Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культуры диссоциированных сенсорные нейроны От куриные эмбрионы

14.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51991

⸱

24 сентября 2014 г.

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Assumption College

В этой статье

Краткое содержание

Модели клеточной культуры обеспечивают детальный контроль над условиями окружающей среды и таким образом предоставляют мощную платформу для выяснения многочисленные аспекты нейронов клеточной биологии. Мы описываем быстрый, недорогой и надежный способ, чтобы изолировать, диссоциации и культуры сенсорных нейронов от куриных эмбрионов. Подробная информация о подготовке субстратов и иммуноцитохимии также предоставляются.

Аннотация

Нейроны являются многогранные клетки, которые несут информацию, необходимую для выполнения различных функций, включая ощущения, движения двигателя, обучения и памяти. Изучение нейронов в естественных условиях может быть сложной задачей в связи с их сложностью, их многообразной и динамичной среде, и технических ограничений. По этим причинам, изучая нейроны в пробирке может оказаться полезным, чтобы разгадать сложные загадки нейронов. Четко определены характер моделей клеточных культур обеспечивает детальный контроль над условиями окружающей среды и переменных. Здесь мы опишем, как изолировать, отделить, и культура первичные нейроны от куриных эмбрионов. Этот метод является быстрым, недорогим, и генерирует энергично растет сенсорных нейронов. Процедура последовательно производит культур, которые высоко обогащенные для нейронов и имеет очень мало, не нервных клеток (менее 5%). Первичные нейроны не хорошо прилипать к необработанной стекла или культуры ткани пластика, поэтому подробные процедуры для создания двух DistinКТ, четко определенные ламинином содержащих субстраты для нейронов обшивки описаны. Искусственный нейроны являются весьма поддаются нескольких клеточных и молекулярных методов, в том числе со-иммунопреципитацией, живой воображения клеток, РНК-интерференции, и иммуноцитохимии. Процедуры двойного иммуноцитохимии на этих культивируемых нейронов были оптимизированы и описано здесь.

Введение

Нейроны являются сложными клетки, которые несут информацию, необходимую для выполнения различных функций, включая ощущения, зрение, движения двигателя, обучения и памяти. Уникальная от других типов клеток, нейронов расширить рук, как процессы, называемые аксоны, чтобы сформировать основные нервные дороги для связи. Во время развития специализируется отсеков, расположенных на кончиках растущих аксонов, называется конусы роста, перемещаться по концерта внеклеточных сигналов, чтобы привести аксон к ее соответствующему назначению. Сложные молекулярные механизмы, лежащие в основе роста конус навигацию, полностью не поняты. Чтобы лучше понять эти механизмы, исследователи использовали модели клеточной культуры для изучения нейронов в определенной и упрощенной в пробирке среды. Изучение нейронов в культуре 1 привело к значительному прогрессу в нашем понимании нейронов клеточной биологии, включая: дифференцировки нейронов 2, цитоскелета динамики, эндоцитоза и торговли, дендритоврегулирование 3,4, регенерацию аксонов 5, и клинические состояния, такие как невропатии 6. Кроме того, культивируемые нейроны являются весьма пригодны для широкого спектра методов исследования, включая иммуноцитохимии, клеточной поверхности ко-иммунопреципитации, Вестерн-блоттинга, трансфекции, RNAi, и живого изображения, такие как TimeLapse анализа конуса роста подвижности. Таким образом, культивирование первичных нейронов является мощным подход к выяснению многочисленные аспекты клеточной биологии нейронов.

Модель культуры клеток обеспечивает следователям подробного контроля над условиями окружающей среды и переменных. Например, субстрат, на котором нейроны покрытием (и расти на) можно легко манипулировать. Здесь мы предоставляем подробные инструкции для генерации две различные субстраты, один с низкой концентрацией ламинином-1, а другой с насыщающих концентраций ламинином-1. Удивительно, различные концентрации и той же молекулы может иметь драматические последствияот внутреннего состояния нейронов, а также их клеточной поверхности композиции. Например, внутриклеточные уровни цАМФ и поверхностных уровнях интегринов значительно отличаются в нейронах посеянных на этих двух субстратов 7,8. Дополнительные исследования показали, что другие молекулы, в том числе фибронектина и хондроитинсульфата протеогликаны, воздействия на экспрессию молекул клеточной поверхности и нейронов моторики 7-11. Кроме того, растворимые молекулы, такие как нейротропинов и neurotropins также влияют на состав клеточной мембраны нейронов и моторику 12-16 и может быть легко и точно управлять в модели культуры клеток.

