В этом исследовании, роман платформа для расследования внутринейрональную молекулярные подписи ответа на лечение биполярного расстройства (BD) была разработана и утверждена. Обонятельный эпителий от пациентов BD был получен с помощью назальных биоптатов. Тогда лазерного захвата микродиссекции сочетается с реальным временем ПЦР для исследования молекулярной подписи ответ лития в БД.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обонятельных нейронов, полученных с помощью носовой биопсии в сочетании с лазерной съемки микродиссекции: возможный подход к исследуемым препаратом ответ психических расстройств
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Биполярное расстройство (BD) является серьезным психоневрологических расстройств, с плохо понимал патофизиологии и обычно обрабатывают с стабилизатором настроения, карбонат лития. Исследования на животных, а также генетические исследования человека показывают, что литий влияет молекулярные мишени, которые участвуют в нейронной роста, выживания и созревания, и, в частности молекул, участвующих в Wnt сигнализации. Учитывая этической проблемой для получения биопсии мозга для исследования динамических молекулярных изменений, связанных с литий-ответ в центральной нервной системе (ЦНС), можно рассмотреть возможность использования нейронов, полученных из обонятельных тканях для достижения этой цели goal.The обонятельный эпителий содержит обонятельные нейроны рецептора на разных стадиях развития и глиальных как опорных клеток. Это дает уникальную возможность для изучения динамических изменений в ЦНС у больных с нервно-заболеваний, используя обонятельный ткани безопасно, полученную из носовых биопсии. Чтобы преодолеть недостаток, исходящей от SUBSTantial загрязнение биопсию ткани обонятельной с не-нейрональных клеток, новый подход, чтобы получить обогащенные популяции нейрональных клеток был разработан путем объединения носовые биопсии с лазерным захвата микродиссекции. В этом исследовании, система расследования связанный с лечением, динамические молекулярные изменения в нервной ткани была разработана и утверждена, с помощью небольшой опытный образец пациентов BD, набранных для исследования молекулярных механизмов ответа на лечение литием.
Введение
Биполярное расстройство (BD) является серьезным психоневрологических расстройств, характеризующихся патологическим изменениям в настроении, драйв и познание 1. Литий используется для лечения BD было показано, чтобы изменить состояние стабильный уровень мРНК большого числа генов в исследованиях на животных 2, но остается неизвестным, если любой из этих молекул связана с клинической реакции в организме человека 2. Понимание механизма ответа лития потребует расследования литий-индуцированной молекулярные изменения в нервных тканях. К сожалению, это не практично, чтобы получить мозга биопсии пациентов BD пред- и пост-литиевой терапии для определения молекулярных подписей ответ лития. Посмертный ткани мозга были использованы для изучения биомаркеров в БД, однако, они не могут быть использованы для оценки молекулярных маркеров, связанных с динамическими изменениями в эмоциях, познания и управлять; и действия ретроспективно констатировали ответа на лечение лития может быть проблематичным 4, Лимфоциты и другие клетки крови могут быть полезны, но молекулярные изменения в клетках крови может не отражать нейронов изменения 3-5. Спинномозговой жидкости может быть недостаточным для получения информации о внутриклеточных молекул, которые могут отражать, ассоциированных с заболеваниями и лекарства обратимым внутренние изменения.
Обонятельный эпителий (OE) является уникальной частью центральной нервной системы (ЦНС), эмбриологически связанных с лимбических структурах 6; и это легко доступны через носовые биопсии. Он состоит из глиальных типа поддержки (т.е. sustentacular) клетки, базальные пролиферирующих клеток, и обонятельные нейроны рецептора на разных стадиях развития 7-9. Таким образом, OE предоставляет уникальную возможность доступно исследования динамических изменений в ЦНС у больных с нервно-заболеваний 7. Исследования демонстрируют полезность OE в качестве суррогатной ткани для исследования болезней, связанных события, которые отражают эти ОККurring мозговых нейронов 8,9. Например, исследования использовали OE исследовать молекулярные профили, которые связаны с психическими заболеваниями 10-14. Обонятельная система также служит для идентификации клинических endophenoytpes, такие как дефицит запах, которые ассоциируются с негативными симптомами шизофрении 15. Кроме того, с развитием нервной системы процессы продолжают в OE в течение всей жизни, обеспечивая полезный форум для моделирования патофизиологии психических расстройств 8,9.
