Была разработана с высокой пропускной анализ, чтобы в пробирке фенотипа сальмонеллами или другой бактериальной ассоциации, вторжения и репликации в фагоцитов с высокой пропускной способностью. Метод был использован для оценки Salmonella ген нокаут мутантных штаммов для их вовлеченности в хозяин-патоген взаимодействий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокая пропускная Анализ фенотипу Salmonella enterica Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Salmonella виды патогенов и ведущими причинами продуктами болезней у людей и скота 1. Понимание механизмов, лежащих в основе сальмонеллы -host взаимодействия важны для выяснения молекулярного патогенеза сальмонеллеза. Анализ защиты гентамицин фенотипу Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в фагоцитирующих клеток был адаптирован, чтобы позволить высокой скрининг для определения роли мутантов с делецией Salmonella enterica серотипа Typhimurium в принимающих взаимодействий с использованием RAW 264,7 мышиных макрофагов. Согласно этому протоколу, дисперсию измерений существенно снижается по сравнению со стандартным протоколом, так как дикого типа, и множество мутантные штаммы могут быть проверены в той же культуральной чашке, и в то же время. Использование многоканальных пипеток увеличивает пропускную способность и повышает точность. Кроме того, опасения в связи с использованием менее хоул клеток на лунку в культуральной чашке 96-а были адресованы. Вот, протокол модифицированного пробирке Salmonella вторжения анализа при помощи фагоцитоза клетки был успешно применен для фенотип 38 индивидуальных Salmonella делеционных мутантов для объединения, вторжения и внутриклеточной репликации. В фенотипы в пробирке представлены, некоторые из которых впоследствии были подтверждены, чтобы иметь в естественных фенотипов в животной модели. Таким образом, изменение, стандартные тесты на фенотип Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в макрофагах с высокой пропускной мощности могут быть использованы в более широком смысле для изучения бактериально-хост взаимодействий.
Введение
Nontyphoidal Salmonella являются важными причинами кишечных заболеваний у всех позвоночных. Сальмонеллез у человека является одним из главных бактериальных болезней пищевого происхождения 1. Характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия Salmonella со своими хозяевами животных в основном достигается через изучение Salmonella enterica серотипа Typhimurium (СТМ) в культуре ткани и животных моделях инфекции. Получение понимание в STM-хост взаимодействий поможет нам понять, как Salmonella выжить и развиваться внутри клеток-хозяев. Первая задача в изучении этих взаимодействий является определить, как ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 Мышиные макрофагов RAW264.7 Культура клеток
- Grow с низким числом пассажей мышиных макрофагов, RAW264.7 (АТСС номер ®, TIB-71) в Т-75 колбу для культивирования клеток вентилируемые крышки фильтра в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , 0,5% NaHCO 3, и 1% 100x заменимые аминокислоты (NEAA) при 37 ° С, в 5% CO 2 инкубаторе.
- После того, как клетки достигают 60-80% слияния в колбе, использовать клеточным скребком для сбора клеток и подсчета клеток в гемацитометре и рассчитать концентрацию клеток.
- Ресуспендируют клеток и разбавить концентрацию клеток в 2....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Смотреть репрезентативные результаты (Рисунок 2) после того, как данные представлены на основе модифицированного фагоцитарной вторжения клеток анализа. Данные включают в себя пять различных штаммов, Вт, ΔinvA, ΔphoP, мутант A, и мутант Б. Δ Инва, как известно, неисправен для вторжения, и ΔphoP известные дефектным для репликации 8, используются в качестве положительного контроля для оценки экспериментального действительность . В самом деле, в модифицированном вторжен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ защиты Гентамицин широко используется для изучения вторжение и репликации внутриклеточных бактериальных патогенов внутри клетки-хозяина, и это особенно важным биологическим инструментом для изучения патогенов, как сальмонелла, чьи вторжение является предпосылкой шаг для установления инфекции 1. Стандартный анализ защиты Гентамицин в Salmonella научного сообщества реализован в культуральной чашке 24-луночного 5. Хотя использование 48 или даже 96-луночных планшетах были обсуж.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Этот проект был поддержан частично грантом на Национальных Институтов здравоохранения NIAID (для AJB и LGA, R01 AI076246). Мутант коллекция Salmonella была частично поддержана Национальными Институтами грантов здравоохранения (для ММ, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 и R01 AI075093-01), частично Национальными Институтами грантов здравоохранения (для ГАП, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Мы благодарим Штеффен Prowollik для реплик и подтверждения мутантов в коллекции.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Фетальная бычья сыворотка | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 Колба для клеточных культур вентилируемая крышка фильтра | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100x заменимых аминокислот | Life Technologies | 11140 | |
| Скребок для клеток | BD Falcon | 353086 | |
| 96-луночный планшет для клеточных культур | Corning Incorporated | 3595 | |
| Бульон Лурия-Бертани (LB) | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 мл Полипропиленовая трубка с круглым дном | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH 7,4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Канамицин раствор | Sigma | K0254 | |
| Раствор гентамицина | Sigma | G1272 | |
| 0,25% Трипсин-ЭДТА | Life Technologies | 25200 | |
| Трипановый синий | Sigma | T8154 |
Ссылки
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsingh....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
