Коллекция, Изоляция и проточной цитометрии анализа человеческой Endocervical образцов

Краткое содержание

Использование отбора цитобрашных проб для сбора лимфоцитов и моноцитов из эндоцервикса является минимально инвазивным методом, который предоставляет образцы для анализа иммунитета женских половых путей. В этом протоколе мы описываем сбор образцов цитощетки и выделение иммунных клеток для анализов проточной цитометрии.

Аннотация

Несмотря на важность патогенов слизистых оболочек для здоровья населения (включая ВИЧ), относительно мало известно об иммунитете слизистых оболочек, особенно в женских половых путях (FGT). Поскольку гетеросексуальная передача в настоящее время представляет собой доминирующий механизм передачи ВИЧ, а также учитывая непрерывное распространение инфекций, передающихся половым путем (ИППП), крайне важно понимать взаимодействие между хозяином и патогеном на слизистой оболочке половых органов. Существенные пробелы в знаниях об иммунитете к ФГТ частично связаны с трудностями успешного сбора и обработки образцов слизистых оболочек. Чтобы облегчить исследования с достаточным размером выборки, методы сбора должны быть минимально инвазивными и эффективными. С этой целью оптимизирован протокол сбора образцов цервикального цитощетки и последующего выделения цервикальных мононуклеарных клеток (КМЦ). Используя иммунофенотипирование на основе проточной цитометрии ex vivo, можно точно и надежно количественно оценить частоты и фенотипы популяции лимфоцитов/моноцитов КМЦ. Этот метод может сочетаться со сбором цервикально-вагинального лаважа (CVL), который содержит растворимые иммунные медиаторы, включая цитокины, хемокины и антипротеазы, все из которых могут быть использованы для определения противовоспалительной или провоспалительной среды во влагалище.

Введение

Большинство новых случаев ВИЧ-инфекции во всем мире возникают в результате гетеросексуальных контактов, при этом женщины, представляющая 47% новых случаев инфицирования в 2011 году (ЮНЭЙДС ^1). Понимание женский генитальный тракт (Fgt), один из главных порталов входа для ВИЧ и других инфекций, передающихся половым путем, имеет большое значение на пути к поиску эффективных стратегий для предотвращения инфекции. Иммунный ответ на слизистой оболочки половых органов, очевидно, уникальным и отличаться от тех, измеренный в периферической крови ^2. Однако современные знания иммунных динамики на FGT ограничивается в лучшем случае. На сегодняшний день исследования слизистой иммунной среде в значительной степени сосредоточена на кишечником лимфоидной ткани (Галт), где стало ясно, что ранние события в слизистые ткани следующие инфекции оказывают сильное влияние на последующее прогрессирования заболевания ^3,4. Сбор образцов из слизистой оболочки половых органов представляет собой серьезную проблему, и по меньшей мере частично ответственным за LacК от понимания иммунологии FGT. Решение головоломки иммунной динамике между организмом хозяина и возбудителем в контексте отдельной среде, FGT требует эффективных методов сбора и анализа образцов из этой местности.

FGT делится на две части: верхняя репродуктивного тракта, что включает в себя маточные трубы, эндометрий и канала шейки матки, а нижний тракт, который содержит Ectocervix и влагалище (обзор Kaushic др. ^5). До сих пор неясно, что относительный вклад этих различных сайтов к ВИЧ-инфекции, но считается, что оба сайта может способствовать проникновения ВИЧ ^6. Т-клетки представляют 40-50% лейкоцитов в верхних и нижних половых путей, в то время как макрофаги содержат приблизительно 10% (обзор в Rodriguez-Garcia и др. ^2). Т-клетки могут быть обнаружены в влагалища, шейки матки и матки. Макрофаги сильнее Localiзет в эндометрии и соединительной ткани миометрия, чем шейки матки, хотя они могут быть обнаружены в обеих тканях. Наконец, плазмацитоидных дендритные клетки (ЦПК) и клетки Лангерганса также могут быть обнаружены в НАШИ АДРЕСА тканей. Фенотип и пропорции иммунных населения и их восприимчивости к ВИЧ-инфекции может варьироваться главное соответствии с гормональными циклами, использование гормональных контрацептивов, бактериального вагиноза или сексуальные действия ^5,7-9.

