Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Использование белковых микрочипов, содержащих почти всю С. Cerevisiae протеом зондируют для быстрого объективной допроса тысяч белок-белковых взаимодействий в параллель. Этот метод может быть использован для белка-малая молекула, посттрансляционной модификации, и других анализов в высокой пропускной.

Abstract

Функциональный белок-микрочипов высокой плотности, содержащие ~ 4200 рекомбинантные белки дрожжей проверяются на киназы белок-белковых взаимодействий с использованием гибридного белка аффинной очистке дрожжи киназы, содержащий тег V5-эпитоп для считывания. Очищенный киназа получена через культуры штамма дрожжей, оптимизированной для производства белка с высоким копирования содержащего плазмиду, содержащую слитый киназы-V5 построить под GAL индуцируемого промотора. Дрожжи выращивали в средах с ограничительной нейтрального источника углерода в течение 6 ч, затем по индукции с 2% галактозы. Далее, культура собирают и киназы очищают с использованием стандартных аффинных хроматографических методов для получения высокоочищенного протеинкиназу для использования в анализе. Очищенный киназы разбавляют киназного буфера с соответствующим диапазоном для анализа и белковых чипов заблокированы до гибридизации с белком микрочипов. После гибридизации, массивы зондируют моноклональное V5 АнтибODY для идентификации белков, связанных с протеинкиназой V5. Наконец, массивы будут отсканированы с использованием стандартных микрочипов сканер, и данные извлекаются для анализа вниз по течению информатики ^1,2, чтобы определить высокое доверие набор белковых взаимодействий для последующего утверждения в естественных условиях.

Introduction

Необходимость проведения глобальных анализов биохимии белков и активность связывания в естественных условиях привело к разработке новых методов профилирования белок-белковых взаимодействий (ИЦП) и пост-трансляционные модификации целых протеомов ^1,3-8. Белковые микрочипы изготавливаются в качестве функциональных белковых микрочипов с использованием полноформатных функциональные белки ^4-6,8,9 или аналитических белковых микрочипов, содержащих антитела ^10,11. Они разработаны, чтобы содержать высокой плотности белков, выстроенных на предметных стеклах с различными поверхностных химических для облегчения различных экспериментальных условиях, необходимых для проведения широкомасштабную биохимических анализов ^12. Нитроцеллюлозы и альдегид поверхности химические для химической привязанности через лизина или крепления близость методов, таких как никель хелатных слайдов для крепления His-меченных белков и глутатиона для аффинной привязанности среди других ^13. </p>

Использование функциональных белковых микрочипов для выявления белок-белковых взаимодействий требуется доступ к высококачественной библиотеки функционального белка ^14. С. Cerevisiae поддается производить такой библиотеки через спаривания высокого сродства копирования меченый белок конструкции с высокой пропускной методов хроматографического очистки. Подавляющее большинство генома дрожжей было последовательности и почти вся протеом может быть выражена с высокой копирования плазмиды для очистки и биохимический анализы ^12. После того, как белки получают и облеченные в формате 384-луночного, они напечатаны на предметное стекло микроскопа, позволяющего для быстрого параллельного многопараметрического биохимического анализа и биоинформатики допроса ^8,14-16. Белковые микрочипы были использованы для ферментативных анализов и взаимодействий с белками, липидами, малых молекул, и нуклеиновых кислот среди многих других приложений. Доступность белков на поверхности протеомамассивы сделать их поддаются различным видам аналитического обнаружения в том числе, иммунных сродством, поверхностного плазмонного резонанса, флуоресценцию и многие другие методы. Кроме того, она позволяет точного контроля экспериментальных условиях, где он может быть трудно сделать в естественных условиях.

Цель этого протокола заключается в демонстрации соответствующего использования функциональных белковых микрочипов для выявления белок-белковых взаимодействий. Это приложение позволяет с высокой пропускной параллельный биохимический анализ белка связывания деятельности с использованием высокоочищенного анализируемого (белок) интересов. С-концевой (карбокси-терминал) помечены V5-фьюжн приманки интерес белок получают из высокого плазмидой в штамме дрожжей, оптимизированной для очистки белков. С-концевой пометки гарантирует, что белок полной длины была переведена. Белок, используемый в данном исследовании, Tda1-V5 слитый белок киназы, который очищают с помощью аффинной никель смолы с помощью тэга His6X. Tda1-V5 слияние строит очищали путем последовательного элюирования с использованием градиента имидазола для элюирования наиболее обогащенную фракцию для использования в анализе.

