Методическая статья

Исследование высокой плотности белковых Функциональные Microarrays для обнаружения белок-белковых взаимодействий

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51872

⸱

2 августа 2015 г.

 ,  , 
1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

В этой статье

Краткое содержание

Использование белковых микрочипов, содержащих почти всю С. Cerevisiae протеом зондируют для быстрого объективной допроса тысяч белок-белковых взаимодействий в параллель. Этот метод может быть использован для белка-малая молекула, посттрансляционной модификации, и других анализов в высокой пропускной.

Аннотация

Функциональный белок-микрочипов высокой плотности, содержащие ~ 4200 рекомбинантные белки дрожжей проверяются на киназы белок-белковых взаимодействий с использованием гибридного белка аффинной очистке дрожжи киназы, содержащий тег V5-эпитоп для считывания. Очищенный киназа получена через культуры штамма дрожжей, оптимизированной для производства белка с высоким копирования содержащего плазмиду, содержащую слитый киназы-V5 построить под GAL индуцируемого промотора. Дрожжи выращивали в средах с ограничительной нейтрального источника углерода в течение 6 ч, затем по индукции с 2% галактозы. Далее, культура собирают и киназы очищают с использованием стандартных аффинных хроматографических методов для получения высокоочищенного протеинкиназу для использования в анализе. Очищенный киназы разбавляют киназного буфера с соответствующим диапазоном для анализа и белковых чипов заблокированы до гибридизации с белком микрочипов. После гибридизации, массивы зондируют моноклональное V5 АнтибODY для идентификации белков, связанных с протеинкиназой V5. Наконец, массивы будут отсканированы с использованием стандартных микрочипов сканер, и данные извлекаются для анализа вниз по течению информатики 1,2, чтобы определить высокое доверие набор белковых взаимодействий для последующего утверждения в естественных условиях.

Введение

Необходимость проведения глобальных анализов биохимии белков и активность связывания в естественных условиях привело к разработке новых методов профилирования белок-белковых взаимодействий (ИЦП) и пост-трансляционные модификации целых протеомов 1,3-8. Белковые микрочипы изготавливаются в качестве функциональных белковых микрочипов с использованием полноформатных функциональные белки 4-6,8,9 или аналитических белковых микрочипов, содержащих антитела 10,11. Они разработаны, чтобы содержать высокой плотности белков, выстроенных на предметных стеклах с различными поверхностных химических для облегчения различных экспериментальных условиях, необходимых для проведения широкомасштабную биохимических анализов 12. Нитроцеллюлозы и альдегид поверхности химические для химической привязанности через лизина или крепления близость методов, таких как никель хелатных слайдов для крепления His-меченных белков и глутатиона для аффинной привязанности среди других 13.

Использование функциональных белковых микрочипов для выявления белок-белковых взаимодействий требуется доступ к высококачественной библиотеки функционального белка 14. С. Cerevisiae поддается производить такой библиотеки через спаривания высокого сродства копирования меченый белок конструкции с высокой пропускной методов хроматографического очистки. Подавляющее большинство генома дрожжей было последовательности и почти вся протеом может быть выражена с высокой копирования плазмиды для очистки и биохимический анализы 12. После того, как белки получают и облеченные в формате 384-луночного, они напечатаны на предметное стекло микроскопа, позволяющего для быстрого параллельного многопараметрического биохимического анализа и биоинформатики допроса 8,14-16. Белковые микрочипы были использованы для ферментативных анализов и взаимодействий с белками, липидами, малых молекул, и нуклеиновых кислот среди многих других приложений. Доступность белков на поверхности протеомамассивы сделать их поддаются различным видам аналитического обнаружения в том числе, иммунных сродством, поверхностного плазмонного резонанса, флуоресценцию и многие другие методы. Кроме того, она позволяет точного контроля экспериментальных условиях, где он может быть трудно сделать в естественных условиях.