Разнообразные методы были разработаны для изучения иммунной населения и окружающей среды FGT. Рак шейки биопсия, шейные cytobrushes и цервиковагинальная орошений (ЛПМ) ^10-12 являются наиболее часто используется во литературе. Коллекция ЛПМ на PBS промывания является самым простым методом и позволяет изучение иммунных модуляторных белков, но приводит к чрезвычайно низким выходом клеток, и поэтому не подходит для изучения популяций иммунных клеток на FGT ^13. Образцы масел и АКБ являются, с другой стороны, обERy полезен для оценки иммунного среду FGT путем измерения экспрессии различных цитокинов, хемокинов или антимикробных факторов с использованием методов, таких как ELISA, цитокин борта массива ¹⁴ или масс-спектрометрии ^15,16. Характеристика частот иммунных клеток, фенотипов и функций может быть достигнуто путем сбора мононуклеарных клеток шейки матки (CMC) шейки щеточкой Cytobrush или путем отбора проб биопсией шейки матки.

Выборки шейки биопсия инвазивный метод, который увеличивает дискомфорт и риск кровотечения и занимает от 2 до 11 дней, чтобы залечить после процедуры в зависимости от иммунного статуса женщины ^12. С другой стороны, рак шейки cytobrushes, несмотря на более низкий выход клеток, собранных, является менее инвазивным и более удобный способ для сбора иммунных клеток из FGT. Оба метода могут достичь такого же выход CD45 + лейкоцитов, но два последовательных шейки cytobrushes необходимы для получения такого же количества клеток, содержащихся ян один биопсия ^13. Тем не менее, отбор проб цитощеточка еще обеспечивает приемлемый количество клеток (около 5000 CD45 + клеток / цитощеточка) для дополнительной экс естественных фенотипирования с помощью проточной цитометрии ^14. Кроме того, функциональные характеристики можно проводить на этих образцах, как стимулирование и внутриклеточный проточной цитометрии или КПЦР были выполнены с использованием цитощеточка полученных КМЦ, чтобы определить ВИЧ-специфические иммунные реакции ¹⁷ или Th клеток поляризацию ^18. Расширение клеток населения T может также облегчить функциональные исследования с ОМЦ ^19.

Важно отметить, что биопсии и cytobrushes образец различных частей FGT. Биопсии получены из верхней части эпителия и стромы Ectocervix ^12,13, в то время шейки cytobrushes пробовать шейки матки, сбор клеток, полученных из эпителия канала шейки матки и, предположительно зоны трансформации. Следовательно, с образцами цитощеточка попробовать повторноГион состоит из одного слоя цилиндрического эпителия, в то время биопсии, включать область выстлана плоскоклеточный многослойного эпителия ^5. В результате, природа популяций лейкоцитов, собранных цервикальной биопсии и щеточкой Cytobrush отличается. Биопсия собрать более высокую долю CD3 + Т-клеток, в то время как cytobrushes привести к коллекции более высокая доля CD14 + моноциты / макрофаги ^13.

Изучение иммунологии FGT был интерес на протяжении многих лет ^20-22, и мы накопили огромный опыт с изучением цитощеточка полученных СМС. Наши исследования сосредоточены в основном на изучении ВИЧ-инфицированных, неинфицированных и ВИЧ-инфицированными серонегативных (HESN) работница секс от Найроби, Кения. ВИЧ преимущественно размножается в активированных Т-клеток ²³ и меньшее число активированных клеток, которые могут быть мишенью ВИЧ в FGT могли бы способствовать защите от заражения ВИЧ. В соответствии с этой гипотезой, несколько Studiэс описали низкую иммунную активацию среди HESN работников секс-бизнеса, которые подвергаются высокому ВИЧ еще остаются неинфицированных ^24,25, и это в состоянии покоя фенотип наблюдается также в FGT ^14. Здесь мы описываем методологию для обработки и оценки Т-клеток активации в образцах CMC, полученных из шейки матки cytobrushes экс естественных проточной цитометрии.

