In Vitro Модель для изучения клеточной патофизиологии в глобоидных Cell Leukodystrophy

Summary

Глобоидные клетки являются определяющим патологическим признаком болезни Краббе, лейкодистрофии, которая в настоящее время не имеет эффективной долгосрочной терапии. Мы разработали модель клеточной культуры для изучения врожденной биологии и патогенного потенциала активированной микроглии и их трансформации в глобоидные клетки.

Abstract

Точная функция мульти-зародышевого микроглии, называется глобоидных клетки, которые являются уникальными в изобилии в центральной нервной системе глобоидных лейкодистрофия клеток (ООВ), неясно. Этот пробел в знаниях, тормозились отсутствием соответствующей в пробирке модель для исследования. Здесь мы описываем начальную мышиный глиальных систему культуры, в которой лечение psychosine результатов в многоядерных микроглии, напоминающих характерные глобоидных клетки, найденные в GLD. Используя эту новую систему, мы определили условия и режимы анализа для изучения глобоидных клеток. Потенциальное использование этой модельной системы была подтверждена в нашем предыдущем исследовании, в котором определены потенциальную роль металлопротеиназы матрикса (ММР) -3 в GLD. Этот роман в пробирке системы может быть полезной модели, в которых исследовано образование и функцию, но и потенциальную лечебные манипуляции, этих уникальных клеток.

Introduction

Глобоидных клеток лейкодистрофия (GLD), известный также как болезнь Краббе, является смертельным заболеванием демиелинизирующая результате потери функциональных мутаций в galatocerebrosidase (Galc) гена ^1. Наиболее распространенной формой GLD является инфантильный вариант, который символизируется начала в раннем детстве и характеризуется агрессивным клиническим течением двигателя и снижение когнитивных, ведущей к преждевременной смерти часто до пяти лет ^2,3. Генетическое тестирование используется для проверки диагноза GLD ^4. Невропатологии из GLD показывает широкое демиелинизации, атрофия нейронов, астроглиоз и присутствие налиты кровью нескольких ядросодержащих микроглии названием глобоидных клетки ^5-7. Идентификация глобоидных клеток, часто содержащие tubulous включений в их цитоплазме, был определяющей чертой GLD за последние 97 лет, хотя специфическая функция этих заметных клеток остается неуловимым.

Участие не-MYELinating глии (микроглии и астроциты) в патогенезе GLD уже давно считается вторичным ответом на глубокой демиелинизации при этом заболевании ^8. Интересно, что первое описание этого заболевания, сделаны Кнуд Краббе в 1916 ^5, сообщили образование многоядерных фагоцитов, содержащих липидов мусора, которые были с именем 'глобоидных клетки »и является определяющей характеристикой этой болезни.

Глобоидных клетки являются отличительной чертой особенностью GLD патологии, хотя их роль в GLD уже давно игнорируются. Интересно, что эти клетки являются одними из первых характерных изменений в ЦНС ткани ООВ. Этот недостаток знаний может быть связано с предположением, что образование многоядерных фагоцитов, называемых гигантских клеток в других заболеваний, как правило, рассматривается как следствие патологии, а не начальной патогенного движущей силы ^9. Поэтому, было мало исследований, изучающих механизм по WHICH глобоидных клетки образуются из фагоцитов, особенно в ЦНС ООВ. Процедура, описанная в этом отчете основное внимание уделяется важности формирования глобоидных клеток в ЦНС и нашей предыдущей демонстрации, что psychosine вызванной многоядерных микроглии в пробирке и этих клеток выставлены более высокие уровни фагоцитарной активности. В соответствии с этими наблюдениями, глобоидных клетки в мозге Twitcher часто содержат PAS-положительных мусора, предлагая высокий уровень фагоцитарной активности. Глобоидных клетки также установлено, что иммунопозитивных для ферритина (микроглии маркер) ^10, КП-1 / CD68 (моноциты маркер), а некоторые также положительны для виментина (белок промежуточных накаливания и маркер астроцитов и активируется микроглии) ^11, HLA-DRA (поверхность рецепторов MHCII), и TNF-α ^7, и МБА-1 (кальция связывающий белок используется для идентификации микроглии) ^12. На основе этой коллекции маркеров, глобоидных клетки происходят из микроглии, которые развиваютсяуникальный фенотип.