Однако недостатком в использовании этой ткани является значительное загрязнение обонятельные биопсии с не-нейрональных клеток 16. Например, общая РНК использовали для исследования экспрессии генов в предыдущих исследованиях OE содержится РНК, выделенной из всей носовой биопсию ткани, включая РНК из не-нейрональных клетках 17. Таким образом, предыдущие подходы были ограничены качества клеток. Чтобы преодолеть эту проблему, новый подход, чтобы получить обогащенные популяции нейрональных клеток путем объединения носовые биопсии с лазерной захвата микродиссекции (LCM) была разработана 18.
LCM является метод, который позволяет для селективного выделения клеток с использованием УФ лазерной резки в сочетании с инфракрасной лазерной 19-21. Сочетание МДК с OE подход минимизирует загрязнение значительное OE не-нейрональных клеток, тем самым повышая обогащение нейрональных клеток 18. Кроме того, слой нейронов можно отличить от подслизистой слоя под микроскопом, тем самым устраняя необходимость в окрашивании. Нейронные клеточные типы дополнительно можно отличить от других клеточных популяций с использованием первичных антител, которые выражены по типу клеток, представляющих интерес 7. Таким образом, эта процедура устанавливает легкий способ для обогащения почти исключительно нейронов популяции клеток, которые могут быть использованы для исследований экспрессии генов, иммуногистохимии и других морфологических исследований.
ve_content "> Это исследование направлено создать экспериментальную площадку для расследования молекулярные изменения в обонятельных нейронов, связанных с болезненными состояниями и реакции на лечение. Для решения этой проблемы, небольшой набор пациентов для некурящих, которые имели диагностические критерии DSM-IV для BD на основе диагностическое интервью для генетических исследований (DIG) 22 был принят на работу пройти два носовых биопсии: один биопсия предварительная обработка с литием и второй биопсии, после 6 недель ежедневного перорального лечения лития Кроме того, исследование включали больных BD должны быть:. симптоматично для депрессии на основе забил ≥10 из 60 в клинициста в ведении Монтгомери-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; симптоматический гипомании или мании, на основе баллов ≥10 из 56 на врача в ведении Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. или ≥10 на обоих MADRS и YMRS коэффициента Rater Интер-Rater соглашения между клиницистами для обеих шкал> 0,96 После биопсии, нейроны ENRI.Чед от ОЕ по LCM. После дополнительных мер по контролю качества, чтобы обеспечить добычу высокого качества РНК из тканей и нейронов обогащения, в режиме реального времени RT ПЦР проведено расследование до и экспрессии после лечения уровни генов, представляющих интерес. Последующие разделы содержат описание проверки этого подхода, подчеркивая оптимизации протокола и стратегии, которые были применены для поиска и устранения неисправностей протокола.Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все исследовательские добровольцев в этом исследовании, были введены обоснованные документы согласия, утвержденные ведомственного комитета Говарда университет и Университета Джонса Хопкинса. Только те участники, кто согласился на подписание документов обоснованного согласия были включены в исследование. База исследования для этого анализа состояла из: 20 предметам (12 BD и 10 управления, 30% мужчин) и средний возраст (стандартное отклонение) 38,2 (14,1) лет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Спрей все поверхности с РНКазы Зап удалить РНКазы загрязнения из стеклянных и пластиковых поверхностей.
1. Биопсия Процедура
- Спрей для местного лидокаина (Xylocaine) жидкости 4% и оксиметазолин HCl 0,05% в носовой полости участника исследования и позволить 15 минут от онемение времени.
- Замачивание ½ дюйма х 3 хирургических cottonoids в смеси лидокаина и оксиметазолина и вставить в полость носа по превосходной части носовой перегородки и позволить, чтобы сидеть в течение 15 мин.
- Использование 30 ° жесткойносовой эндоскоп, чтобы найти верхнюю часть носовой полости, удаления слизистой оболочки носа, используя до грызть носовые щипцы от верхнего участка носовой перегородки, принимая несколько небольших образцов.
2. Получение блоки ткани
- Непосредственно перед биопсией заполнить стандартного размера cryomolds с замораживания тканей среду.
- Использование автоклавного пинцет, установите свежий ткани в морозильной среды и заморозить на сухом льду. Заполните оставшуюся часть cryoblock с морозильной среде, заморозить cryoblock на сухом льду, и хранить блоки в -80ºC.
