Method Article

Бусы агрегации Анализы для характеристики Предполагаемые клеточной адгезии молекул

DOI:

10.3791/51762

⸱

October 17th, 2014

 , 
1Department of Neuroscience, Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем простой и быстрый метод характеристики внутренних адгезивных свойств предполагаемых молекул клеточной адгезии. Секретируемый, помеченный эпитопами эктодомен молекулы клеточной адгезии захватывается из питательной среды на небольших, однородных функционализированных гранулах. Эти шарики затем могут быть немедленно использованы в простых анализах агрегации гранул.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Межклеточной адгезии является основополагающим для многоклеточных организмов и опосредуется множеством разнообразных белков клеточной поверхности. Тем не менее, адгезивные взаимодействия для многих из этих белков, плохо понимал. Здесь мы представляем простой, быстрый метод для определения характеристик адгезионных свойств предполагаемых гомофильной молекул клеточной адгезии. Культивируемые клетки НЕК293 трансфицировали плазмидой ДНК, кодирующую секретируемый, эпитоп-меченый эктодомен белка клеточной поверхности. Использование функционализированных шарики специфичными к эпитопу тега, растворимый, слитый белок, секретируемый захватывается из культуральной среды. Шарики с покрытием затем может быть использован непосредственно в бортовых агрегации анализов или в флуоресцентного шарик сортировки анализов для проверки гомофильной адгезии. При желании, мутагенез может быть использован для выяснения специфические аминокислоты или домены, необходимые для сцепления. Этот анализ требуется только небольшое количество экспрессированного белка, не требует производства стабильных клеточных линий, и может быть АККОmplished в 4 дня.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Межклеточной адгезии имеет важное значение для развития и целостности многоклеточных организмов и опосредуется множеством разнообразных молекул клеточной поверхности. Многие из этих молекул адгезии были идентифицированы и охарактеризованы, хотя многие должны быть еще открыты. Некоторые методы используются для изучения свойств молекул клеточной адгезии (-кам), в том числе клеточных сортировки анализов, агрегации клеток анализов 1-8 и биофизических методов, таких как атомно-силовой микроскопии и поверхности силовой спектроскопии 9-12.

Сложность даже упрощается в системах пробирке с использованием линий клеток делает его трудно определить адгезионные свойства предполагаемого CAM. Как правило, молекулы считается САМ, если он вызывает агрегацию клеток при трансфекции в не-клейкой клеточной линии. Тем не менее, очевидно, что это не прямое свидетельство адгезивной активности. Например, облегчая доставку клеточной поверхности или стабильностьCAM также привести к увеличению агрегации клеток 1,13. Кроме того, настоящий САМ может не опосредуют агрегацию клеток, если линия клеток не хватает других сопутствующих факторов, необходимых для доставки на клеточной поверхности или стабилизации.

Чтобы избежать этих усложняющих факторов, более прямые анализы могут быть использованы, которые основаны на идее о том, что адгезивные взаимодействия должны быть неотъемлемой биохимические свойство внеклеточного домена. В то время как бусины первоначально использовались для характеристики NG-CAM 2, эти анализы были расширены с целью изучения кадгеринов-опосредованной адгезии 12,14,15. Использование слияние C-кадгерина эктодомен-Fc слияния, лаборатория Gumbiner показали, что несколько повторов кадгерином способствовать гомофильной взаимодействия 14. Использование сопоставимых агрегации шарик анализов, E-кадгерина и N-кадгерина адгезии также характеризуется 12,15, а есть ряд protocadherins 1,15-18 и DSCAM изоформ от дрозофилы 19. Здесь мы опишем относительно простой и быстрый анализ для характеристики адгезивную активность секретируемых, эпитоп-тегами эктодоменов предполагаемых гомофильной САМ (рисунок 1). Мы использовали эту пробу, прежде всего характеризовать членов суперсемейства кадгерина.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Приготовление клеток (День -2 до 0)

  1. Сплит НЕК293 1: 5, используя 0,05% раствора трипсина-ЭДТА и инкубировать в ростовой среде при 37 ° С с 5% CO 2 до 60 - 80% сливной (2 - 3 дней). Для каждого состояния, культуры клеток в 2 х 100-мм чашек.

2 трансфекции клеток (день 1)

  1. Трансфекции клеток НЕК293 с плазмиды, кодирующей Fc-слияния, используя реагента для трансфекции, такие как Lipofectamine. Также могут быть использованы альтернативные способы, которые приводят к повышению эффективности трансфекции сопоставимых.
  2. Вернуться трансфекции клеток в инкубаторе в течение 24 часов.

3 Cell Распространение (День 2)

  1. Разогреть Рост Медиа без эмбриональной телячьей сыворотки (-FBS) до 37 ° С.
  2. Промыть блюда 2x с 10 мл питательной среды -FBS, и вернуть посуду в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
  3. Промойте культур блюда еще раз с 10 мл питательной среды -FBS, в общей сложности 3 стирок.
  4. INCUБАТЭ трансфектированные НЕК293 при 37 ° С для другого 48 часов без FBS до сбора средств массовой информации.