Несмотря на их уникальности, специфическая функция и вклад ГК в GLD патогенезе в значительной степени игнорируется. Глобоидных клетки были считается вторичным следствием хронического демиелинизации. Тем не менее, последние исследования, посвященные изучению временную ассоциацию глобоидных клеток белой материи патологии GLD определили присутствие глобоидных клеток в конце эмбрионального к ранних послеродовых периодов; раз предшествующие олигодендроцитов апоптоз и открытой демиелинизацию ^13. Таким образом, временная последовательность развития невропатологии в ООВ предполагает, что глобоидных клетки формируются в заранее демиелинизации при этом заболевании ^14. Это привело к нашей гипотезе о том, что рано формирование глобоидных клеток в GLD может представлять определяющую патогенную событие, а не вторичной, реактивной ответ на повреждение олигодендроцитов ^15. Кроме того, нарушение регуляции микроглии деятельности в GLD был рассмотрен фактог ограничения долгосрочного эффективность hematopeotic терапии стволовыми клетками для лечения этого заболевания ^16. Таким образом, исследования клеточных функций и регулирование микроглии и глобоидных клетки, в ответ на psychosine, как ожидается, обеспечит новый взгляд на патогенез GLD.

До недавнего времени, отсутствие соответствующей модели, в которой можно изучать формирование глобоидных клеток не ограничил понимание функции точного и вклад этих клеток в патологии GLD. В недавних исследованиях было установлено, что глобоидных-подобные клетки могут образовываться в качестве прямого ответа на psychosine, патогенную липидный токсин, который накапливается в GLD. Мы обнаружили, что микроглии, но не макрофаги, активируются и превращаются в глобоидных клеток в первичных глиальных культур в ответ на psychosine ^15. Это превращение в глобоидных клеток было обнаружено, что при посредничестве внеклеточной протеазы, металлопротеиназы матрикса (ММР) -3 ^15. Совсем недавно мырасширили эти выводы и решил, что psychosine активированные микроглии и глобоидных клетки, разработанные в этом экстракорпорального модельной системы являются мощно токсичен для олигодендроцитов и клеток олигодендроцитов предшественников. Следовательно, если рассматривать его в контексте GLD, в начале накопления psychosine и формирования глобоидных клеток перед демиелинизации поддержит формирующийся первичный и, возможно, патогенную роль для микроглии при данном заболевании.

Мы предлагаем, что изучение формирования глобоидных клеток откроет новую информацию о патогенезе GLD, что будет способствовать нашему пониманию этого заболевания. Кроме того, этот новый сотовый модель GLD может обеспечить новый формат, из которого новые терапевтические подходы для решения патологические изменения при этом заболевании могут быть проверены. Следовательно, в данном отчете мы предоставляем подробный протокол для развития в пробирке psychosine вызванной глобоидных клеток из первичных культурах не-myelinating глии.

Protocol

Все процедуры с участием животных были проведены в соответствии с Политикой по гуманное лечение и использования лабораторных животных изложены Управлением лабораторных животных благосостояния (NIH) и только с одобрения уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) университета Коннектикут Центр здоровья.

