | Sigma | T8154 |
Ссылки
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869(2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