4 из бисера Объединение (День 4)

  1. Для сбора средств массовой информации от чашек для культивирования, передачу мультимедийных файлов из каждой пары блюд до 50 мл конические пробирки и спиновых при 500 мкг в течение 5 мин для осаждения остатков клеток.
  2. Фильтрующие материалы от 50 мл коническую трубку в центробежный фильтр с помощью шприца 30 мл и шприц фильтр 0,45 мкм.
  3. Спин центробежные фильтры на 4000 мкг и 4 ° С до объема концентрированной культуральной среде не примерно 500 мкл (примерно 15 мин). Повторяйте, пока не была добавлена ​​вся культура СМИ и концентрируют.
  4. Добавить 1,5 мкл белка G магнитных шариков с 1 мл охлажденного льдом буфера для связывания в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для каждого образца, месте на магните и удалить буфер. Сразу добавить концентрированный питательных сред с белком G магнитных шариков.
  5. Поворот трубы при 4 ° С в течение 2 часов.
  6. Plтуз трубки на магнит и не извлекайте носитель. Быстро мыть шарики дважды ледяной 1 мл буфера для связывания, а затем ресуспендируют бусины в 300 мкл буфера для связывания.
  7. Сплит ресуспендировали бусы на 2 трубки, 150 мкл в каждую пробирку, а затем добавить 1,5 мкл 200 мМ CaCl 2 или 200 мМ ЭДТА для "кальция" и "нет кальция» условиях, соответственно.
  8. Передача 100 мкл из каждой состоянии депрессии хорошо скользить и собирать микрофотографии с помощью микроскопа проходящего света (рисунок 2). Сбор изображений с 5 полей зрения для каждого эксперимента на каждом нужной точке времени.

Анализ 5. данных

  1. Использование ImageJ или сопоставимое программное обеспечение для анализа изображений, открытый одним из пяти изображений наборов данных с использованием Импорт / последовательности изображений ... из выпадающего меню Файл. Они будут открыты в качестве стека изображений.
  2. В ... диалогового окна Image / Свойства измените Iмаг единиц в пикселях и установить Pixel Ширина и Pixel Высота до 1,0.
  3. Преобразовать образы в двоичную систему с помощью Adjust / Threshold ... команду в меню Image выпадающем. Установите порог включить пикселей, которые способствуют шариков или бортовых агрегатов, но, что исключает фон и мелких частиц. Применить ко всем изображениям в стеке.
  4. В диалоговом Измерения Box Set, флажки Площадь и Stack положении.
  5. Запустите анализировать частицы ... в Анализировать выпадающее меню. Это создаст перечень выявленных частиц, в том числе их размера (площади) и изображения, в котором они были определены.
  6. Повторите этот процесс, для которого эксперимент и экспериментальное условие.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пример эксперимента представлены на рисунке 2, который показывает кальций-зависимую агрегацию шарик по эктодомена N-кадгерина, слитого с Fc (NcadEC-Fc). В отсутствие кальция, шарики обладают практически не тенденцию к агрегации и нет увеличение совокупного размера с течением времени (фиг.1А, С). В присутствии кальция, гранулы, покрытые NcadEC-Fc-шоу надежной агрегации, с совокупный размер увеличивается с течением времени (Фиг.1В, С). Этот эксперимент был повторен три ра...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная адгезия является существенным признаком многоклеточных и опосредуется широким кругом белков клеточной поверхности. Из них подробные адгезионные свойства понимаются только сравнительно небольшая часть. Здесь мы описали простой, быстрый протокол для исследования гомофильной адгезию секретируемых эктодоменов слитых в удобное эпитопной меткой. Этот подход имеет ряд важных преимуществ. Прежде всего, стабильные клеточные линии, не требуется 14,20, так как достаточное количество белка могут быть получены п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана премией NSF/ARRA (IOS 0920357) и премией от NIH (5R21MH098463).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
pFc-N1 плазмидаAddgeneПодлежит отправке
HEK293 клеткиAmerican Type Culture CollectionCRL-1573
DMEMMediatech - Corning10-013-CV
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaF2442
100x Pen-Strepping (10,000 Ед/мл)Life Technologies15140-122
0.05% Трипсин-ЭДТАLife Technologies25300054
Lipofectamine 2000Life Technologies11668030
Dynabeads – Protein GLife Technologies10003D
Бычья сыворотка АльбуминSigmaA3294
Депрессионные слайдыЭлектронная микроскопия Sciences71878-06
Amicon Ultra-15 Центробежный фильтрующий блок с мембраной Ultracel-10MilliporeUFC901024
0,45 мм шприцевой фильтрSarstedt83.1826
Dynamag-2 MagnetLife Technologies12321D
Fiji (ImageJ) Программное обеспечение для анализа изображенийhttp://fiji.sc/Fiji
Таблица буферов/растворов
Среда для выращиванияDMEM + 10% FBS + фильтр Pen-Strepстерилизовать и хранить при температуре 4 °C.
Средства роста – FBSDMEM + Pen-StrepFilter простерилизовать и хранить при температуре 4 °C.
Связывающий буфер50 мМ Трис, pH 7,4, 100 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 0,2% BSAVortex до растворения, держать на льду.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
  2. Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
  3. Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
  4. Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
  5. Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
  6. Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
  7. Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
  8. Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
  9. Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
  10. Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
  11. Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
  12. Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
  13. Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
  14. Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
  15. Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
  16. Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
  17. Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
  18. Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
  19. Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
  20. Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bead Aggregation AssayCell Adhesion MoleculesHEK293 CellsProtein G Magnetic BeadsHomophilic AdhesionCalcium Dependent AdhesionImage AnalysisTransmitted Light MicroscopyEpitope tagged EctodomainFunctionalized Beads

Related Articles