Здесь мы опишем методы, чтобы изолировать и культуры диссоциированных сенсорные нейроны от куриных эмбрионов. Эта процедура была использована, чтобы сделать значительные прорывы в области нейробиологии, в том числе аксонов 5,7,8,10,11,16-21 и был изменен с процедурой для изоляции ганглиозных клеток 22. Естьнесколько преимуществ такого подхода. Во-первых, многие черты цыплят спинномозговых ганглиев (DRG) развития хорошо охарактеризованы в том числе сроков рождения, расширение аксона, и экспрессия белка анкеты 2,23-28, обеспечивая тем самым поучительный основу, на которой строится информативным в пробирке эксперименты. Во-вторых, диссоциированных нейронов культуры позволяют исследователю более непосредственно изучать нейронов по сравнению с альтернативными подходами с использованием интактных DRG эксплантов (которые содержат нейроны и не-нейрональных клеток) и / или смешанных культур, содержащие оба диссоциированных нейронов и не-нейрональных клетках. В-третьих, процедура, описанная здесь проста, недорогой и поддаются студентов. Таким образом, эта методика может быть использована для исследований, а также в учебных целях. Кроме того, незначительные вариации этого протокола должны предоставлять очистку быстро, с высоким выходом нейронов от других, чем ДРГ источников. Например, эта процедура может быть изменен, чтобы обеспечить нейронально ENRiched культуры из других тканей, таких как эмбрионального переднего мозга или спинного мозга.

Протоколы Иммуноцитохимическая были оптимизированы для этих диссоциированных нейронов культур и подробно описаны здесь. Процедура двойного иммуноцитохимии против нейронной молекулы клеточной адгезии (NCAM) и β1 интегринов предоставляется. Данные, полученные от этих иммуноцитохимических методы были использованы для изучения пространственной кучность и интенсивность нескольких молекул в культивируемых нейронов 8,16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 Покровные Приготовление: Acid Wash и Выпекайте

  1. По крайней мере, за 2 дня до вскрытия (шаг 2), начать следующие шаги по подготовке покровные. Выполните кислоты шаг раствором, чтобы удалить масла и тщательно мойте покровные.
  2. Загрузка покровные в держателе фарфора, что вертикально позиционирует покровные и предотвращает их соприкасаются друг с другом. Погружение держатель и покровные стекла в гистологии контейнере, заполненном с помощью 2 М соляной кислоты (HCl). С другой стороны, если держатель фарфора не доступен, распространение ~ 20 покровные горизонтально, чтобы покрыть дно 100 мм стеклянную чашку Петри и погрузить в покровные 2 М HCl.
  3. Поместите стеклянный сосуд (с покровные погруженных в кислоты) на рокера таблицы в вытяжной шкаф и позволяют нежно покачиваясь, по крайней мере 5 часов при комнатной температуре. Кроме того, промывание кислотой покровные в течение ночи при тех же условиях.
  4. Вымойте покровные дистиллированной H 2 O (DH 2 O) путем передачи держатель фарфор загруженныйс покровные из 2 М HCl в чистую стеклянную гистологии контейнер, наполненный дН 2 O. Кроме того, переливать 2 М HCl от стеклянную чашку Петри с покровные и залейте дН 2 O.
  5. Вымойте отстаивают дН 2 O снова и снова наполнять стеклянный сосуд со свежей дН 2 O. Повторите для в общей сложности 3 быстрых стирок.
  6. Начните длительный режим стирки путем возвращения стеклянный сосуд (с покровные и Д. 2 O) на качалке. Следует учитывать осторожном перемешивании в течение 10-30 мин при комнатной температуре. Тогда, переливать дН 2 O и добавить свежий дН 2 O. Повторите для в общей сложности не менее десяти стирок. С другой стороны, продолжайте промывку ночь.
  7. Поместите промывают покровные в печь, предварительно нагретую до 350 ° C. При использовании держатель фарфора, удалить держатель с дН 2 O-заполненный стеклянный контейнер, а затем поместить держатель с покровные непосредственно в печь. При использовании в стеклянную чашку Петри, переливать дН 2 O и поместите стеклянную посуду с покровные в furnacэ.
  8. Выпекать покровные для по крайней мере, пять часов или в течение ночи при 350 ° С.
  9. После выпечки удалим покровные из держателя фарфора с тонким пинцетом и поместить в стерильный 100 мм стеклянную чашку Петри. Оставьте покровные, которые не были первоначально размещены в держателе фарфора в стеклянную чашку Петри.

