Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование Экс Vivo Чандлер Loop Аппарат для оценки биосовместимости модифицированных полимерных Conduits крови

11.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51871

⸱

20 августа 2014 г.

 ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Pediatrics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Воздействие крови на полимерные кровяные каналы инициирует реакцию инородного тела, которая была вовлечена в клинические осложнения. Здесь описывается аппарат петли Чандлера, экспериментальный инструмент, имитирующий перфузию крови через эти каналы. Придаток рекомбинантного CD47 приводит к снижению признаков реакции инородного тела на эти кондуиты.

Аннотация

Реакционную инородного тела происходит, когда синтетическое покрытие вводят в организм. Она характеризуется адсорбции белков крови и последующего прикрепления и активации тромбоцитов, моноцитов / макрофагов адгезии и воспалительных явлений клеточных сигнальных, что приводит к постабортных осложнений. Аппарат Чандлер Loop является экспериментальной системой, которая позволяет исследователям изучать молекулярные и клеточные взаимодействия, которые происходят, когда большие объемы крови перфузируют над полимерных трубопроводов. Для этого, этот аппарат был использован в качестве экс естественных модели, позволяющей производить оценку противовоспалительных свойств различных полимерных модификации поверхности. Наша лаборатория показала, что трубы крови, ковалентно модифицированные с помощью фотоактивации химии с рекомбинантной CD47, может даровать биосовместимость с полимерными поверхностями. Добавление CD47 для полимерных поверхностей может быть эффективным средством для продвижения эффективности полимерных трубопроводов крови. ЕеEin является методика подробно химию фотоактивация используется для добавления рекомбинантного CD47 клинически соответствующих полимерных трубопроводов крови и использования Chandler цикла, как экс виво экспериментальной модели, чтобы изучить взаимодействие крови с CD47 изменение и контроль трубопроводов.

Введение

Многие клинические процедуры, такие как искусственного кровообращения и гемодиализа, требует использования полимерных трубопроводов крови и часто связаны с постабортных осложнений 1. При перфузии крови, эти полимеры незаконного реакцию на инородное тело (FBR), в результате чего адсорбции белков крови и тромбоцитов, моноцитов / макрофагов адгезии, а также освобождение провоспалительных цитокинов, все из которых способствуют постабортных осложнений и / или отказ устройства 2,3. Таким образом, стратегии по решению этой проблемы остаются важной и постоянной областью исследований биоматериалов. Следователи пытались решить эту проблему путем изменения крови контактирующих поверхностей с биоактивными или биоинертных молекул 4-6. Исследования в нашей лаборатории была сосредоточена на добавление рекомбинантного CD47 (recCD47) полимерным биоматериалов в качестве стратегии для смягчения FBR и повышения эффективности этих материалов. CD47 является повсеместно экспрессируется transmembrане белок с известной роли в иммунной уклонения, присвоении «я» статуса по экспрессирующих клеток 7-10 и шоу обещают в присвоении биосовместимость, когда добавляется в полимерных поверхностей 11-13. Сигнал-регулирующий белок альфа (SIRPα), родственный рецептор CD47, и член иммунорецептора на основе тирозина ингибирующей мотива (ITIM) -содержащего семейство трансмембранных белков, экспрессируется на клетках миелоидной происхождения 14. Ранее мы показали, что CD47, с помощью SIRPα-опосредованной клеточной сигнализации, вниз регулирует иммунный ответ на полиуретана (PU) и поливинилхлорид (ПВХ) в в пробирке, экс виво и в моделях естественных условиях 11-13.

Центральное место в наших исследованиях является относительно новым химия фотоактивация, описанные здесь, в котором химически активных тиоловых групп ковалентно добавляется к полимерной трубки взаимодействием трубки с многофункциональным полимера (PDT-BZPh), состоящий из 2-пиридилдитио (PDT), фотореакционноспособного бензофенон (BzPh) и карбокси-модифицированный полиаллиламин 11-13. Снижение ковалентно прилагаемые группы ФДТ с трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид (ТСЕР) дает 11 Тиолированный поверхность, которая может быть затем подвергают взаимодействию с лечебными группами. Изложенных в настоящем документе, и ранее 12,13, recCD47, дополнительно модифицированы с добавлением в С-концевой поли-лизин хвоста 12,13, подвергают взаимодействию с сульфосукцинимидил-4- [N -maleimidomethyl] циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) в течение 1 часа, чтобы генерировать тиол-реакционноспособных групп, что позволяет для формирования моносульфид связи между трубкой и recCD47 11. Противовоспалительное мощность CD47 функционализованных поверхностей испытывали, экс Львов о, с помощью аппарата Чандлер Loop с целой человеческой крови, которая была изначально, описанной в 1958 в качестве модели в пробирке тромботической коагуляции 15. Устройство используетСистема закрытой трубки, частично заполненный воздухом и поворотного двигателя, чтобы циркулировать кровь через трубопровод 15. Это экспериментальная модель дает возможность изучить последствия воздействия крови на модифицированных и немодифицированных поверхностей, а также эффект этих изменений поверхности, на физиологии клеток крови.