3. Cryosectioning
- Подготовка полиэтиленнафталат (PEN) мембрана стеклянные пластинки непосредственно перед cryosectioning. Спрей слайды с РНКазы Зап раствора в течение 5 мин. Затем промыть слайдов в диэтилпирокарбонатом (DEPC) водой и дайте высохнуть на воздухе в течение 30 мин. Активируйте сушеные слайды под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут.
- Cryosection каждый блок полностью на 30 мкм. Держите слайды на сухом IСе и замороженных срезах, насколько это возможно. Храните слайды при температуре -80 ° С после завершения.
4. Лазерная Захват микродиссекция
- Начните путем дегидратации слайды непосредственно перед микродиссекции. Пусть замороженные горки таять в течение 10 сек, а затем применить следующую серию этанола к каждому слайду: 60% (2 мл, 15 сек), 80% (2 мл, 15 сек), 95% (3 мл, 25 сек), 100 % (7 мл, 60 сек).
- Включите фотоактивированные локализации микроскопии (PALM) микроскоп и установлен на следующих условиях: Для 10-кратным увеличением установленной энергию 82, сосредоточиться на 74 и скорость до 25 - 30 Для 20-кратным увеличением, установить энергию 63, сосредоточиться на 67, и скорость 5 - 6. При необходимости отрегулируйте, чтобы получить оптимальные результаты при резке.
- Визуально определить нейронов использованием 20X или 10-кратным увеличением. Различают тонкий поверхностный слой нейронов обонятельной от базовой суб-слизистой оболочки под микроскопом без использования процедуры окрашивания. Соблюдайте нейронов в виде плотного столбчатого появления 18.
- Использование функции карандашом в вышеупомянутой микроскопом в шаге 4.2, следов вокруг нейронов слоя. Проследите немного в стороне от нейронов, чтобы предотвратить сжигание нейронов лазера. Это очень важно для получения высокого качества РНК. Тогда начать с лазерным наведением резки.
- Возьмите расчлененные участки с помощью тоненького кончика микродиссекции щипцы и положил ткань в микропробирку, содержащей 100 мкл буфера для лизиса на льду. Повторите эти действия для всех нейронов полученных сечений из одного образца. Общее время рассечение на образец не должен превышать 50 мин.
- После рассечения завершена, немедленно образца лизаты вихревые и держать в сухом льду. Магазин образцы при -80ºC для полной изоляции РНК.
5. Выделение тотальной РНК и анализ качества управления
- Оттепель образцы лизатов на льду. Провести полную изоляцию РНК с RNAqueous Micro Kit с ДНКазы I инактивации в соответствии с протоколом производителя без каких-либо модификаций (см Рисунок 1). Общий объем элюирования составляет примерно 20 мкл.
- Измерьте концентрацию РНК и оценить качество РНК с РНК целостности номер (РИН) с помощью Bioanalyzer. Образцы, которые соответствуют критериям контроля качества на рис 2 может быть использован для синтеза кДНК.
6. Синтез кДНК
- Синтеза кДНК с использованием утвержденной коммерческого набора (табл реагентов). Выполнение этапа отжига путем объединения 0,1 - 1,0 нг РНК (в зависимости от наличия) и РНКазы свободной воды до общего объема 8 мкл на пробирку. Затем добавить 1 мкл олиго D (T) 20 праймера и 1 мкл 10 мМ дНТФ смеси в трубе, при общем объеме 10 мкл.
- Мягко вихревые и центробежные образцы и образцы отжиг при 65 ° С в течение 5 мин. После завершения реакции, немедленно охладите образцы на льду.
- Подготовка главное решение смеси в соответствии со спецификациями в таблице 1. Затем добавить 9,5 μл Master Mix и 0,5 мкл коммерчески готов обратной транскриптазы (RT) в каждую пробирку. Добавить 0,5 мкл РНКазы воду, чтобы достать трубку вместо РТ.
- Запуск реакции RT с первой инкубации при 50 ° С в течение 50 мин, затем 85 ° С в течение 5 мин и окончательного удержания 4 ºC, без езды на велосипеде.
- Развести все образцы от 5х водой и аликвоту. Магазин образцы при -80 ° С.
7. ПЦР в реальном времени - Подтвердите нейронных обогащение
- Приготовьте раствор Master Mix в соответствии с требованиями в таблице 2. Используйте внутренний контроль, например, GAPDH. Сравните обонятельный маркер белка (OMP) выражение в микродиссекции ткани с ОМП выражения в undissected ткани, чтобы определить нейронов обогащения.