2 Chick Вскрытие и Выделение ДРГ

  1. Удалить плодородная, поставил Белый Ливорно цыплят яйцо от инкубатора (состоявшейся в 37-38.5 ° С с нежным покачиванием).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущих исследованиях использовали эмбриональные день 7-10 для изоляции ДРГ 2,8,11-13,16.
  2. Поместите выбранный яйцо в ламинарном боксе. Провести все процедуры, приведенные ниже в асептических условиях в ламинарном боксе с стерильных растворов и инструментов. Предварительно теплые все решения в C водяной бане 37 °.
  3. Crack яйца и место содержимое в пластиковый 100 мм чашки Петри. Используйте стандартные щипцы для передачи эмбриона другой 100 мм чашки Петри.
    4. С помощью пипетки Пастера, добавить нагревали 1x PBS в чашке Петри, чтобы держать ткань влажная. Обезглавить эмбрион, зажимая шею тонким пинцетом. Трансфер тело другой чистый 100 мм чашки Петри.
  4. Добавить теплую F12HS10 (F12 Хэма, 10 мМ HEPES, 100 единиц / мл пенициллина, 0,1 мг / мл стрептомицина, 10% фетальной бычьей сыворотки), чтобы блюдо с пипетки Пастера, чтобы ткань мокрой. Используйте пинцет, чтобы позиционировать эмбриона на его спинной стороне (Рисунок 1А).
  5. Поместите 100 мм пластиковый чашку Петри, содержащую эмбриональную ткань на бинокулярного StereoVision вскрытии микроскопом в ламинарном боксе. Используйте тонкий пинцет, чтобы сделать вертикальный срединный разрез от хвоста к шее, зажимая развивающихся дермы подвергать сердца, легких и других органов. С другой стороны, сделать серию небольших слез подвергать внутренние органы.
  6. Аккуратно использовать 2 комплекта стерильных тонким пинцетом в: а) понять шею и б) понять аорты или другой ткани сразу превосходную к сердцу и потяните к хвосту,потрошение животное.
  7. Наложите теплую F12HS10 с пипетки Пастера к ткани. Используйте пинцет для удаления оставшихся сердечно-сосудистых, респираторных или органы пищеварения, чтобы разоблачить развивающимся ребра, позвоночник и ДРГ (цифры 1B-1D).
  8. Под микроскопом рассекает, использовать тонкий пинцет для дальнейшего удаления органов и собирать ДРГ вдоль обеих сторон поясничного позвоночника, нижней к ребрам. Соберите ДРГ щипком нетронутыми ДРГ из эмбриона. Pinch и разорвать корни, которые достигают от DRG в сторону спинного мозга и схватив развивающийся нерв, который достигает от DRG к периферии или наоборот.
  9. Поместите нетронутыми ДРГ в 35 мм блюдо культуры, наполненную теплой F12HS10. Удалите излишки ткани, такие как спинной или брюшной корней, которые могут быть прикрепленной к DRG, с интактными DRG, в 35 мм чашку, зажимая с тонким пинцетом.
  10. Для получения ДРГ, превосходящие поясничной области, удалить вентральной половины грудной и Cerviкал позвоночника. Это делается, сделав разрез в развивающихся позвоночника перпендикулярно спинного оси шнура в верхней области шеи и других сечений в верхней части спины. Тогда, сделать прорезями, параллельными спинномозговых оси шнура вдоль правой и левой сторон позвоночника. Поднимите вентральной половины позвоночника из эмбриона, который подвергает подвергает спинного мозга (рисунки 1E-1F).
  11. Для обеспечения легкого доступа к ДРГ, снимите грудной и шейного отдела спинного мозга, держа спинной мозг с тонким пинцетом. Используйте пинцет, чтобы поднять спинной мозг из позвоночника. В качестве приближения, грудного отдела спинного мозга на уровне ребер и цервикальной области превосходит ребер.
  12. Соберите нетронутыми грудного и шейного ДРГ с тонким пинцетом и поместить их в теплой F12HS10 с другими ДРГ. Удалите излишки ткани, которые могут прилипать к ДРГ.
  13. Промыть интерьер нового стекла пипетки Пастера с F12HS10, чтобы помочьпредотвращения ДРГ от прилипания к стенкам пипетки. Используйте промыть пипетку, чтобы передать все ДРГ и F12HS10 от небольшой чашке Петри в стерильную 15 мл коническую трубку и сразу перейдите к шагу 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная эмбрионы можно разрезать, чтобы увеличить количество ДРГ. DRGs не должны храниться в F12HS10 при 37 ° С до готовности к шагу 3.