recCD47 могут быть добавлены к различным полимерных поверхностей с помощью этого фотоактивации химию, и его противовоспалительное мощность может быть оценена с использованием клинически значимых экс естественных модель имитации кровоснабжение над полимерных поверхностей 11,12. Клинические класса трубы крови, модифицированные recCD47 показывают значительно меньше тромбоцитов и прикрепление воспалительных клеток по сравнению с немодифицированными полимерами при воздействии на кровь человека в аппарате. Шаг за шагом описание этого процесса модификации подробно ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Модификация Полимерные Поверхности с recCD47

Примечание:. Протокол кратко, схематически на рисунке 1 1А иллюстрирует генерацию тиоловых-реактивного полимерных поверхностей Фиг.1В иллюстрирует генерацию тиол-реактивного recCD47..

  1. День 1
    1. Готовят раствор PDT-BzPh (1 мг / мл) и бикарбонат калия (КНСО 3) (0,7 мг / мл) в стерильной воде. Перемешивают в течение ночи при 4 ° С (защиты от света).
  2. День 2
    1. Вырезать полимерную трубу в 40 см длинные куски (достаточно долго, чтобы соответствовать вокруг вращающихся колес).
    2. Замачивание труб в 0,1% водном растворе hexacylpyridinium в течение 90 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере или на Чандлер Loop аппарата. Промойте трубки с стерильных 3x воды после 90 мин замочить.
    3. Подкислите решение PDT-BzPh от 1-й день, добавляя 15% одноосновного фосфата водный калия (KH 2 PO 4). Добавить 50 мкл KH 2 PO 4 на мл PDT-BzPh, образуя мутную мицеллярного раствора.
    4. Замачивание труб в подкисленный раствор PDT-BzPh в течение 40 мин при комнатной температуре на шейкере или на аппарате.
    5. Промойте трубки с разбавленной уксусной кислоты (1: 1000) один раз.
    6. Expose трубки в УФ-облучения для общей продолжительностью 60 мин. Поверните трубки ¼ оборота каждые 15 минут, чтобы облучать всю поверхность.
    7. Замачивание трубки в растворе 20 мг / мл бикарбоната калия (КНСО 3) в течение 20 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере или на аппарате.
    8. Промыть трубы с стерильной водой 3 раза и хранить при температуре 4 ° С в стерильной воде.
  3. День 3
    1. Растворите 5 мг сульфо-SMCC в 200 мкл диметилформамида (ДМФ) (Внимание: выступать в вытяжном шкафу).
    2. Добавить 50 мкл раствора сульфо-SMCC, полученного на стадии 1 до 0,1 мг / мл recCD47 поли-лизин раствора, и перемешивали в течение 60 мин при роом температура.
    3. В течение 60 мин с перемешиванием, дегазации стерильной Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS) и отложить в сторону.
    4. Очищают сульфо-SMCC отреагировал recCD47 использованием 7К молекулярной массой-офф спин колонки обессоливающей соответствии с инструкциями производителя. Соберите окончательное проточные (высококачественный тиол-реактивного recCD47) и разбавить до объема, необходимого для покрытия внутренней трубки с DPBS.
    5. Промойте трубки из дня 2 стерильным, дегазированный DPBS 3x.
    6. Реакция модифицированную поверхность труб с помощью раствора 20 мг / мл с трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид (ТСЕР) в дегазированном DPBS в течение менее 2 мин. Промойте пробирки стерильной дегазирован DPBS 4x.
    7. Добавьте сульфо-SMCC в реакцию recCD47 в пробирки и инкубируют в течение ночи при 4 ° С на качалке или на аппарате.

