Создание Enterobacter Зр. ЕГУ ауксотрофов Использование транспозонный мутагенез

Краткое содержание

Enterobacter зр. ЕГУ растет в глюкозе минимальную солевую среду. Ауксотрофов генерируются путем преобразования его с transposome которые случайно вставляет себя в геном хозяина. Мутанты найден реплик из сложной среды в минимальной среде. Прерванный гены обозначаются гена спасения и секвенирования.

Аннотация

Прототрофных бактерии растут на М-9 минимальную солевую среду, дополненную глюкозы (М-9 среде), который используется в качестве источника углерода и энергии. Ауксотрофов могут быть получены с использованием transposome. Коммерчески доступны, Tn 5 -derived transposome используется в данном протоколе состоит из линейного сегмента ДНК, содержащей γ начала репликации R6K, ген устойчивости к канамицину и две мозаики последовательности концах, которые служат в качестве сайтов связывания транспозазу. Transposome, предоставляется в качестве белкового комплекса ДНК / транспозазы, вводится путем электропорации в прототрофных в штамме Enterobacter, уд. ЕГУ, и случайным образом включает себя в геном этого хозяина. Трансформанты реплика была помещена на Лурии-Бертани агаром, содержащих канамицин, (LB-KAN) и с агаром, М-9-среды, содержащей канамицин (M-9-KAN). Трансформанты, которые растут на LB-кан пластин, но не на M-9-кан пластин считаются ауксотрофы. Очищенная геномнаяДНК из ауксотроф частично переваривается, лигирована и преобразован в PIR ⁺ кишечной палочки (E.coli) штамма. Репликация Происхождение R6Kγ позволяет плазмиды повторить в PIR ⁺ E. штаммы кишечной палочки, а также резистентность к канамицину маркер позволяет выбрать плазмиды. Каждый трансформант обладает новую плазмиду, содержащую транспозона фланкированную прерванного хромосомной области. Сэнгер секвенирования и Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) предложить предполагаемый личность прерванной гена. Есть три преимущества использования этой transposome стратегию мутагенеза. Во-первых, она не зависит от экспрессии гена транспозазы хостом. Во-вторых, transposome вводится в целевом узле путем электропорации, а не путем конъюгации или трансдукции и, следовательно, является более эффективным. В-третьих, репликация происхождение R6Kγ позволяет легко идентифицировать мутантный ген, который частично восстановлены в рекомбинантной плазмиде. Этот метод может быть использован, чтобы исследовать гены, участвующие в других характеристик Enterobacter SP. ЕГУ или более разнообразных бактериальных штаммов.

Введение

Прототрофных бактерии растут в М-9 минимальную солевую среду, содержащую глюкозу (М-9 среде), превращение глюкозы через центральные путей метаболизма углерода генерировать предшественники, такие как аминокислот, нуклеиновых кислот и витамины, для биосинтеза ^1. М-9 среда содержит хлорид аммония в качестве источника азота, натрия и фосфат калия в качестве буфера и источника фосфора, сульфата магния в качестве источника серы и глюкозы в качестве источника углерода и энергии. Лурия-Bertani (LB) среда богата аминокислотами из триптона и в витаминах и ростовых факторов из дрожжевого экстракта. Он поддерживает рост ауксотрофов, что не может синтезировать аминокис....

Протокол

1. Электропорация компетентных клеток ^5,11

1. Развести в O / N LB культуру Enterobacter зр. ЕГУ 1/20 в 50 мл свежей LB среде и расти при встряхивании при 120 оборотах в минуту и ​​30 ° C до оптической плотности (600 нм) между 0,4 и 0,6. При желании, растут другие бактериальные штаммы в их оптимальной температуре роста.
2. Холод клетки на льду в течение 5 мин и центрифугируют при 4 ° С и 7000 х г в течение 5 мин.
3. Жидкость над осадком сливают, ресуспендирования клеток в 50 мл стерильной ледяной водой и центрифугируют при 4 ° С и 7000 мкг в течение 5 мин. Повторите этот шаг.
4. Жидкость над осадком сливают и клетки вно....

Результаты

Трансформация Enterobacter зр. ЕГУ путем электропорации с transposome инициирован случайную вставку генома в геном хозяина (рис 1а, б). Успешный электропорации дали несколько тысяч трансформантов, которые росли на LB-кан пластин. Чтобы получить 300-400, хорошо разнесены колоний на чашку, количество преобразований смеси распространения на каждом LB-агаром кан был оптимизирован. Каждый Трансформант содержится хотя бы один транспозонов вставку, но не было ясно, если важный ген роста на М-9 среде б.......

Обсуждение

Транспозонов мутагенеза, используя transposome является эффективным инструментом для создания ауксотрофов в Enterobacter зр. ЕГУ и других видов грамотрицательных и грамположительных бактерий ^3,4. Процесс был инициирован введения Tn ​​5 -derived transposome в хозяина путем электропорации. Для идентификации колоний со вставками, нетрансформированный целевой штамм должен быть чувствительным к канамицину, чтобы выбрать для маркера устойчивости осуществляется с помощью транспозона. Некоторые хост.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
EZ-Tn5 R6K&гамма; ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicenter (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	ECP09500	Способен реплицировать плазмиды с источником репликации R6Kγ при низком числе копий
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	EC6P095H	Способность реплицировать плазмиды с помощью R6Kγ репликация происхождения при высоком числе копий
5X M-9 Salts	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Broth	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Твердая среда содержит 1,6% (масс./об.) агара
Канамицина сульфата	Компания «Амреско, Инк.»	0408-25G	При необходимости носитель содержит 50 мкм; г/мл канамицина сульфата
D-глюкозы моногидрат	Amresco, Inc.	0643-1KG
Дрожжевой экстракт	Amresco, Inc.	J850-500G
Триптон	Амреско, Инк.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Супероптимальный бульон с подавлением катаболитов (SOC) среда			0,5% (w/v) дрожжевого экстракта, 2% (w/v) триптон, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 мМ MgSO4 и 20 мМ глюкозы
BfuC I	NEB	R0636S	Частичное расщепление геномной ДНК
Xho I	NEB	R0146S	Расщепление плазмид
T4 ДНК Лигаза	NEB	M0202S
Нуклеазная вода без нуклеазы	Amresco, Inc.	E476-1L	Для растворения осажденной ДНК и реакций эндонуклеазы рестрикции
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	секвенирования ДНК
Набор для геномной очистки ДНК	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps Система очистки ДНК	Promega	A1460	Очистка плазмид
Реплика Гальванический блок	Thermo Fisher	09-718-1
Вельветовые квадраты	Thermo Fisher	09-718-2	Реплика покрытия
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Сетка для реплики посуды
Чашки Петри	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 мм	BioExpress	E-5010-2
CentriVap Вакуумный концентратор ДНК	Labconco	7970010	сушка ДНК
Система анализа ДНК CEQ 2000XL	Beckman Coulter
Вектор NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	анализ последовательности ДНК

Мастер