3 диссоциация, обогащая и Культивирование DRG Нейроны - Часть 1

  1. Место коническую трубку с неповрежденными ДРГ в центрифуге и мягко вращаются (200 мкг) в течение 2-3 мин. Убедитесь, что DRGs канули в нижней части трубы. Если нет, то снова вращаться.
  2. С помощью пипетки, аккуратно удалите F12HS10, оставив DRG осадок спокойно. Добавить 2 мл 1x кальция и магния бесплатно (CMF) PBS, выбивании гранулу ДРГ. Спин снова и удалить CMF PBS, оставляя DRG осадок нетронутыми. Повторите эту стирки шаг для всего три раза, чтобы удалить эмбриональной телячьей сыворотки в F12HS10, который препятствовал бы трипсина пищеварения в следующем шаге.
  3. Добавить 2 мл подогретого трипсин до 15 мл пробирку, содержащую 2 мл CMF PBS и ДРГ. Место труба в 37 ° С водяной бане в течение 10-15 мин, чтобы переварить ДРГ в диссоциированных клеток.
  4. Во время инкубации, чтобы F12H + добавка, содержащая носитель (F12 Хэма, 10 мМ HEPES, 100 единиц / мл пенициллина, 0,1 мг / мл стрептомицина, 10 нг / мл NT3, 10 нг / мл NGF, 200 мМ L-глутамина и N2) и тепло в 37 ° С на водяной бане. Как правило, 10 мл общей массовой информации достаточно для 4-5 35 мм чашках первичных сенсорных нейронов. Также начинают размораживания ламинином-1 для покрытия покровные (шаг 4).
  5. Аккуратно растирают DRGs в раствора трипсина с P1000 пипетки и визуально проверьте отсутствие неповрежденных ДРГ. Продолжайте растирание до неповрежденные DRGs более не видел на глаз и / или позвольте более трипсина инкубации в C водяной бане 37 ° до неповрежденные DRGs не разобщены. Для защиты DRG нейроны от повреждения, избежать воздушных пузырей во время растирания и ограничить трипсина пищеварение к <30 мин.
  6. Centrifugэлектронной трубки, содержащей разложенных ДРГ и трипсина на 200 мкг в течение 3-5 мин с образованием гранул. Спин больше, если это необходимо, пока осадок не образуется.
  7. Тщательно аспирата трипсин, не нарушая гранул. Добавить 2 мл F12HS10 для осаждения. Аккуратно растирают ДРГ с наконечником P1000 пипетки.
  8. Перенесите все содержимое из 15 мл коническую трубку в 100 мм блюдо культуры. Промойте трубку с 8 мл F12HS10 и передать его в чашку с культурой, 2 мл за один раз, в общей сложности 10 мл. Этот этап полоскания помогает собрать клетки, которые, возможно, остались привязаны к стенкам трубки.
  9. Поместите 100 мм культуры блюдо (10 мл F12HS10 и диссоциированных DRG клетки) в увлажненной 37 ° C инкубаторе в течение 3 часов.
    Примечание: CO 2, не требуется в инкубаторе, так как HEPES буферы рН среды в отсутствие СО 2. Во время инкубации, глиальные клетки связываются с поверхностью культуры ткани пластика и нейронов, как правило, свободно придерживаться глиальных постели.