Цель этого протокола заключается в демонстрации соответствующего использования функциональных белковых микрочипов для выявления белок-белковых взаимодействий. Это приложение позволяет с высокой пропускной параллельный биохимический анализ белка связывания деятельности с использованием высокоочищенного анализируемого (белок) интересов. С-концевой (карбокси-терминал) помечены V5-фьюжн приманки интерес белок получают из высокого плазмидой в штамме дрожжей, оптимизированной для очистки белков. С-концевой пометки гарантирует, что белок полной длины была переведена. Белок, используемый в данном исследовании, Tda1-V5 слитый белок киназы, который очищают с помощью аффинной никель смолы с помощью тэга His6X. Tda1-V5 слияние строит очищали путем последовательного элюирования с использованием градиента имидазола для элюирования наиболее обогащенную фракцию для использования в анализе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Зонд Подготовка

  1. Культура и очистить V5-киназы фьюжн зондов, используемых для изучения взаимодействий с другими белками следующим образом:
    1. Используйте недавно прожилками деформации Y258 дрожжей (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112), содержащий V5-слитый белок (выраженное с GATEWAY векторных pYES-DEST52). Используйте изолированный белок в качестве зонда на микрочипов. Плита дрожжи на синтетические полная-урацил (SC-Ура) / 2% декстроза / агар и растут при температуре 30 ° С в течение 3 дней с замороженной культуры (-80 ° С глицерин фондовом).
    2. Посев закваски (5-20 мл) от одной колонии и расти в течение ночи в Sc-Ura / 2% декстрозы при встряхивании платформы (220-250 оборотов в минуту) или колесо при 30 ° С.
    3. На следующее утро, привить 400 мл SC-Ура / 2% рафиноза культуры с достаточной культуры стартера до конечного OD 600 0,1.
    4. Расти посевного для OD 600 0,6 с последующим галактозы индукции V5-киназы-фуSion построить выражение с помощью добавления раствора 3x дрожжевого экстракта / пептон (YEP) с добавлением 6% галактозы, добавляя достаточно, чтобы разбавить индукции носитель с коэффициентом 3, так что конечная концентрация галактозы составляет 2%.
    5. Индуцируют клетки при 30 ° С в течение 6 ч на качалке платформы. Используйте 2 л колбу Эрленмейера, чтобы обеспечить надлежащее проветривание.
    6. Урожай клетки с использованием ротора JA-10 (или сопоставимый), вращая 400 мл клеточной суспензии при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
    7. Вымойте клетки один раз с 50 мл ледяной PBS буфер и передают в 50 мл коническую трубку. Вымойте гранул раз в ледяной буфера PBS (без моющих средств или других добавок), используемых для лизиса и передачи до 2 мл оснастки колпачок трубки для лизиса.
    8. Спин клетки при 20000 х г в течение 1 мин при 4 ° С до гранул и пипеткой вдали буфера.
    9. Поместите трубки на льду и заполните лизиса шагу.
    10. Лизировать клетки (250-350 мкл гранул) с 00,5 мм оксида циркония в соотношении 1: 1: объем клеточного осадка, бисера и фосфатно-солевом буфере (PBS) буфере для лизиса 1 и вихревых смеси с использованием агитацией платформа 3 раза в 2-минутными интервалами при 4 ° С.
    11. Центрифуга лизата при 20000 х г в настольной микроцентрифуге в течение 10 мин при 4 ° С.
    12. Пипетка супернатант в поликарбонат высокоскоростной центрифужную пробирку и уточнить по ulracentrufugation в течение 30 мин при 150000 х г при 4 ° С.
    13. Передача осветленной лизата в пробирку, содержащую предварительно промытую Ni 2+ аффинной смолы (~ 100 мкл) и инкубируют на nutator в течение 2 ч при 4 ° С для захвата гистидин (His) 6X помечены V5-слитый белок.
    14. Промыть смолы три раза в течение 10 мин при 4 ° С промывочным буфером. Гранул смолы с использованием таблицы центрифуге в течение 5 мин при 1000 х г при 4 ° С и аспирата супернатант. Добавить свежий промывочный буфер при каждой стирке и вернуться трубки nutator для агитации во время стирки.
    15. После стирки стеPS являются полными, применяют промытый смолы на свежую G-25 колонке дл элюировани.
    16. Применить 25 мкл буфера для элюции в поэтапно, начиная с 100 мМ имидазола до 500 мМ имидазола в 50 мм для приращений в общей сложности 9 фракций.
    17. Анализе собранных фракций использованием додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и Кумасси окрашивания для идентификации наиболее высоко фракции, обогащенной (ы) для использования в анализе и добавить глицерин до 30% и хранить при температуре -80 ° С до использования в Анализ.