ПРИМЕЧАНИЕ: OMP является маркером для обонятельных нейронов.
OMP последовательность: вперед, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 "
реверс, 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 '
GAPDH последовательность: вперед, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 "
реверс, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '. - Настройка ПЦР планшета, добавив 7 мкл мастер смеси в каждую лунку и 3 мкл кДНК.
- Центрифуга пластины в течение 5 мин при 300 мкг (1300 оборотов в минуту). Реакция Run Real Time ПЦР с использованием тепловых условий на велосипеде по умолчанию, указанные для коммерческого Supermix такие как SYBR зеленее кПЦР.
- Анализ данных (рис 2 по характеристикам).
8. ПЦР в реальном времени - экспрессии генов интересов
- Выполните на образцах, которые показывают нейронов обогащение 2 раза или больше.
- Подготовка мастер-микс на льду в течение каждого зонда (FAM-меченного зонда интересов и VIC-меченого GAPDH) в отдельные пробирки в соответствии со спецификациями в таблице 3.
- Настройка ПЦР планшета с 8 мкл смеси мастер-микс в каждую лунку и 2 мкл кДНК.
- Центрифуга пластины в течение 5 мин при 300 мкг (1300 оборотов в минуту). Запуск Real реакцию Time-ПЦР с использованием ЗащитуAult тепловые условия езды на велосипеде как на экспрессию генов протокола Master Mix, предоставленной производителем. Анализ результатов экспрессии (рис 2 по характеристикам).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Стратегия протокол и устранение неполадок в изучении молекулярных подписей были успешно оптимизированы. Качество РНК и нейронные критерии обогащения проб, которые будут использоваться в дальнейшем вниз по течению Real-временной анализ ПЦР были стандартизированы. Рин и концентрация РНК рассматривается как сопутствующих факторов, чтобы обнаруженные уровни экспрессии. На основе анализа нескольких образцов с RINS в пределах от 1 - 10, было определено, что минимальное RIN из ~ 3,0 и выше, достаточно для нисходящего анализа в...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Новая платформа для получения обогащенного обонятельные нервные слоев путем объединения носа биопсии и НОК представлена и была утверждена в данном исследовании. Этот метод может иметь широкие последствия. Он может быть применен к биомаркеров исследований, в том числе ответ на лечение, и усилия обнаружения наркотиков для других психоневрологических расстройств, что делает более широкое воздействие в этой области.
Для получения высокого качества нейроны поддающиеся последующих применений, не...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не сообщают никаких финансовых отношений с коммерческими интересами.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами USPHS MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.) и MH-096208 (K.I.), грантами от DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. и K.I.), и Мэрилендский фонд исследований стволовых клеток (A.S. и K.I.).
Мы искренне ценим усилия и вклад Перл Ким, Марии Папапавлу, Нао Гамо, Юджин Чунг, Юкико Лема и Марка Кристи в координацию процесса биопсии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Обработанная вода | Качество Биологическая | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Микроскоп: Микролазерная система серии PALM | Carl Zeiss | Модель: Axiovert 200M Программное обеспечение: Robo v3.2 | |
| No. 5 Dumont Microdissction Щипцы | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Probes | Applied Biosystems | Различные | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
Ссылки
- Goodwin, F. K., Jamison, K. R. Manic-depressive illness. , Oxford University Press. (1990).
- Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).
- Severino, G., et al. Pharmacogenomics of bipolar disorder. Pharmacogenomics. 14 (6), 655-674 (2013).
- Beech, R. D., et al. Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS). Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).
- Horiuchi, Y., et al. Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders. Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).
- Dryer, L., Graziadei, P. P. Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon. Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).
- Hahn, C. G., et al. In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium. J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).
- Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research. J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).
- Sawa, A., Cascella, N. G. Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia. Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).
- Mor, E., et al. MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients. Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).
- Kano, S., et al. Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia. Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).
- Toritsuka, M., et al. Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).
- Evgrafov, O. V., et al. Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders. Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).
- Fan, Y., et al. Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia. Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).
- Ishizuka, K., et al. Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test. Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).
- Sattler, R., et al. Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development. Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).
- Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations. BMC Genomics. 10, 572(2009).
- Tajinda, K., et al. Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection. Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Fink, L., et al. Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking. Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Nurnberger, J. I. Jr, et al. Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training. NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).
- Montgomery, S. A., Asberg, M. A new depression scale designed to be sensitive to change. Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).
- Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity. Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