4 Покрытие кислота Омываетсяи запеченные Покровные ламинином-1

  1. Оттепель стерильные аликвоты замороженных ламинином-1 на льду.
  2. В стерильных условиях, добавить 1 мл стерильного 1x PBS до 50 мкл аликвоты ламинином-1.
  3. С помощью спектрофотометра, чтобы получить значение абсорбции ламинин-1 при 280 нм. Это значение можно использовать в следующей формуле для определения концентрации ламинина-1.

ABS 280 = (концентрация мг / мл) * (коэффициент экстинкции белка)
Коэффициент экстинкции для ламинином-1 0,86.

  1. В стерильных условиях, разбавленной ламинин-1 с 1X PBS, чтобы получить концентрацию 1 мг / мл и 20 мг / мл. Используйте эти два применяемые концентрации ламинином-1 для достижения десятикратную разницу ламинина-1, связанного с покровное (30 нг / см 2 и 300 нг / см 2, соответственно) после инкубации 7,8,10.
  2. В ламинаре, использовать тонкий пинцет, чтобы разместить один промытого кислотой и запеченный Coverslip в нижней части одного 35-мм чашку для культивирования. Повторите по мере необходимости для получения количества блюд, необходимых.
  3. Тема покровные в УФ-свете в течение 20-30 мин для дальнейшего обеспечения стерилизации. Держите блюдо крышку во время этого шага.
  4. Добавить 400 мкл подготовленного ламинином-1 для каждого покровного стекла. Используйте пипетки распространяться ламинином 1 для обеспечения полного охвата покровное. Поверхностное натяжение позволит ламинин-1, чтобы оставаться на покровное и не распространяется на дне чашки для культивирования, который необходим.
  5. Поместите крышку на блюдо и позволяют ламинин-1 инкубируют в течение 2-3 часов при комнатной температуре (3 ч является оптимальным).
  6. После ламинином-1 инкубации промойте покровные помощью асептической техники стерильной PBS в ламинарном боксе. Удалить решение на покровного стекла и добавить 400 мкл PBS. Подождите 5-10 мин. Повторите для в общей сложности 3 полосканий.
  7. Оставьте PBS на покровного после последнего полоскания. Не ломайте поверхностное натяжение во время промывания и не позволяют покровные иссякать. Leпр крышка на до готовности пластины диссоциируют нейроны на coverlip.

5 диссоциация, обогащая и Культивирование DRG Нейроны - Часть 2

  1. После инкубации, использовать 10 мл стерильной пипеткой осторожно промыть дно 100 мм блюдо с разложенных клетки DRG. Держите блюдо в ~ углом 45 °, вытяните ~ 7 мл F12HS10 с пипетки помощи, затем осторожно выгнать 7 мл на примерно 1/3 от тарелки. Повторите 5x, мягко выбивании нейроны.
  2. Поверните блюдо и повторить полоскание процедуру, в течение еще шести полосканий, на другом 1/3 чашки. Повторите процедуру еще раз для оставшихся 1/3 из тарелки. Таким образом, осторожно промыть всю нижнюю часть тарелки с F12HS10, чтобы удалить нейронов.
  3. Использование же пипетки переносят F12HS10 содержащий нейроны от 100 мм блюдо до 15 коническую трубку. Центрифуга в течение 5-10 мин при 200 г для осаждения клеток.
  4. Удалить F12HS10, оставляя осадок спокойно. Ресуспендируйте окатышей с 2 ​​мл подогретого F12H + добавки.
    5. Используйте гемоцитометра определить плотность клеток.
  5. Развести по мере необходимости с F12H + добавок клетки для получения желаемой концентрации Покрытие (120000 клеток / мл для покровные, покрытых / мл ламинина-1 и 40000 клеток 1 мкг / мл для покровные, покрытых 20 мкг / мл ламинина-1 8,16).
  6. Удалить PBS с ламинина покрытием покровные и сразу же поставить 400 мкл клеток на покровных стеклах. Тщательно передачи блюдо в увлажненной, 37 ° C инкубаторе для клеточных культур. Разрешить инкубируют в течение по крайней мере 1 часа и до 3 часов, чтобы позволить нейроны придерживаться ламинин-1.
  7. В стерильных условиях, мягко затопить 35 мм блюда, содержащие нейроны с 1,6 мл F12H + добавки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В это время, поверхностное натяжение на покровного стекла могут быть разбиты. Нейроны достойно придерживался ламинином-1 на покровного стекла.
  8. Вернуться клеток в инкубаторе и инкубировать в течение ночи. Выполните эксперименты, такие как иммуноцитохимии на следующий день.

