Методическая статья

Характеризуя Состав молекулярных моторов на перемещение аксонов Грузы Использование "Грузовой Mapping" Анализ

DOI:

10.3791/52029

⸱

30 октября 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Experimental Medicine, Dorris Neuroscience Center, The Scripps Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 3Department of Bioengineering, University of California San Diego, 4Department of Neurosciences, University of California San Diego School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутриклеточный транспорт грузов, таких как везикулы или органеллы, осуществляется молекулярными моторными белками, которые отслеживаются по поляризованным микротрубочкам. Этот протокол описывает корреляцию направленности транспорта отдельных частиц груза, движущихся внутри нейронов, с относительным количеством и типом ассоциированных моторных белков.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание механизмов, с помощью которых молекулярные моторы координации их деятельности для транспортировки везикулярные грузов в нейронах требуется количественный анализ двигатель / грузовых ассоциаций на одном уровне пузырьков. Цель этого протокола заключается в использовании количественных флуоресцентной микроскопии соотнести ("карта") позицию и направленность движения живого груза к составу и относительных количеств двигателей, связанных с тем же грузом. "Отображение Cargo" состоит из живых изображений флуоресцентно меченных грузов, движущихся в аксонов культивируемых на микрофлюидных устройств с последующей химической фиксации во время записи живого движения, и последующее иммунофлюоресценции (ИФ) окрашивания тех же аксонов регионах с антителами против двигателей. Колокализации между грузов и связанных с ними двигателей оценивается путем присвоения позиции субпиксельную координаты моторных и грузовых каналов, по монтажу функций Гаусса к дифракционной-лираничена функции рассеяния точки, представляющие отдельные люминесцентные точечные источники. Фиксированные грузовые и моторные образы впоследствии накладывается на участках движения грузового, чтобы "карта" их на гусеничных траекторий. Сила этого протокола является сочетание живой и IF данные для записи как транспорт везикулярного грузов в живых клетках и определять двигатели, связанные с этими же самыми пузырьков. Эта методика позволяет преодолеть прежние проблемы, которые используют биохимические методы для определения средней состав двигателя очищенных гетерогенных популяций массовых пузырьков, как эти методы не выявляют композиции на отдельных движущихся грузов. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для анализа других транспортных и / или оборот путей в других типах клеток коррелирует движение отдельных внутриклеточных структур с их белкового состава. Ограничения этого протокола являются относительно низкая производительность за счет низкой эффективности трансфекции культивируемыхпервичные нейроны и ограниченное поле зрения, доступного для изображений с высоким разрешением. Будущие приложения могут включать в себя методы, чтобы увеличить количество нейронов, экспрессирующих флуоресцентно меченных грузов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутриклеточный транспорт имеет решающее значение во всех типах клеток для доставки белков, мембран, органелл и сигнальных молекул в различных сотовых областях 1. Нейроны являются узкоспециализированными клетки с длинными, поляризованных проекций, что критически зависят от внутриклеточного транспорта эфирных грузов для их дальней доставки различных аксонов микродоменов. Этот транспорт опосредуется кинезинов и динеинами - два больших семейств белков молекулярных двигателей - которые связываются с грузами и отслеживать вдоль поляризованных микротрубочек в антероградная и ретроградных направлений, соответственно. В то время как ретроградная движение в основном при посредничестве динеина, движение в направлении антероградной облегчается большой, функционально разнообразной семье кинезиновых двигателей. Следовательно, антероградная транспорт аксонов грузов может быть опосредовано различными членами семьи кинезина суперсемейство 1-5. Хотя некоторые грузы двигаться настойчиво в любом направлении, мОст грузы двигаться в двух направлениях и часто вспять на пути к их конечный пункт назначения 1,5-13. Кроме того, было показано, что двигатели противоположные направленности ассоциировать одновременно грузов, поднимая вопрос о том, как регулируется движение грузов координируется разнополярных двигателей 5-7. Вместе транспорт аксонов грузов является согласованные процесс, который регулируется составе двигателей и их специфических биохимических деятельности, которые в свою очередь зависят от различных адаптеров и нормативных связывающих партнеров 14.