1 Получение смешанных глиальных культур

1. Стерилизовать все инструменты перед использованием. Добавить 3 мл охлажденного льдом стерильный сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS), не содержащего катионы (Mg ^{2 +} или Ca ^{2 +)} к трем стерильных 60 мм чашках Петри, поддерживаемых на льду, чтобы сохранить холод.
2. Изолировать кору от послеродовых P0-P2 щенков мыши, как описано выше ^17,18.
   ПРИМЕЧАНИЕ: подкорковых структур, таких как гиппокампе, не включены в этих культурах.
3. Осторожно снимите мозговые оболочки, а затем перевести выделенные кору на свежий ССРХ и отделить ткани ферментами, используя пеурал ткани рассечение комплект в соответствии с протоколом производителя.
4. Пластина клеток в стерильных Т-175 колб и инкубировать в течение ночи в среде [изменение Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), содержащую 1x пенициллина / стрептомицина].
5. Заменить все средства массовой информации на следующий день со свежей информации. Продолжали инкубировать культур, с регулярными изменениями СМИ, в течение приблизительно 3 недель или до сотовой монослоя устанавливается.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это монослой будет состоять из астроцитов и микроглии с примерно 10: 1 соотношении ^19.

2 глобоидных сотовый Индукционная в смешанных глиальных культур

1. Подготовьте ECM-покрытием покровные.
   1. Замачивание круговые покровные стерильной 1 N соляной кислоты (HCl) в стерильную чашку Петри в течение 30 мин. Вымойте покровные стерильными 3x воды, а затем замочить в 95% этанола в течение не менее 20 мин. а потом пусть воздушно-сухой.
   2. Место капельки разбавленной внеклеточной MATRIX (ЕСМ) белок, покрывающие материалы на листе парафильмом (например, 150-250 мкл / капелька ламинин 10 мкг / мл, растворенного в стерильном растворе фосфатного буфера [PBS]). Распределите капель так, чтобы покровные не коснется при размещении на этих капель. Аккуратно поместите каждую высушенную покровное на капли с помощью щипцов.
   3. Оставьте покровные на каплях в течение ок. 4-6 ч внутри капот культуры с створки.
   4. Поместите ECM-покрытием покровные (ECM-покрытием вверх) в каждой из лунки 24-луночного планшета. Вымойте каждую лунку стерильной PBS 3x и держать при температуре 4 ° С до использования.
2. Подготовка глиальные клетки для Покрытие на покровные.
   1. Аспирируйте носители из глиальных культур и аккуратно мыть глиальных однослойных 3 раза с 10 мл стерильной PBS. Далее, добавляют 8-10 мл раствора трипсина-ЭДТА в Т-175, и инкубируют в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С.
   2. Когда большинство из монослоя была отдельно, добавляют 20 мл полной средыВ колбу, чтобы остановить трипсинизации. Соберите носителей, содержащих отдельные клетки в 50 мл коническую трубку и вращаться в течение 10 мин при 300 мкг в при комнатной температуре.
   3. Аспирируйте супернатант, не нарушая гранул, а затем повторно суспендирования клеток в 2 мл свежей полной среды, осторожно пипеткой раствора с помощью пипетки P1000.
   4. Определить количество клеток с помощью гемоцитометра, а затем вновь приостановить клеток в полной среде при желаемой плотности (например, 10 ⁵ клеток / мл). Пластина клеток на ECM-покрытием покровные (например 500 мкл в каждую лунку 24-луночного планшета). Добавить дополнительные свежие полные СМИ в каждую лунку для 3-5 дней инкубации при 37 ° С, или пока клетки растут в нужное визуального слияния.
3. Лечение Psychosine.
   1. Развести psychosine к фондовой концентрации (108,3 мм) в диметилсульфоксиде (ДМСО). Развести этот запас в 100% этанола, чтобы сделать рабочую запас, который можетн быть добавлены в каждую лунку 24-луночного планшета для достижения конечной концентрации 10 мкМ.
   2. Во время добавления psychosine, нежно вихревой культуральный планшет для смешивания psychosine в культуральной среде. Дополнить psychosine, добавив эквивалент 10 мкМ через день в течение одной недели.
4. После 7 дней psychosine лечения, собрать средства массовой информации и пипеткой 500 мкл холодного 4% параформальдегида (PFA) в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы зафиксировать клетки. Затем промыть каждую лунку 3x с PBS, а затем сохранить пластины при 4 ° С, пока не обработаны для иммуногистохимии (смотри ниже).
   Примечание: культуральные среды клеток могут быть собраны для ферментативного анализа ELISA или в этом пункте, если это необходимо.