2. Исследование массивов

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь шаг 2.6 этого раздела, чтобы подготовить раствор антител до начала анализа.

  1. Для обнаружения взаимодействий, разбавить V5-флуорофор конъюгированного антитела (т.е. AlexaFluor 647) 260 нг / мл в буфере зонда и тщательно перемешать, встряхивая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор антител 30 мин до использования и поместите трубку на nutatили или колеса для обеспечения полного перемешивания и гомогенную суспензию антитела.
  2. Развести белка зонд V5-фьюжн в диапазоне концентраций от 5-500 мкг / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизирован для каждого взаимодействия анализе белок-белок, используя буфер зонда. Оптимизация включает в себя добавление более зондов для исследования буфера. Обычно 10 мкг / мл используют в качестве отправной точки, и соответствующим образом скорректированы на основе сигнала.
  3. Удалить белковых микрочипов из морозильника (-20 ° C) и довести до 4 ° С в холодильнике до использования.
  4. Добавить блокирующем буфере непосредственно держатель слайдов, содержащий белок micorarrays и закрывать верхнюю с парафином, чтобы предотвратить утечку. Блок массивы в блокирующем буфере в течение 1 часа при встряхивании при 50 оборотах в минуту на стадии при 4 ° С.
  5. После блокирования передачи массивов в увлажненной камере охлаждают до 4 ° С и добавляют 90 мкл разбавленного зонда непосредственно на поверхность массива. Наложение обрн я с поднятой скольжения подъемного и инкубировать статическое (не встряхивая) в увлажненной камере при 4 ° С в течение 1,5 ч.
  6. Вымойте массивы 3 раза в течение 1 мин каждый в буфере зонда в трех 50 мл конические пробирки. Добавить слайд, конических пробирок, содержащих достаточно предварительно охлажденной буфера зонд полностью конверт слайд. Разрешить скольжения ручка мягко соскальзывать микрочипов белка (не заставить ее покинуть, как это может привести к повреждению поверхности массива).
  7. Нанесите раствор антител непосредственно в массив сразу после завершения стирки (этап 2.5) и накладку с поднятым скольжения подъемного как раньше. Инкубируйте массивов в течение 30 мин при 4 ° С в увлажненной камере.
  8. Точно так же следует стадия промывки, как и раньше (3 раза 1 мин в буфере зонда) и спина в 50 мл коническую пробирку при 800 х г в настольной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре. Высушите массивов в держатель слайдов в темноте в течение 30 мин перед сканированием массива на 647 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Активность белок-белковое взаимодействие наблюдалось с помощью стандартного считывателя чип оценить Tda1-V5 протеинкиназы слитой конструкции в качестве приманки против белка функциональной микрочипов белка дрожжей, содержащего приблизительно 4,200 уникальную S. Cerevisiae GST-слитые белки. Кроме того допрос с программным обеспечением GenePix показал множество связывания события с различной интенсивностью. Сродство судить по градуированной интенсивности сигнала, полученного из моноклонального V5-флуорофора конъю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, представленные первоначально был выполнен с использованием 85 уникальных дрожжей белка белки киназы-V5 фьюжн сравнить активность связывания через отдельных и связанных семей дрожжи протеинкиназ в результате идентификации новых сетей киназы взаимодействия в естественных условиях 1. Как новая технология профилирования протеомного, развитие Высокая пропускная способность (ПВТ) скрининга с использованием белка протеомов микрочипов полагались на пептидных библиотек, и эукариотических и прокариот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом от NIH. Анализы, показанные на рисунке 1, были выполнены доктором Джозефом Фазоло. Мы благодарим доктора Руи Чена за полезные комментарии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашки ПетриVWRNC-10747или аналогичная