Чтобы точно описать механизм аксонов транспорта для конкретного груза и раскрыть основную регуляцию этого транспорта, это имеет первостепенное значение для определения состава моторных белков и их нормативных связывающих партнеров, связанных с отдельными грузов во время их живого транспорта. Другие методы, например, биохимических подходов, дают оценки средней словцоили композиции на очищенных гетерогенных популяций везикул, но эти оценки не раскрывают тип или количество двигателей, связанных с одиночными движущихся пузырьков. Кроме того, восстановление везикул транспорта вдоль микротрубочек смонтированных в пробирке включен измерения количества одного типа двигателя на одном уровне пузырьков 15. Тем не менее, эти эксперименты не непосредственно коррелируют количество двигателей с транспортных характеристик этих пузырьков, и измеряется транспорт в отсутствие клеточных регулирующих факторов.

Протокол представлен здесь, который определяет состав двигателя (тип и относительное количество двигателей) отдельных движущихся пузырьков из иммунофлюоресценции данных (IF) измерительные эндогенно выраженной моторные белки, и коррелирует эти параметры в прямом перевозки тех же пузырьков в нейронах 16. Этот метод предполагает точное отображение ПЧ к проживанию данных движения грузов. Это достигается путем быть ребёнкомг нейроны гиппокампа мыши в микрофлюидных устройств соответствии с установленными протоколами 17-19. Эти устройства позволяют выявлять и корреляции («отображение») аксонов и одиночных движущихся грузов в фиксированных и живых форм световой микроскопии (рис 1). Искусственный нейроны трансфецировали флуоресцентно меченых грузовых белков, транспорт изображается с высоким пространственным и временным разрешением, чтобы получить подробную информацию движение, что строится в kymographs. В ходе обработки изображений, нейроны фиксировали параформальдегидом, а затем окрашивали антителами против эндогенных белков двигателя. Фиксированные грузовые и моторные изображения накладываются на живые kymographs движения на "карту" (локализуются) их на живого груза траекторий движения 16. Чтобы соотнести живой движение грузов с Ассоциацией моторных белков, колокализация анализируется с помощью настраиваемого сделал MATLAB пакет программного обеспечения под названием "Мотор колокализации "16,20. Флуоресцентную метку грузы и двигатели генерируют дифракционной особенности точечные, которые могут частично перекрываться. Чтобы решить эту позицию перекрытия puncta, программное обеспечение сначала автоматически вписывается гауссовых функций для каждой функции рассеяния точки, представляющие отдельные флуоресцентный puncta, чтобы определить их точное положение XY субпиксельную координаты и интенсивности амплитуд 21-23. Позиции двигателей и грузов являются затем сравниваются друг с другом, чтобы определить, колокализацию 16,20. Таким образом, этот метод более точно назначает колокализацию между флуоресцентным puncta по сравнению с другими методами 24.

Сила этого метода является возможность оценить совместную локализацию двигателей с индивидуальной груза в фиксированных клетках, для которых живые траектории движения (например, направление, в котором они двигались в момент фиксации) были RECorded. С помощью этого метода, кинезины и динеины были найдены, чтобы связать одновременно, чтобы пузырьки, которые несут нормальный белок прион (PrP C -cellular), а обогащенный neuronally груз, который перемещается в двух направлениях или остается неподвижным в аксонов 16. Этот анализ позволил сформулировать рабочую модель для регуляции PrP C движения пузырьков, в которых антероградная (кинезин) и ретроградные (динеина) двигатели координации их деятельности в целях продвижения пузырьки в любом направлении или оставаться неподвижной, а связан с грузом , Другой Сила этого метода является его потенциал широкую применимость для характеристики колокализации / объединение многих флуоресцентно меченных грузов, которые перемещаются в практически любой тип клеток, с любым другим белком (ами), представляющие интерес. Таким образом, в прямом эфире / фиксированной корреляция может потенциально обеспечить для обнаружения переходных белок-грузовых взаимодействий, как многие отдельные флуоресцентно меченных движущихся частиц могут быть проанализированы в течение желаемого рeriod времени. Учитывая широкую применимость и тип вопросов, что этот метод может рассматриваться, этот протокол будет представлять интерес для широкой аудитории клеточных биологов, включая тех, кто учится с торговлей людьми и транспортом в нейронах или в другие типы клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты проводились следующие утвержденные протоколы и в соответствии с ведомственным руководящим принципам для гуманной помощи исследовательских животных. Новорожденных мышей умерщвляли путем обезглавливания.