3 Иммуноцитохимия (ICC), чтобы визуализировать глобоидных клеток

1. Заменить PBS с блокирующим буфером [PBS + 0,3% Твин-20 + 5% нормальной козьей сыворотки (NGS)], и инкубируют клетки в течение 1 часа при комнатной температуре.
2. Вcubate фиксированные клетки в первичной антисыворотки против Iba-1 [(1: 1000), разведенного в PBS + 0,3% Твин-20 + 2% NGS] в течение по крайней мере 1 ч при комнатной температуре, затем промыть каждую лунку PBS с 3-кратным 5 мин / мыть.
3. Добавить соответствующий вторичный флуоресценции-конъюгированного антитела для выявления первичной маркировки антитела и против пятен с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 1: 1000), чтобы определить ядра. Инкубировать в растворе вторичного антитела в течение 1 часа при комнатной температуре и промывают PBS, 3-кратным 5 мин.
4. Установите каждый покровного стекла для микроскопа слайды, используя монтажную среду. Просмотреть скользит по флуоресцентным микроскопом для визуальных и количественного анализа.

4 Анализ и характеристика глобоидных клеток в первичной культуре

1. Используйте следующие три морфологические критерии для идентификации глобоидных клетку в культуре:
   1. Определить глобоидных клеток с использованием флуоресцентной микроскопии на иммунопозитивных маркировки для микроглии маркера, МБА-1 +.
   2. Определитьглобоидных клетки как polynucleated (т.е. содержащих два или более DAPI положительных ядер).
   3. Определить глобоидных клетки округлой морфологии отличной от сильно разветвленного появления отдыхает клеток микроглии.
      Примечание: Клетки могут быть собраны на поверхности клетки анализа и количественного маркера путем проточной цитометрии из этих культур.
2. Измерение фагоцитарную активацию микроглии и глобоидных клеток
   1. Для оценки фагоцитарной активности psychosine обращению микроглии, добавить FITC-меченных латексные шарики в лунки в соответствии с инструкциями изготовителя. Добавить люминесцентная-сопряженные латексные шарики 48 ч до фиксации с PFA. Fix клетки, обработанные с бисером (как уже упоминалось в разделе 2.4), и процесс иммуноцитохимии (как описано в разделе 3).
   2. Выберите флуорофорные-сопряженных вторичными антителами, так что они не перекрываются флуоресцентного спектры излучения флуорофорные помечены бисером.
   3. Analyzэ то phagocytotic профили МБА-1 + микроглии путем выявления тех клеток, которые ко-локализуются с флуоресцентно-меченых бисером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Psychosine активирует микроглии. Фагоцитированы шарики будут определены в Мононуклеированные и многоядерными МБА-1 + клеток в этой обстановке культуры.

5 Индукция глобоидных клеток из Очищенная микроглии культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативный подход к расшифровать межклеточной сигнализации между астроцитов и микроглии является еще одним преимуществом этого в пробирке глобоидных ячеечной модели. Очистка первичных клеток микроглии для replating или совместного культивирования может быть достигнуто за счет их более низкой имущества присоединения в культуре, как описано в следующих этапов (см раздел 5.2).