Протокол

Заявление этика: по этике научных исследований доски как в Университете Манитобы и Кениата Национальной больницы / Университет Найроби одобрил это исследование и письменное информированное согласие было получено от всех участников исследования.

1. Подготовка информации и КМЦ Коллекция Трубы

1. Подготовка забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) (137.93 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 8,1 мМ Na ₂ HPO _4, 1,47 мМ KH ₂ PO _4). Автоклав на стерильность. Это может храниться при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев.
2. Предварительно Аликвота 5 мл PBS в 50 мл трубки сокола (по одному на образце должны быть собраны) и хранить при температуре 4 ° С до времени отбора проб.
3. Этикетка 2-4 криопробирки или 1,5 мл микроцентрифужных пробирок на образец для сбора промывание для хранения.
4. Подготовка культуральной среды клеток: RPMI 1640 + 1% пенициллин / стрептомицин / амфотерицин В (конечная концентрация 100 единиц / мл, 100 мкг / мл и 250 нг / мл, respectivелы, без FCS / FBS добавил.

2. Сбор цитощеточка образцов

Сбор образцов цитощеточка является неинвазивная процедура, которая должна быть выполнена квалифицированным MD или гинекологу.

1. Сбор шейки мононуклеарных клеток (КМЦ) с использованием как цитощеточка и деревянным или пластмассовым скребком. Сбор CMC от участника под зеркалах экспертизы, вставив скребок и вращающихся вокруг шейки матки (рис. 1). Вставьте цитощеточка в эндоцервикальных ОС, повернуть на 360 °, и сразу же разместить как цитощеточка и скребок в 50 мл трубки сокола, содержащей 5 мл PBS.
2. Держите образцы на льду / на 4 º C до обработки. Для поддержания жизнеспособности клеток, образцы процесса в пределах 2 часов сбора.
3. Если это возможно, собирать соответствующих образцов крови в зеленых лучших vacutainers гепарина для мононуклеаров периферической крови клетки (РВМС) изоляции в качестве компаратора / контроля для анализа CMC.

3. Выделение ОМЦ

Выполните обработку образца в уровень биологической безопасности 2 лаборатории, в стерильной камере биобезопасности с двойными перчатками.

1. Во время сбора, образцы CMC может быть загрязнены кровью. Исключить образцы с видимой контаминации крови из исследования, чтобы предотвратить включение сбивающий РВМС в конечном образце. В связи с низким числом лимфоцитов, выделенных из CMC, незначительные загрязнения крови может легко сокрушить компонент лимфоцитов CMC.
2. Vortex сокол пробирки, содержащие как цитощеточка и скребок для 45 сек отделить клетки от щеток. Образцы могут стать пенистый в ходе этого процесса; это нормально.
3. Используйте цитощеточка, чтобы очистить все оставшиеся материалы от скребка, и выбросьте скребок в раствор отбеливателя. Для сбора любых клеток остаются прикрепленными к кисти / скребком, использовать новый перчатку выжать скребок между большим и указательным пальцами.Скатитесь щетку, позволяя клеткам и PBS быть собраны в одной 50 мл пробирку. Откажитесь от цитощеточка в раствор отбеливателя, и выбросить перчатку.
   ВАЖНО: Используйте новую перчатку для каждого образца.
4. Установите 100 мкм фильтр нейлон клеток к свежим 50 мл трубки сокола. Использование передачи пипетки, собирать PBS-клеточной суспензии из пробирки и процеживают через сито в чистую пробирку.
5. Добавить 5 мл RPMI 1640 с первоначальным пробирку. Использование передачи пипетки, мыть стороны пробирку с RPMI, и передать через фильтр на новый пробирку. Промыть нижнюю часть нейлоновый фильтр с RPMI, а также.
6. Центрифуга образцов для 10 мин при 514 х г. Очень важно, чтобы оставить центрифуги тормоз с на этом этапе, с тем чтобы предотвратить оплывание гранул CMC.
7. Осторожно удалите супернатант из трубы, заботясь, чтобы не беспокоить гранул. Размер гранул будет сильно варьирует; в такмне образцы, осадок довольно большой из-за наличия большого числа эпителиальных клеток, в то время как в других случаях, осадок едва заметны и высокой прозрачностью.
8. Ресуспендируют гранул нежным агитации трубки сокола. Добавить 5 мл PBS мыть образец.
9. Центрифуга снова в течение 10 мин при 514 х г, без центрифуги тормоза.
10. Осторожно отбросить супернатант и вновь приостановить гранул, как описано выше. Клетки готовы к любой криоконсервации (с использованием протокола криоконсервации РВМС), стимуляции или проточной цитометрии фенотипирования.