6 Яmmunocytochemistry

  1. До иммуноцитохимии, теплый раствор фиксатор (4% параформальдегида, 30% сахарозы 2X ЗФР) в 37 ° С на водяной бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед установкой клетки, лечения с различными реагентами, такими как Netrin-1, Mn 2 +, звуковой еж, Semaphorin и эфрин 16,29-31.
  2. Медленно снимите 1 мл 2 мл F12H + добавки от культуры блюдо. Аккуратно добавить 1 мл подогретого фиксирующего раствора. Разрешить инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
  3. Осторожно снимите фиксирующий раствор и добавить 2 мл PBS. Нанесите раствор к краю тарелки, не допуская возможного оплывание фиксированных клеток вследствие применения PBS. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
  4. Повторите PBS мытье в общей сложности 5 промывок. Не позволяют клеткам высохнуть в течение любого этапа иммуноцитохимии.
  5. Удалить PBS. Применение 1 мл блокирующего раствора (0,1% Тритон-X, 1X PBS, 5% нормальной козьей сывороткой). Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. В качестве альтернативы, для окрашивания поверхности молекулы, Не используйте Triton-X в блокировании решения 8.
  6. Развести первичных антител в блокировании решения в соответствии с рекомендацией завода-изготовителя. Используйте 1: 500 для антител против NCAM и активируется β1 интегринов 16. Удалить блокирующий раствор, добавляют 1 мл раствора первичного антитела и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
  7. Удалить решение первичного антитела и добавить 2 мл 1X PBS. Инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Повторите для в общей сложности 4 PBS стирок. Моет может быть продлен, если это необходимо.
  8. Развести вторичного антитела 1: 1000 в блокировании решения. Удалить PBS, добавляют 1 мл раствора вторичного антитела и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела к свету. Хранить растворы и клетки в темноте, насколько это возможно, с этой точки вперед.
  9. Удалить решение вторичного антитела и промыть 5x с 1x PBS, как это было сделано ранее.
  10. Применить ~ 60-80 мкл FluoromountG на предметное стекло микроскопа. Использование тонких щипцов, осторожно поднимите покровное из тарелки и нижней покровное в Fluoromount G на предметное стекло. Избегайте воздушных пузырьков.
  11. Магазин скользит горизонтально при 4 ° С в темноте. После 12-24 часов, Fluormount G будет полимеризоваться и покровное будет прочно прикреплены к предметное стекло. Клетки Image после этого стадии полимеризации завершена.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, описанный здесь позволяет следователям культуры обогащенный население диссоциированных эмбриональных сенсорных нейронов с очень немногих (например, <5%) не-нервных клеток 7,8,10,16. Многочисленные DRGs могут быть получены из пояснично-крестцового отдела, грудного и шейного отдела. В зависимости от потребностей следователя, DRGs от этих различных анатомических областей может быть легко изолированы. Например, на рисунке 1 приведены изображения эмбрионов кур с помощью разли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы представляем подробные протоколы для выделения и культивирования диссоциирован сенсорные нейроны от куриного эмбриона. Эта процедура создает обогащенный население энергично растущих нейронов в пробирке 7,8,10,16. Многочисленные клеточные и молекулярные методы могут быть применены к этим культивируемых нейронах, в том числе иммуноцитохимии, который описан здесь. Этот протокол был недавно использован для количественной оценки интенсивности immunolabeled активированных интегринов в сенсорных ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Элисон Филбрук, Belinda Barbagallo и Майкл Фрэнсис для проницательных комментариев к этой статье. В исследовании, опубликованном в этой публикации была поддержана премии R15 ЗОНА 1R15NS070172-01A1 присуждена МРОТ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стерильные малые чашки для культуры (35 мм)Corning430165
Стерильные большие чашки для культуры (100 мм)Falcon353003
Стерильные большие чашки Петри (100 мм)VWR89000-302
Стеклянная чашка Петри (100 мм)VWRD108962
Тонкие щипцыFine Science Tools11251-10
Стандартные щипцыFine Science Tools1100-12
Coverslips (22 x 22 мм)Fisher12 518 105K0,13-0,17 мм толщина оптимальна для микроскопии
Фарцелиновый держатель покровного стеклаThomas scientific8542E40
Фетальная бычья сывороткаGibco17502-048используйте 50 мл аликвот на 500 мл Ham's F12 media
HClVWRVW3204-1использовать при 2 М, можно использовать два раза перед выбросом
NaClSigmaS9888использовать 5 М раствор NaCl для ламинина-1 стоковый раствор
Ламинин-1Invitrogen23017-015Добавить 72 &; л стерильных 5 М NaCl и аликвоты на 50 & микро; l