1. Подготовка микрожидкостных устройств для сотовых культуры

  1. Подготовка полидиметилсилоксан (PDMS) микрофлюидных устройств для роста нейронов гиппокампа, как описано Харрисом и его коллегами 17-19. Ниже приведены некоторые модификации, которые были адаптированы к протоколу отображения грузов.
    Примечание: микрожидкостных устройства также являются коммерчески доступными (Список материалов), таким образом, доступ к изготовлению объекта нет необходимости.
  2. Подготовьте No. 1 ½ покровные стекла (24 х 40 мм) путем промывки их три раза ацетоном, после чего трех промывок 100% -ным этанолом и трех промывок воды. Хранить покровные в воде при 4 ° С до использования. Эти процедуры помогут гарантировать, что покровные чистые от мусора, который может помешать обшивки челLs, загрязнение, и выживание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ацетона и этанола являются легковоспламеняющимися и опасными в случае контакта с кожей (раздражитель), попадании в глаза (раздражитель), при приеме внутрь, ингаляции. Уничтожать в соответствии с предписаниями компетентных служб.
  3. Когда все будет готово для использования, положите одну покровного стекла в 60 мм для культивирования клеток блюдо на микрожидкостных устройств, и пусть он сухой воздух раскрыли в течение 45 мин внутри биобезопасности кабинета, чтобы избежать загрязнения.
  4. После устройства вырезаются из мастеров и удары были сокращены для создания водохранилищ (рис 1а, б), разместить их с микроканалов стороной вверх внутри биобезопасности кабинета, оснащенного УФ-лампы в течение 45 мин для стерилизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выход устройства под УФ обработки дольше 2 часов может повлиять на целостность PDMS.
  5. Соберите устройств путем размещения одного устройства на каждый покровного стекла внутри 60 мм пластик для культивирования клеток блюдо так, чтобы микроканалов лицом вниз. Нежный давление верхней Oе устройства (не касаясь микроканалов), чтобы обеспечить место непостоянного печать устройства для покровного стекла. Обложка каждого 60 мм для культивирования клеток блюдо крышкой.
  6. Использование микропипетку, гидрат устройства, добавив культуры клеток класса воду в двух верхних микрофлюидных водоемов (1 и 2 на рис 1А), что позволяет воде проходить через. Удаление воды с помощью микропипетки и добавить 1 мг / мл поли-L-лизин в микрожидкостных резервуара 1 (200 мкл) и 2 (100 мкл). Дифференциальный объем позволит поли-L-лизин, чтобы протекать через микроканалы (фиг.1А, Б).
  7. Чтобы убедиться, что устройства внутри 60 мм чашки для культивирования клеток не опрокинуться внутри 37 ° С инкубатор, разместить три 60 мм культуры клеток блюда, содержащие устройства в 150 мм пластик клеток блюдо культуры и покрыть блюдо крышкой. Инкубируйте O / N в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. Как правило, более 90% из каналов могут использоваться в устройстве и сделатьне содержит каких-либо воздушных пузырьков или физическое блокирование.
  8. На следующий день, заменить поли-L-лизин водой и оставить устройство в инкубаторе в течение по крайней мере 1 часа. Повторите это стиральная три раза. Удалить воду и добавить Neurobasal-среде для роста (содержащий 2% B-27 дополнения и 500 мкм Glutamax) для каждого устройства. Оставьте O / N в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
  9. На следующий день, пластины клеток гиппокампа, как описано ниже.

2. Покрытие из мыши гиппокампа первичных нейронах в микрожидкостных устройств

ПРИМЕЧАНИЕ: подготовка культивируемых нейронов гиппокампа от новорожденных крыс была ранее опубликована в Юпитер 25. Ниже приведены некоторые модификации, которые были адаптированы к пластину мыши нейронов гиппокампа в микрофлюидных устройств, и что были оптимальными для трансфекций.