4. Поверхность CMC Окрашивание и проточной цитометрии

1. Ресуспендируют гранул с шагом 3,10 в 100 мкл блокирующего раствора и передать либо в 96-луночный планшет или FACS трубы. Блокирующего раствора (блокировать рецепторы Fcγ) рецепт следующим образом: 1,8 мкл IgG мыши (конечная концентрация 0,2 мкг / мкл), 5 мкл FBS и 93,2 мкл FACS мыть (PBS + 2% FBS).Окрашивание может быть выполнена в 96-луночный планшет, если размеры гранул достаточно малы, но, возможно, должны быть выполнены в FACS труб, если гранулы обычно велико. Важно, чтобы титровать антител соответственно.
2. Блок образцы в течение 10 мин на льду / при 4 ° С.
3. Промывают клетки 100 мкл FACS Wash (PBS + 2% FBS) в 96-луночных планшетах, или 500 мкл FACS в трубах. Центрифуга при 600 мкг в течение 10 мин при 4 ° С с тормозом низкий (или выключить, если низкий Установка тормоза недоступен).
4. Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок клеток при перемешивании. Добавить жизнеспособность Пятно (Живые Мертвые поправимо жизнеспособность красителя). Подготовка жизнеспособность красителя в соответствии с инструкциями изготовителя. Это, возможно, должны быть титрованию для использования в каждой лабораторной установке / цитометра. Выдержите в течение 30 мин в темноте при 4 ° С.
5. Вымойте клетки 100 μl/500 мкл PBS (для 96-луночных труб пластина / FACS). Центрифуга при 600 мкг в течение 10 мин с низким / без тормозов. Удалить supernatanт и ресуспендирования клеток.
6. Инкубируйте клетки с коктейлем поверхностных маркеров антител, в общем объеме 100 мкл. ВАЖНО: Оптимизация и титруют каждый проточной цитометрии панели предварительного попробовать окрашивание. Инкубируйте клетки в течение 30 мин в темноте при 4 ° С.
7. Повторите шаг 4,5. если окрашивание в 96-луночный планшет, передача клеток в FACS трубы и разбавьте до конечного объема 750 мкл FACS краска, которая содержит 1% параформальдегида (PFA) (или Cytofix, разбавленный 1 в 4). Перейдите к сбора данных на цитометром потока.

5. Сбор и подготовка шейки промывания влагалища (ЛПМ)

1. До цитощеточка выборки, использовать шприц для мытья канала шейки матки с 2 мл стерильной PBS и аспирации промывание от заднем своде.
2. Соберите атмосферный образец промывание в 15 мл трубки сокола и не держать на льду / на 4 º C до обработки.
3. Центрифуга образца при 400 х г в течение 7 минут дл удалени клеточного дебриса.
4. Колорадоllect супернатанта аликвоту образца в 1 мл или 500 мкл аликвоты и хранят при -70 ° С. Аликвоты можно разморозить для ELISA или анализа шарик массива CVL белков, но избежать многократного замораживания / оттаивания.
5. При желании ресуспендируют осадок из клеточных остатков в РНК Позже для измерения экспрессии РНК, следуя протоколу производителя.