Protocol

1. Зонд Подготовка

1. Культура и очистить V5-киназы фьюжн зондов, используемых для изучения взаимодействий с другими белками следующим образом:
   1. Используйте недавно прожилками деформации Y258 дрожжей (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112), содержащий V5-слитый белок (выраженное с GATEWAY векторных pYES-DEST52). Используйте изолированный белок в качестве зонда на микрочипов. Плита дрожжи на синтетические полная-урацил (SC-Ура) / 2% декстроза / агар и растут при температуре 30 ° С в течение 3 дней с замороженной культуры (-80 ° С глицерин фондовом).
   2. Посев закваски (5-20 мл) от одной колонии и расти в течение ночи в Sc-Ura / 2% декстрозы при встряхивании платформы (220-250 оборотов в минуту) или колесо при 30 ° С.
   3. На следующее утро, привить 400 мл SC-Ура / 2% рафиноза культуры с достаточной культуры стартера до конечного OD ₆₀₀ 0,1.
   4. Расти посевного для OD ₆₀₀ 0,6 с последующим галактозы индукции V5-киназы-фуSion построить выражение с помощью добавления раствора 3x дрожжевого экстракта / пептон (YEP) с добавлением 6% галактозы, добавляя достаточно, чтобы разбавить индукции носитель с коэффициентом 3, так что конечная концентрация галактозы составляет 2%.
   5. Индуцируют клетки при 30 ° С в течение 6 ч на качалке платформы. Используйте 2 л колбу Эрленмейера, чтобы обеспечить надлежащее проветривание.
   6. Урожай клетки с использованием ротора JA-10 (или сопоставимый), вращая 400 мл клеточной суспензии при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
   7. Вымойте клетки один раз с 50 мл ледяной PBS буфер и передают в 50 мл коническую трубку. Вымойте гранул раз в ледяной буфера PBS (без моющих средств или других добавок), используемых для лизиса и передачи до 2 мл оснастки колпачок трубки для лизиса.
   8. Спин клетки при 20000 х г в течение 1 мин при 4 ° С до гранул и пипеткой вдали буфера.
   9. Поместите трубки на льду и заполните лизиса шагу.
   10. Лизировать клетки (250-350 мкл гранул) с 00,5 мм оксида циркония в соотношении 1: 1: объем клеточного осадка, бисера и фосфатно-солевом буфере (PBS) буфере для лизиса 1 и вихревых смеси с использованием агитацией платформа 3 раза в 2-минутными интервалами при 4 ° С.
   11. Центрифуга лизата при 20000 х г в настольной микроцентрифуге в течение 10 мин при 4 ° С.
   12. Пипетка супернатант в поликарбонат высокоскоростной центрифужную пробирку и уточнить по ulracentrufugation в течение 30 мин при 150000 х г при 4 ° С.
   13. Передача осветленной лизата в пробирку, содержащую предварительно промытую Ni ²⁺ аффинной смолы (~ 100 мкл) и инкубируют на nutator в течение 2 ч при 4 ° С для захвата гистидин (His) 6X помечены V5-слитый белок.
   14. Промыть смолы три раза в течение 10 мин при 4 ° С промывочным буфером. Гранул смолы с использованием таблицы центрифуге в течение 5 мин при 1000 х г при 4 ° С и аспирата супернатант. Добавить свежий промывочный буфер при каждой стирке и вернуться трубки nutator для агитации во время стирки.
   15. После стирки стеPS являются полными, применяют промытый смолы на свежую G-25 колонке дл элюировани.
   16. Применить 25 мкл буфера для элюции в поэтапно, начиная с 100 мМ имидазола до 500 мМ имидазола в 50 мм для приращений в общей сложности 9 фракций.
   17. Анализе собранных фракций использованием додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и Кумасси окрашивания для идентификации наиболее высоко фракции, обогащенной (ы) для использования в анализе и добавить глицерин до 30% и хранить при температуре -80 ° С до использования в Анализ.

2. Исследование массивов

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь шаг 2.6 этого раздела, чтобы подготовить раствор антител до начала анализа.

1. Для обнаружения взаимодействий, разбавить V5-флуорофор конъюгированного антитела (т.е. AlexaFluor 647) 260 нг / мл в буфере зонда и тщательно перемешать, встряхивая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор антител 30 мин до использования и поместите трубку на nutatили или колеса для обеспечения полного перемешивания и гомогенную суспензию антитела.
2. Развести белка зонд V5-фьюжн в диапазоне концентраций от 5-500 мкг / мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизирован для каждого взаимодействия анализе белок-белок, используя буфер зонда. Оптимизация включает в себя добавление более зондов для исследования буфера. Обычно 10 мкг / мл используют в качестве отправной точки, и соответствующим образом скорректированы на основе сигнала.
3. Удалить белковых микрочипов из морозильника (-20 ° C) и довести до 4 ° С в холодильнике до использования.
4. Добавить блокирующем буфере непосредственно держатель слайдов, содержащий белок micorarrays и закрывать верхнюю с парафином, чтобы предотвратить утечку. Блок массивы в блокирующем буфере в течение 1 часа при встряхивании при 50 оборотах в минуту на стадии при 4 ° С.
5. После блокирования передачи массивов в увлажненной камере охлаждают до 4 ° С и добавляют 90 мкл разбавленного зонда непосредственно на поверхность массива. Наложение обрн я с поднятой скольжения подъемного и инкубировать статическое (не встряхивая) в увлажненной камере при 4 ° С в течение 1,5 ч.
6. Вымойте массивы 3 раза в течение 1 мин каждый в буфере зонда в трех 50 мл конические пробирки. Добавить слайд, конических пробирок, содержащих достаточно предварительно охлажденной буфера зонд полностью конверт слайд. Разрешить скольжения ручка мягко соскальзывать микрочипов белка (не заставить ее покинуть, как это может привести к повреждению поверхности массива).
7. Нанесите раствор антител непосредственно в массив сразу после завершения стирки (этап 2.5) и накладку с поднятым скольжения подъемного как раньше. Инкубируйте массивов в течение 30 мин при 4 ° С в увлажненной камере.
8. Точно так же следует стадия промывки, как и раньше (3 раза 1 мин в буфере зонда) и спина в 50 мл коническую пробирку при 800 х г в настольной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре. Высушите массивов в держатель слайдов в темноте в течение 30 мин перед сканированием массива на 647 нм.