  1. Перед мозга мыши диссекции, предварительно тепло Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки(FBS; без антибиотиков), смесь (125 мг DL-цистеина, 125 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 3,125 г D-глюкозы в 500 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS); фильтр стерилизуют через фильтр 0,22 мкм) и Дезоксирибонуклеаза I раствор (ДНКазы I: 50 мг ДНКазы I и 0,5 мл 4 раствора 1,2 М MgSO в 100 мл Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS) фильтра стерилизовать через фильтр 0,22 мкм) в водяной бане при 37 °.
    1. Предварительно теплой Neurobasal-ростовую среду внутри 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2, чтобы уравновесить рН.
  2. Проанализируйте гиппокампа от 1-3-дневных новорожденных мышей в соответствии с установленными протоколами 26. Хранить гиппокампа в 15 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл рассечение буфера (HBSS, содержащем 10 мМ HEPES рН 7,4, 50 мМ глюкозы, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) на льду. Положите до 4 гиппокампе в 15 мл коническую трубку.
  3. Выполните оставшиеся протокол находится под стерильном состоянииы в шкафу биологической безопасности.
  4. Развести 45 единиц папаина в 5 мл смеси А, вихря, и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С до тех пор, папаин порошок не растворится. Добавить 1 мл раствора ДНКазы I. Фильтр микс через блок шприц фильтр 0,22 мкм.
  5. Тщательно аспирата ССРХ "от 15 мл коническую трубку, содержащую гиппокампе. Добавить 10 мл холодного (4 ° С) HBSS, в гиппокампе и пусть они оседают на дне пробирки. Тщательно аспирата HBSS от 15 мл коническую трубку.
  6. Добавить 1 мл папаин / ДНКазы я смешать с до 4 гиппокампе и выдержать в течение 20-30 мин при 37 ° С. Наклоните коническую трубку каждые 5 минут, чтобы искупаться гиппокампа с микса. В качестве альтернативы разместить гиппокампа в 37 ° С водяной бане шейкере при осторожном встряхивании (~ 100 оборотов в минуту).
  7. Аспирируйте папаин / ДНКазы I смешивать и гиппокамп мыть дважды подогретого DMEM (37 ° C), содержащей 10% FBS.
  8. После второй промывки, добавить 2 мл подогретого DMEM, содержащей 10% FBS, чтобы гиппокампе и вручную растирают гиппокампа с помощью пипеткивверх и вниз ~ 10-12 раз с помощью пипетки на 1 мл, чтобы отделить нейроны.
  9. Пусть растирают оседать в течение ~ 1 мин, как это позволит не-диссоциированных нейронов оседают на дне конической трубе. Передача супернатант, содержащий диссоциированных нейронов к новому 15 мл коническую трубку, избегая передачу большего ткани, который лег в нижней части трубки.
  10. Спин клеток при 1000 х г в течение 2 мин и осторожно удалить супернатант, не нарушая клеточный осадок. Ресуспендируют клеток в 80 мкл Neurobasal-A ростовой среде с помощью пипетки осторожно.
  11. Удаление среды из резервуара микрожидкостных 1 и 1 '. Применить 20 мкл клеток (~ 275 000), чтобы микрожидкостных резервуара 1, и позволить им течь через. Поместите устройство в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 20 мин.
  12. Смотрите под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки присоединились к покровным стеклом. Добавить Neurobasal-среде для роста, чтобы завершить все резервуары. Возврат устройство с клетками в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO 2.
  13. Проверьте устройства каждый ~ 2-3 дня и топ от водохранилищ Neurobasal-A, содержащей 2% B-27 дополнения (без Glutamax), чтобы избежать испарения. Нейроны начинают расширять свои аксоны через микроканалов ~ 2-3 дня после посева. Тема нейроны трансфекцией обычно через 7-10 дней после посева.