2 иммуноферментный Количественное recCD47 на модифицированных поверхностях

  1. Промыть модифицированные трубы, чтобы быть количественно от День 3 остроумияч DPBS 3x. Магазин трубки не используется для количественного определения в DPBS при 4 ° С.
  2. С помощью 4 мм биопсии удар, чтобы сделать образцы дубликаты трубки и поместить биопсии удары в лунки 96-луночного планшета с.
  3. Подготовка отрицательного контроля, состоящей из немодифицированного образца трубки не получавших антитела обнаружения. Подготовка контрольного антитела, состоящий из немодифицированного образца обработанной трубы с антителом обнаружения. Подготовка модифицированных образцов испытательных трубок, обработанных антителом обнаружения.
  4. Образцы блок с 0,4% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в DPBS в течение 60 мин при комнатной температуре на шейкере.
  5. После блокирования, аспирации BSA и промыть с помощью трис-буферный солевой раствор плюс 1% Твин-20 (TBST) 3x, 10 мин каждый на шейкере.
  6. Подготовить рабочее разведение антител в 0,4% BSA в соответствии с рекомендованной производителем разбавления для иммунологических. Развести человек CD47 Antibody B6H12-FITC 1: 100 в 0,4% BSA.
  7. Добавить 200 мкл разведения антител в соответствующие лунки. Инкубаторыт.е отрицательный контроль только с 0,4% БСА. Инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин на орбитальном шейкере (защиты от света).
  8. Промыть TBST 3x, 10 мин каждый на шейкере. Аспирируйте последний TBST полоскание и добавить 200 мкл DPBS в пробирку скважин.
  9. Собирают окончательный проточных которое высокого качества тиольную-реактивный рекомбинантный CD47 и разбавленной до объема, необходимого для покрытия внутренней части труб с DPBS.
  10. Читайте интенсивности сигнала FITC при помощи планшетного с FITC возбуждения (485 нм) и эмиссии (538 нм) настроек.
  11. Рассчитать recCD47 связан с полимерной поверхностью на основе стандартных значений, на которые приходится авто-флуоресценции и неспецифическое связывание с контрольным образцом антитела.

Аппарат Протокол 3 Чандлер Loop

Обратиться Экспертный совет (IRB) утверждение протокола сбора крови и информированное согласие документы до начала сбора образцов крови человека. Получить информациюrmed согласие человека-донора крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: схема, изображающая устройство показано на рисунке 2.

  1. не Заполните водяной бане с дистиллированной водой примерно до 1/2 колес диаметра погружены. Добавьте достаточно отбеливатель на водяной бане, чтобы сделать 10% гипохлоритом натрия. Установка водяной бане до 37 ° С и позволить, чтобы уравновесить температуру.
  2. Соберите металлические адаптеры (показанные на рисунке 1b), немодифицированную трубы и модифицированный трубки, и собрать вокруг аппарата колес, как показано на рисунке 1С. Убедитесь, что трубка подходит ожидающий вокруг колеса с адаптером металла в месте.
  3. Получение 30 мл образца крови с использованием IRB-утвержденным протоколом, во флаконе предварительно заполненные с 2 мл цитрата или других антикоагулянта, и смешать с инверсией, чтобы предотвратить свертывание образца после того, как была собрана.
  4. Добавить приблизительно 10 мл крови в каждую пробирку с помощью вентильного металла и шприц, в результате чего некоторое количество воздуха в трубе. Закрепите крышку клапана и гotate в течение 3 часов.
  5. Слить кровь в химическом стакане отходов обрабатывают 10% раствором хлорной извести (или в соответствии с организационной политики).
  6. Аккуратно промойте интерьер трубки с DPBS, чтобы удалить все следы крови. Соберите проточные в стакан отходов. Утилизировать крови в соответствии с институциональной политики.
  7. Лечить аппарат и никакой крови контактирующих поверхностей, используя 10% гипохлоритом натрия или в соответствии с институциональной политики.
  8. Образцы процесса для флуоресцентной микроскопии или сканирующей электронной микроскопии, как описано ниже.

4 флуоресцентной микроскопии и подсчета клеток

  1. Приготовьте 4% параформальдегида (PFA) решение (Внимание: Выполните в вытяжной шкаф).
  2. Инкубируйте труб в 4% растворе PFA в течение ночи при 4 ° С.
  3. После инкубации в течение ночи, удалить 4% PFA и промыть фильмы очень осторожно DPBS.
  4. Отрежьте трубку в секциях подвергать поверхность просвета для окрашивания.
  5. Stainчасть трубки с несколькими каплями монтажа носитель с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 30 мин при комнатной температуре (защиты от света). После окрашивания промыть трубки очень осторожно DPBS чтобы уменьшить фоновый DAPI сигнал.
  6. Изображение с помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного фильтром и DAPI цифровой камеры для подсчета количества клеток в 9 вслепую выбранных полях зрения при увеличении 200X.
  7. Запись подсчитанных клеток на поле зрения и выполнить соответствующие статистические анализы для определения статистической значимости результатов.