Representative Results

Discussion

Протокол, представленные первоначально был выполнен с использованием 85 уникальных дрожжей белка белки киназы-V5 фьюжн сравнить активность связывания через отдельных и связанных семей дрожжи протеинкиназ в результате идентификации новых сетей киназы взаимодействия в естественных условиях ^1. Как новая технология профилирования протеомного, развитие Высокая пропускная способность (ПВТ) скрининга с использованием белка протеомов микрочипов полагались на пептидных библиотек, и эукариотических и прокариотических организмов модели ^8,17; Через этот анализ платформа была применена к высших эукариот, таких как растения и человеческого ^5,7. В настоящее время нет в продаже массива дрожжи белок. Тем не менее, последовательность подтверждали коллекции кДНК доступны из нескольких ресурсов

Хотя метод может быть мощным, один нюанс, чтобы иметь в виду, что анализ проводится в пробирке, и, таким образом, результаты будут иметь ложных срабатываний. Таким образом, optimizinг состояние анализа и стратегического схема фильтрации желательно, чтобы получить значимые данные. Белок технологии микрочипов следующего поколения содержат гораздо большее количество высокоочищенных функциональных белков для биохимического анализа по множеству организмов, включая A. THALIANA, S.cerevisiae, и Homo Сапиен.

Уровень сложности, что новые микрочипы белка спроектировали в них позволяет обширный выбор биохимических анализов, которые могут быть выполнены. Почти все протеом был клонирован и очищенный для S. Cerevisiae с использованием библиотеки тегами C-терминал для обеспечения надлежащего пост-трансляционной модификации белков ^14. Кроме того, быстрые параллельные анализы предложили с помощью белковых микрочипов позволяет непредвзято подход к белок-белкового взаимодействия и пост-трансляционной модификации профилирования.

Materials

Petri Dishes	VWR	NC-10747	or comparable
Bacto yeast extract	Difco	0217-17
Bacto peptone	Difco	0118-17
Bacto agar	Difco	0140-01
Dextrose	Sigma	D9434
Raffinose	Sigma	R0514
Galactose	Sigma	G0750
Sc-Ura drop out media	MP Bio	114410622
Small Culture tubes	VWR/Fisher
Large Erlenmeyer Flask	VWR/Fisher
Centrifuge JA-10 rotor
Centrifuge tubes (500 ml)
Falcon tube (50 ml)	VWR/Fisher	21008-951
PBS Tablets	Sigma	P4417
FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube)
FastPrep Machine	MP Biomedicals	116004500
Zircon Beads	BioSpec	11079105
Triton X100	Sigma	P4417
DTT	Sigma	D9779
MgCl<sub>2</sub>	Sigma	M8266&nbsp;
NaCl	Sigma	S3014&nbsp;
Imidazole (pH = 7.4)	Sigma	I5513&nbsp;
PMSF	Sigma	93482
Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free)	Roche	11873580001
Phosphatase inhibitor cocktail 1	sigma	P2850
BSA	Sigma	A2153&nbsp;
Tween-20	Sigma	P1379&nbsp;
ATP	Sigma	A1852&nbsp;
Shaking Incubator (30 &deg;C)
Nickel Affinity Resin	Life Technologies	R901-01
G25 column	GE life sciences	27-5325-01&nbsp;
Nutator	VWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)	Life Technologies
Coomassie Blue Stain	Life Technologies
Monoclonal V5 Antibody	Life Technologies	R960-25
Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody	Life Technologies	451098
Protein Microarrays Kit	Life Technologies	PAH0525013
Genepix Scanner	Molecular Devices
Lifter Slips	Thomas Scientific		http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT,<br/> 2 mM MgCl<sub>2</sub>, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail &ndash; EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF&nbsp; (add just prior to use)			Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution
Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20			Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer
Probe Buffer: 2 mM MgCl<sub>2</sub>, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 &mu;M ATP (for kinases), 1% BSA			Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl<sub>2</sub>			Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl<sub>2</sub>, 500 mM NaCl, 50 &ndash; 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail &ndash; EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use)			Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 &ndash; 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and&nbsp; 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol)			&nbsp;Galactose should not be autoclaved