3. Трансфекцию нейронов гиппокампа Выросшая в микрожидкостных устройств

  1. На устройство, приготовить смесь из 1,2 мкл Lipofectamine 2000 в 30 мкл Neurobasal-А, и сочетание 0,5 мкг флуоресцентного грузов слияния плазмиды в 30 мкл Neurobasal-A и инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Добавить Lipofectamine микс микс ДНК и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавить 60 мкл Neurobasal-A, содержащего 4% B-27 дополнение к ДНК / Липофектамин смешивать и смешивать слегка ударяя по пробирке.
  2. Извлеките носитель из микрожидкостных резервуара 2 и 2 'и тщательно заполнить скважин с Neurobasal-А, содержащих 2% B-27 добавку, не проливая в среднесрочной междунаро других отсеков.
  3. Снимите носитель из микрожидкостных резервуара 1 и 1 '. Добавить 120 мкл ДНК / Lipofectamine смешать с микрожидкостных резервуара 1 и струись. Возврат устройства до 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 3-4 ч.
  4. Извлеките носитель из микрожидкостных резервуара 1 и 1 'и заменить Neurobasal-A, содержащей 2% B-27 добавки в течение 24 ч (или до готовности к изображению). Как правило, 5-7 аксоны, которые растут через микроканалы трансфецируют в этих условиях, которые представляют примерно 1-3% эффективность трансфекции в соответствии с эффективностью, опубликованных на гиппокампа культивируемых клеток 26.