6. Сбора данных

1. Подготовить набор компенсационных труб, соответствующий панель антител. Запуск компенсации трубки для регулировки спектрального перекрытия. Запустите образцы на любой потока многоцветной цитометра, настроенный для флуорохромом сопряженных антител, используемых в панели.
2. Приобретать образец РВМС сначала отрегулировать рассеяния вперед (FSC) и бокового рассеяния напряжения (SSC) в целях выявления популяции лимфоцитов. Старайтесь держать их на 100 на каждой оси в линейном масштабе. Запуск контроль РВМС сделает его значительно легче найти популяции лимфоцитов CMC.
3. Порог FSC для образцов CMC может потребоваться увеличение относительно образцов РВМС из-за намазать вверх по оси SSC при низких значениях FSC.
4. Vortex каждую пробирку до приобретения. Приобретать всю трубу, чтобы максимально увеличить количество лимфоцитов ворот событий, собранных. Тщательно следить за машиной, чтобы избежать засорения.
5. Экспорт данных в программу анализа проточной цитометрии, таких как FlowJo.

7. Память Стратегии

1. Выберите передней стороне разброс высокий (FSC-H) / Вперед площадь боковой разброс (FSC-А), чтобы определить, население синглетный.
2. Выберите Время против флуоресцентный маркер (как, например, FITC) для контроля за качество приобретения. Изменение скорости потока может ввести артефактов в данных. Исключить любую область, которая показывает расхождение в скорости потока.
3. Определить популяции лимфоцитов на SSC-A/FSC-A участка. Используйте контроль РВМС для облегчения идентификации. Обратите внимание, что население лимфоцитов CMC может быть не так ясно, как контроль РВМС.
4. Ворота на SSC-A/viability красить, чтобы исключить мертвые клетки с живыми клетками. Мертвые клетки могут неспецифически включать антитела, которые будут вводить артефакты.
5. Ворота на SSC-A/CD3 идентифицировать популяции клеток T. Из этих ворот, определить группы населения, CD4 + и CD8 +.

Результаты

Мультипараметрический проточной цитометрии является мощным инструментом рассекать фенотипы и функции клеточных подмножеств в ранее неохарактеризованных тканей. Анализ проб CMC может дать информацию как лимфоцитов и моноцитов населения с соответствующих стратегий селекции.

Представитель CMC стратегия стробирования, по сравнению с согласованной профиль РВМС, показан на рисунке 2. FSC-против FSC-H участка позволяет исключить клеточных дублетов, которые широко распространены в о...

Обсуждение

С учетом больших пробелов в знаниях в отношении иммунитета в женских половых путей (ФГТ), фенотипическая анализ ОМЦ может обеспечить широкий спектр идеи на несколько популяций лимфоцитов на шейке матки. В сочетании с протеомного анализа и измерений вирусной нагрузки в шейном промывания, иммунитет к инфекциям, передающимся половым путем (ИППП) с и других патогенов можно разрезать в различных популяциях.

Технические аспекты - ОМЦ: Выделение и успешным окрашивание образцов CMC ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 μ m клеточное ситечко для 50 мл Falcon tube	BD	352360	CMC обработка
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC
Фетальная бычья сыворотка	Life technology	16000044	CMC обработка
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC обработка
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC обработка
50 мл Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC обработка
Банк крови одноразовая переводная пипетка	Fisher	13-711-6M	CMC обработка
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC
Одноразовый цервикальный скребок	Quick medical	2183	CMC для отбора проб
15 мл Falcon tube		Fisher 14-959-70c	Пробирка для обработки CVL
1,5 мл Eppendorf	Fisher	05-402-18	Хранение CVL
LIVE/DEAD Набор для окрашивания клеток	Invitrogen	Различные	реагенты проточной цитометрии
Фиксирующий буфер (4% PFA)	BD	554655	Проточная цитометрия регеант
IgG мышь	Sigma	I8765	Проточная цитометрия регеант