15 млобработка с коническими трубчатыми клетками229411
PBS CMF 10xGibco14200используется в 1x, разбавляется стерильной фильтрованной водой Millipore
PBS 10xGibco14080используется в 1x, разбавляется стерильной фильтрованной водой Millipore фильтрованной водой
Ham's F12Lonza12-615F
Фетальная сыворотка бычьего сыворота альбумин (BSA)Gibco10438использовать в F12HS20 при 10%
HEPESSigmaH3375стерильный 1 М раствор в дистиллированной воде, развести в среде F12 до получения конечной концентрации 10 мМ
пенициллин/стрептомиоцинSigmaP0781использовать 5 мл в 500 мл среды F12
NT3MilliporeGF031Добавьте 1 мл стерильной воды Millipore, аликвоту в стерильных условиях, хранить при -20°°; C, использовать в конечной концентрации 10 нг/мл в среде F12H, держать при -20 °°; C Морозильная камера без размораживания
NGFRnD systems256-GFДобавить 1 мл стерильного 1x PBS с 0,1% BSA, аликвоту в стерильных условиях, хранить при -20 °°С; C, применяют в конечной концентрации 10 нг/мл в среде F12H
L-GlutamineSigmaG7513aliquot в стерильных условиях, хранят при -20 °°; С, использовать при конечной концентрации 200 мМ в среде F12H
TrypsinSigmaT4049aliquot в стерильных условиях, хранить при -20°С; C
Бычья сыворотка альбумина (BSA)Gibco15260
Другие необходимые предметы: общие инструменты для препарирования, включая стеклянные пипетки Пастера, фертильные белые яйца леггорнов, инкубатор для проверки яиц (увлажненный, 37 ° C), камеру клеточной инкубации (увлажненная, 37°; C), ламинарный проточный капюшон, бинокулярный стереовизионный препарирующий эндоскоп
Immunocytochemistry Reagents Table
SucroseSigmaS9378используется в фиксирующем растворе (4% параформальдегия, 30% сахарозы, 2x PBS)
Triton-X 100SigmaT-8787
ПараформальдегидSigmaP6148используется в фиксирующем растворе (4% параформальдегидия, 30% сахароза, 2x PBS)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Нормальная козья сывороткаLife technologiesPCN500
Микроскопические слайдыVWR16004-430
Таблица первичных антителАнтитело
против NCAMMilliporeAB5032поликлональное
антитело против активировано β 1 ingegrinMilliporeMAB19294monoclonal
Secondary Антитела Table
Goat anti-mouse Alexa 488Life technologiesA11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548Life technologiesA11036

Ссылки

  1. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
  2. Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
  3. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
  4. Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
  5. Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
  6. Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
  7. Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
  8. Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
  9. Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
  10. Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
  11. Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
  12. Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
  13. Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
  14. Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
  15. Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
  16. Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
  17. Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
  18. Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
  19. Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
  20. Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
  21. Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
  22. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  23. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921(2013).
  24. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
  25. Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
  26. Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
  27. Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
  28. Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
  29. Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
  30. Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
  31. Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
  32. Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
  33. Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
  34. Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
  35. Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Ганглии задних корешковдиссоциация клетокламининовые субстратыиммуноцитохимиякультура клетокпосев нейроновобработка трипсиномпроточная цитометрия
Выделение и культуры диссоциированных сенсорные нейроны От куриные эмбрионы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.