Бакто дрожжевой экстрактDifco0217-17
Бакто пептонDifco0118-17
Бакто агарDifco0140-01
ДекстрозаСигмаD9434
РафинозаСигмаR0514
ГалактозаSigmaG0750
Sc-Ura ПробиркиMP Bio 114410622
для малых культурVWR/Fisher
Большая колба ЭрленмейераVWR/Центрифуга Фишера
JA-10 роторная
центрифуга (500 мл)
Пробирка Falcon (50 мл)VWR/Fisher21008-951
PBS ТаблеткиSigmaP4417
FastPrep Tubes (2 мл пробирка с завинчивающейся крышкой)
FastPrep MachineMP Biomedicals116004500
Цирконовые бусиныBioSpec11079105
Triton X100SigmaP4417
DTTSigmaD9779
MgCl2SigmaM8266 
NaClSigmaS3014 
Имидазол (рН = 7,4)SigmaI5513 
PMSFSigma93482
Полный коктейль ингибиторов (без ЭДТА)Roche11873580001
Коктейль ингибиторов фосфатазы 1сигмаP2850
BSASigmaA2153 
Твин-20SigmaP1379 
ATPSigmaA1852 
Встряхивающий инкубатор (30&�; C)
Nickel Affinity ResinLife TechnologiesR901-01
G25 колонкаGE Life Sciences27-5325-01 
NutatorVWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)Life Technologies
Coomassie Blue StainLife Technologies
Моноклональные антитела V5Life TechnologiesR960-25
Alexa647 Меченые моноклональные антитела V5Life Technologies451098
белковые микрочипы KitLife TechnologiesPAH0525013
Genepix ScannerMolecular Devices
Lifter SlipsThomas Scientifichttp://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
Лизисный буфер: 0,1% Triton X-100, 0,5 мМ DTT,
2 мМ MgCl2, 500 мМ NaCl, 50 мМ имидазола (pH 7,4), полный коктейль ингибиторов протеазы; ЭДТА-free, Коктейль ингибиторов фосфатазы 1, 1 мМ PMSF  (добавить непосредственно перед использованием)		Добавьте реагенты в 1x PBS (0,01 М фосфатный буфер, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия; pH 7,4) для получения желаемого объема раствора лизиса
Блокирующий буфер: 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,1% Tween-20Добавьте реагенты в 1x PBS для получения желаемого объема блокирующего буфера
Зондовый буфер: 2 мМ MgCl2, 0,5 мМ DTT, 0,05% Triton X-100, 50 мМ NaCl, 500 мкм; М АТФ (для киназ), 1% БСАДобавьте реагент к 1x PBS для получения желаемого объема зондового буфера
Промывочный буфер: 0,1% Triton X-100, 500 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT, 50 мМ имидазол (pH 7,4), 2 мМ MgCl<суб>2Добавьте реагент в 1x PBS для получения желаемого объема зондового буфера
Буфер для элюирования: 0,1% Triton X-100, 0,5 мМ DTT, 2 мМ MgCl2, 500 мМ NaCl, 50 – 500 мМ имидазола (pH 7,4), Полный коктейль ингибиторов протеазы; ЭДТА-free, Коктейль ингибиторов фосфатазы 1, 1 мМ PMSF (добавить непосредственно перед использованием)Прежде чем начать, важно отметить градиент концентрации имидазола (50 – 500 мМ) и создать отдельные пробирки для каждой концентрации (желательно создавать интервал с шагом 50 мМ). Добавьте реагент в 1x PBS для получения желаемого объема зондового буфера
3x YEP +6% галактозы: Растворите 30 г дрожжевого экстракта и 60 г пептона в 700 мл H2O и автоклав. Добавьте 300 мл стерилизованной фильтром 20% галактозы (масс./об.)  Галактозу нельзя автоклавировать

Ссылки

  1. Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
  2. Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110(2006).
  3. Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
  4. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
  5. Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  7. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
  8. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
  9. Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
  10. Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
  11. Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
  12. Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
  13. Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
  14. Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
  15. Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
  16. Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).
  17. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

V5

Похожие статьи