Коллекция, Изоляция и проточной цитометрии анализа человеческой Endocervical образцов

Summary

Использование отбора цитобрашных проб для сбора лимфоцитов и моноцитов из эндоцервикса является минимально инвазивным методом, который предоставляет образцы для анализа иммунитета женских половых путей. В этом протоколе мы описываем сбор образцов цитощетки и выделение иммунных клеток для анализов проточной цитометрии.

Abstract

Несмотря на важность патогенов слизистых оболочек для здоровья населения (включая ВИЧ), относительно мало известно об иммунитете слизистых оболочек, особенно в женских половых путях (FGT). Поскольку гетеросексуальная передача в настоящее время представляет собой доминирующий механизм передачи ВИЧ, а также учитывая непрерывное распространение инфекций, передающихся половым путем (ИППП), крайне важно понимать взаимодействие между хозяином и патогеном на слизистой оболочке половых органов. Существенные пробелы в знаниях об иммунитете к ФГТ частично связаны с трудностями успешного сбора и обработки образцов слизистых оболочек. Чтобы облегчить исследования с достаточным размером выборки, методы сбора должны быть минимально инвазивными и эффективными. С этой целью оптимизирован протокол сбора образцов цервикального цитощетки и последующего выделения цервикальных мононуклеарных клеток (КМЦ). Используя иммунофенотипирование на основе проточной цитометрии ex vivo, можно точно и надежно количественно оценить частоты и фенотипы популяции лимфоцитов/моноцитов КМЦ. Этот метод может сочетаться со сбором цервикально-вагинального лаважа (CVL), который содержит растворимые иммунные медиаторы, включая цитокины, хемокины и антипротеазы, все из которых могут быть использованы для определения противовоспалительной или провоспалительной среды во влагалище.

Introduction

Большинство новых случаев ВИЧ-инфекции во всем мире возникают в результате гетеросексуальных контактов, при этом женщины, представляющая 47% новых случаев инфицирования в 2011 году (ЮНЭЙДС ^1). Понимание женский генитальный тракт (Fgt), один из главных порталов входа для ВИЧ и других инфекций, передающихся половым путем, имеет большое значение на пути к поиску эффективных стратегий для предотвращения инфекции. Иммунный ответ на слизистой оболочки половых органов, очевидно, уникальным и отличаться от тех, измеренный в периферической крови ^2. Однако современные знания иммунных динамики на FGT ограничивается в лучшем случае. На сегодняшний день иссл....

Protocol

Заявление этика: по этике научных исследований доски как в Университете Манитобы и Кениата Национальной больницы / Университет Найроби одобрил это исследование и письменное информированное согласие было получено от всех участников исследования.

1. Подготовка информации и КМЦ Коллекция Трубы

1. Подготовка забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) (137.93 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 8,1 мМ Na ₂ HPO _4, 1,47 мМ KH ₂ PO _4). Автоклав на стерильность. Это может храниться при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев.
2. Предварительно Аликвота 5 мл PBS в 50 мл трубки сокола (по ....

Results

Мультипараметрический проточной цитометрии является мощным инструментом рассекать фенотипы и функции клеточных подмножеств в ранее неохарактеризованных тканей. Анализ проб CMC может дать информацию как лимфоцитов и моноцитов населения с соответствующих стратегий селекции.

Представитель CMC стратегия стробирования, по сравнению с согласованной профиль РВМС, показан на рисунке 2. FSC-против FSC-H участка позволяет исключить клеточных дублетов, которые широко распространены в о.......

Discussion

С учетом больших пробелов в знаниях в отношении иммунитета в женских половых путей (ФГТ), фенотипическая анализ ОМЦ может обеспечить широкий спектр идеи на несколько популяций лимфоцитов на шейке матки. В сочетании с протеомного анализа и измерений вирусной нагрузки в шейном промывания, иммунитет к инфекциям, передающимся половым путем (ИППП) с и других патогенов можно разрезать в различных популяциях.

Технические аспекты - ОМЦ: Выделение и успешным окрашивание образцов CMC .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μ m клеточное ситечко для 50 мл Falcon tube	BD	352360	CMC обработка
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC
Фетальная бычья сыворотка	Life technology	16000044	CMC обработка
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC обработка
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC обработка
50 мл Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC обработка
Банк крови одноразовая переводная пипетка	Fisher	13-711-6M	CMC обработка
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC
Одноразовый цервикальный скребок	Quick medical	2183	CMC для отбора проб
15 мл Falcon tube		Fisher 14-959-70c	Пробирка для обработки CVL
1,5 мл Eppendorf	Fisher	05-402-18	Хранение CVL
LIVE/DEAD Набор для окрашивания клеток	Invitrogen	Различные	реагенты проточной цитометрии
Фиксирующий буфер (4% PFA)	BD	554655	Проточная цитометрия регеант
IgG мышь	Sigma	I8765	Проточная цитометрия регеант