5 сканирующей электронной микроскопии

  1. Приготовьте 2% раствор глутарового альдегида (Внимание: Выполните в вытяжной шкаф).
  2. Инкубируйте трубки в 2% растворе глутаральдегида в течение ночи при 4 ° С.
  3. После инкубации в течение ночи, мягко промыть трубки 3 раза с DPBS.
  4. Приготовьте 1% раствор осмия (Внимание: Тяжелая вдыханием! Использование в вытяжной шкаф).
  5. Инкубируйте трубки в 1% растворе осмия в течение 15 мин при комнатной температуре.
  6. Аккуратно промойте трубки 3 раза с DPBS.
  7. Приготовьте серию концентрации этанола (25%, 50%, 75%, 95% и 100% этанола).
  8. Обезвоживают трубки путем инкубации в серии концентраций этанола. Инкубировать в 25%, 50%, 75% и 95% этанолом в течение 20 мин каждый. Инкубировать в 100% этаноле в течение 30 мин.
  9. Сверхкритический точка высушить трубки с CO 2 в течение 45 мин, чтобы удалить всю влагу.
  10. Трубных секций для монтажа на образце заглушки с серебряной пасты или графита.
  11. Трубных секций пальто с 12,5 нм золота-палладия.
  12. Изучение в сканирующем электронном микроскопе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Генерирование тиольные-реактивного полимерных поверхностей путем использования PDT-BzPh и ТСЕР вместе с тиол-реактивного recCD47 поли-лизина с помощью SMCC позволяет для крепления к recCD47 полимерных поверхностей. Процесс модификации представлены схематически на рисунке 1. Удобство этого процесса модификации является то, что он может быть применен ко многим различным белков и различных полимерных поверхностей, предполагая, что белок может быть модифицирован с достаточными химически активных групп, таки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Химия фотоактивация (показаны на рисунке 1) позволяет для модификации практически любой поверхности полимера, который имеет достаточные углеводородов для облегчения присоединения к PDT-BzPh и последующее УФ-излучения к фото-активировать PDT-BzPh. Функционализации полимерного поверхность с реактивными тиоловых групп позволяет последующим присоединением диапазоне тестируемых молекул, представляющих интерес. В наших конкретных исследований мы выбрали рекомбинантного CD47 11-13. Частности химия с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

В исследовании, опубликованном в этой публикации была поддержана Национальным институтом биомедицинской визуализации и биоинженерии, под награда числа R21 EB015612 (SJS) и Национального сердца, легких и крови институт, под награда числа T32 HL007915 (JBS и RJL), Национального Институт здравоохранения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% параформальдегид (PFA)Thermo Scientific58906Внимание! Использование в вытяжном шкафу
25% глутаральдегидаVWRAAA17876-AP осторожность! Использование в вытяжном шкафу
2-пиридилдитио,бензофенон (PDT-BzPH)Синтезировано в лабораторииН/Д
Альбумин бычьей сыворотки (BSA)SigmaA3059-100G
ЦитратSigmaS5770-50ML
Цифровая камераLeicaDC500Снят с производства
Диметилформамид (DMF)Sigma270547-100MLВнимание! Использование в вытяжном шкафу
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (DPBS)Gibco/Life Technologies14190-136
Флуоресцентный микроскопNikonTE300
Ледяная уксусная кислотаFisher ScientificA38-212Осторожно! Использование в вытяжном шкафу
Human CD47 (B6H12) – Антитела FITCSanta Cruz BiotechnologySC-12730
тетраоксид осмияAcros Organics197450050осторожно! Использование в вытяжном шкафу
Бикарбонат калия (KHCO3)Sigma237205-100G
Моноосновной фосфат калия (KH2PO4)ТрубкаP5655-100G
(набор для процедур сердечно-сосудистой системы)Terumo Cardiovascular Systems60050Большинство трубок клинического класса будут работать
Scanning Electron МикроскопJEOLJSM-T330A
Хлорид натрия (NaCl)Fisher ScientificBP358-212
Молекулярные устройстваSpectramax Gemini EM 
Sulfo-SMCCSigmaM6035-10MGчувствительный к влаге!
трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP-HCl)Thermo Scientific20491
Tween-20Bio-Rad170-6531
Vectashield с DAPIFisher ScientificH-1200Светочувствительный!
Колонны для обессоливания Zeba – 7 K MWCOThermo Scientific89891
из ПВХ Sigma Считыватель микропланшетов

Ссылки

  1. Bruck, S. D. Medical applications of polymeric materials. Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).
  2. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
  3. Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
  4. Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
  5. Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
  6. Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
  7. Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
  8. Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
  9. Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
  10. Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
  11. Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
  12. Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
  13. Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
  14. Ravetch, J. V., Lanier, L. L. Immune inhibitory receptors. Science. 290, 84-89 (2000).
  15. Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
  16. Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
  17. Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
  18. Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
  19. Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель ex vivoмодификация рекомбинантного CD47химия фотоактивацииоценка биосовместимостианализ адгезии клетокфлуоресцентная микроскопиясканирующая электронная микроскопиямодель перфузии крови
Использование Экс Vivo Чандлер Loop Аппарат для оценки биосовместимости модифицированных полимерных Conduits крови
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.