1. Сбор средств массовой информации в конфлюентных смешанных глиальных культур в 50 мл коническую трубку и поддерживать его при 37 ° С в инкубаторе.
2. Микроглии Изоляция от первичных смешанных глиальных культур.
   1. После удаления носителя из сливной смешанной культуры глиальных T175 колбу, добавьте теплые встряхивания сред [состоящие из полной среды + 25 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислоты (HEPES) + 25 мМ бикарбоната натрия (Sigma)]. Встряхнуть колбы для 3-4 ч в орбитальном шейкере при 100 об (37 ° C). Сбор средств массовой информации из этих потрясших колбах на 50 мл конические пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот носитель будет включать в себя менее клейкий микроглии от колб.
   2. Спин носитель при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и затем повторно суспендирования клеток в 2 мл астроцитов-кондиционированной среды (собранные на шаге 5.1).
   3. Установить количество клеток получали с использованием гемоцитометра, а затем пластины в клетки микроглии на подложку с покрытием покровные (смотри раздел 2.1) для иммуногистохимии, или пластину на сверхнизких следование луночных планшетах для будущего сбора глобоидных клеток для совместного культивирования с другими типами клеток, такие как олигодендроциты (как алфавитуribed в следующем разделе).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После покрытием микроглии можно лечить с psychosine (10 мкм), как описано выше (см раздел 2.3).
3. Co-культура с первичных олигодендроцитов для анализа цитотоксичности.
   Примечание: Сбор psychosine обработанных микроглии от низкого прилипания пластин для последующего совместного культивирования на первичных культурах олигодендроцитов, клеток или клеток-предшественников олигодендроцитов, может быть использован для изучения потенциальной цитотоксической функции этих глобоидных-подобных клеток в пробирке.
   1. Разработка культур первичных олигодендроцитов, применяющих установленные методы ^18,20. Чтобы собрать psychosine обработанных микроглии, осторожно пипеткой, чтобы отделить слабо прилипшие клетки из нижней части скважины. Сбор клеток, центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин, а затем осторожно ресуспендируют в среде для дифференцировки олигодендроцитов [состоящей из Neurobasal сред, L-глутамин (1x), В-27 добавки (1x), и трийодтиронина (Т3, 10 нг / мл )].
   2. Подсчитайте число клеток с помощью гемоцитометра, а затем семена микроглии на олигодендроцитов культуры в 1 × 10 ⁵ клеток / мл, в результате чего приближенного 1: 2 / микроглии соотношении олигодендроцитов. Выдержите в качестве со-культуры на срок до 3 дней.
   3. Fix клетки для иммуноцитохимии (см раздел 2.4). Соберите культуры клеток для ELISA или химические анализы по мере необходимости.

Results

Этот протокол, как написано, как ожидается, займет около 36 дней, чтобы завершить от начала до конца (см Рисунок 1: Экспериментальная Workflow Scheme). Это был наш опыт, что развитие «глобоидных-как" клеток в этой первичной системе культуры является одновременно надежным и воспроизводимым: формирование многоядерных клеток в ответ на psychosine последовательно наблюдается с 7 дней лечения.

Иммуноцитохимическая окрашивание микроглии использованием МБА-1 в сочетании с ядерной к...

Discussion

Протокол, описанный здесь предоставляет новую модель системы, в которой для изучения развития и функциональные характеристики активированных микроглии и глобоидных клеток. До работы на Im соавт. с использованием клеточной линии HEK293 условии шаблон для разработки настоящего протокола для изучения формирования глобоидных клеток ^21. Важно также отметить, что глобоидных клетки, полученные в модели отличаются от родных глобоидных клеток идентифицируемых в GLD. Например, мы регулярно наблюдали quadranucl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Хэнк s сбалансированный раствор соли (HBSS), не содержащий катионов (Mg2+ и Ca2+).	Life technologies	14175-095
Набор для диссоциации нервной ткани	Miltenyi	130-092-628
40 μ m клеточное ситечко	Fisherbrand	22363547
Hank' s сбалансированный раствор соли (HBSS), содержащий катионы (Mg2+ и Ca2+).	Gibco	14025-092
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)	Gibco	11995-065
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Пеницилин/стрептомицин	Life technologies	15070-063
Ламинин	Sigma	L2020
Трипсин-ЭДТА раствор	Life technologies	25299-056
Психозин		Sigma P9256
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Сигма	D2650
Параформальдегид (PFA)	Электронная микроскопия Наука	19208
Нормальная козья сыворотка (NGS)	Инвитроген	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor конъюгированный antisera	Life Technologies	Различные
монтажные среды	Southern Biotech	OB100-01
Набор для фагоцитарного анализа	Cayman Chemicals	500290
HEPES	Sigma	BP310-500