4. «Грузовой Картография" Анализы

  1. Живая съемка движения грузов
    1. Выполните визуализацию на перевернутой эпифлуоресцентной световом микроскопе, снабженном 37 ° C инкубатор и контрольной камере СО 2.
    2. Установите покровное с нейронов гиппокампа, выращенных в MICRofluidic устройство на столике микроскопа. Чтобы избежать гибели нейронов, работать оперативно, чтобы сохранить образцы при микроскопом не более чем на 1 час.
    3. Использование высокого разрешения цель (100X), найти аксоны трансфекции клеток, которые проходят через каналы микрофлюидных камер и записывать числа каналов, в которых был найден трансфектированную аксона. Подсчитайте количество каналов с помощью рук Tally счетчик.
      1. Для оптимальной записи живого движения и последующего анализа колокализации, выбрать аксоны, которые растут относительно плоский через каналы таким образом, что изображения большинства везикул может быть выполнена в фокусе.
    4. Удаление самой среды из резервуаров 2 и 2 'с 1 мл пластиковые пипетки. Чтобы облегчить последующее выравнивание основных образов с траекториями движения на kymographs выровняйте правый край микроканалов с поля зрения во время съемки (рис 1B, C).
    5. Для облегчения Fixinг образцов во время визуализации, выполнять живого изображения с двух человек. В качестве альтернативы, если живой изображений выполняется одним человеком, используют систему микроскопа, снабженного коррекции дрейфа.
    6. Начните изображения живой движение грузового спецификациям покадровой конкретных динамике транспортных груза анализируемых (спецификаций микроскопов и настроек для работы с изображениями YFP-ПРП C указаны в легенде о рисунке 2 и материалов List).
    7. После достаточного количества данных живое движение были собраны, имеют один человек заполнить резервуары 2 и 2 'с предварительно нагревают 4% параформальдегида в PBS, содержащий 0,04 г / мл сахарозы, чтобы зафиксировать клетки. Старайтесь не прикасаться микрожидкостных устройств, так как это нарушит фокус живого изображения. Есть другой человек настроить фокус в то время как фиксатор добавляется. Фиксация является успешным, когда наблюдается немедленную остановку движения. Добавить фиксатор в резервуар 1 и 1 'после этого.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Временное photobleaцзин грузового флуоресценции также может наблюдаться, но флуоресценция сохраняется после IF окрашивание для моторных белков завершается (следующий шаг).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид вредно при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. Вызывает раздражение глаз, дыхательных путей и кожи. Уничтожать в соответствии с предписаниями компетентных служб.
  2. ЕСЛИ окрашивание моторных белков для анализа колокализации
    Примечание: Для количественного определения относительных уровней моторных белков (как определено окрашиванием антителами), связанных с индивидуальными перемещения грузов, проверки и титруют антитела чтобы гарантировать, что связывание антитело-антиген является насыщенным. Это делается путем определения специфичности антитела, используя нейроны, в которых интерес белок был либо выбитых или разобранном и выполняя ЕСЛИ анализ с увеличением концентрации антител. Для отрицательных контролей, нейроны окрашивали вторичными антителами в отсутствие первичных антител. Более подробнаяОписание проверки антитела могут быть найдены в Encalada и др., 16, и Szpankowski и др. 20.
    1. Снимите покровное с нейронов гиппокампа, выращенных в микрожидкостных устройств от столике микроскопа. Не отключайте микрожидкостных устройств от покровного стекла, а микроканалы должны оставаться нетронутыми, чтобы наложить живые и неподвижных изображений. Выполните следующие действия в камере влажности.
    2. Чтобы обеспечить приток решений в микроканалов, поддерживать объем буфера разницу между резервуаров 1, 1 'и 2, 2', по крайней мере 30 мкл. во всех последующих шагов. Например, добавление объема 100 мкл среды для микрожидкостных резервуара 2, 2 ', и 70 мкл объема носителя для микрожидкостных резервуара 1, 1'.
    3. Снимите фиксатор из палат микрожидкостных устройств и мыть клетки три раза PBS ждут 10 мин между стирок.
    4. Проницаемыми клеток путем добавления 0,1% Тритон Х-100 diluTed в PBS в течение 5 мин для всех резервуаров.
    5. Снимите решение из всех водоемов и промыть PBS. Повторите промывание три раза ждут 10 мин между стирок.
    6. Удаление раствора из всех резервуаров и применить блокирующем буфере, содержащем 10% нормальной сыворотки осел и 3% протеаза свободными и иммуноглобулин G (IgG) -free BSA в PBS и инкубировали в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре.
    7. Спин первичного антитела маточного раствора на 20 000 мкг в течение 5 мин, чтобы удалить осадок. Развести антитела к соответствующей концентрации в блокирующем буфере. Замените блокирующий буфер из микрожидкостных устройств с раствора антител. Инкубируйте образцы в течение 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С.
    8. Снимите решение из всех водоемов и мыть три раза PBS, ожидая 10 минут между стирок.
    9. Спин вторичного антитела маточного раствора на 20 000 мкг в течение 5 мин, чтобы удалить осадок. Развести антитела к соответствующей концентрации в блокирующем буфере. Заменить PBS раствором вторичного антитела. ВысиживатьОбразцы в течение 1 часа при комнатной температуре.
    10. Снимите решение из всех водоемов и мыть три раза PBS, ожидая 10 минут между стирок.
    11. Заменить PBS с ~ 10-20 мкл монтажной среды непосредственно пипетки монтажную среду в открытии каналов, соединяющих резервуары. Давайте монтажа СМИ высохнуть в течение ~ 20 мин - 1 час при комнатной температуре.
    12. Храните устройства при 4 ° С, защита от света, чтобы избежать фотообесцвечивания и изображения аксоны в течение двух дней (максимум одна неделя) окрашивания.
    13. После окрашивания завершен, крепление покровного с нейронов гиппокампа, выращенных в микрожидкостных устройств на столике микроскопа. Найдите область трансфецированного аксона изображаемого в шаге 4.1.1-4.1.7.
    14. Получение изображений Z-стек (300 нм шаги) для каждой из трех каналов: грузов, двигатель 1, двигатель 2, с помощью высокого разрешения цель (например, высокая численное масло диафрагмы или вода цель).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретение Z-стеки важно как аксоны часто не растут совершенно плоскойв микроканалов и, следовательно, не все флуоресцентного puncta находятся в одной фокальной плоскости.
  3. Картография Грузоперевозки
    1. Генерация кимографе движения грузового использованием программного обеспечения для анализа изображений. Плагин ImageJ разработан Rietdorf и Зейтцем (EMBL) рекомендуется для генерации kymographs (для загрузки см Список материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ является общественным достоянием, Java-программа для обработки изображений разработанный в Национальном институте здравоохранения 27,28 (для загрузки см Список материалы).
    2. Совместите фиксированные образы флуоресцентного груза (полученной на этапе 4.2.14) вручную путем наложения их на позиции траекторий в кимографе в точке фиксации (рис 2А, Б), с использованием коммерчески доступного построения графиков программу (материалы Список). Вручную выровняйте сначала накладывая стационарных грузовых изображение на кимографе и вручную выбирать грузовой puncta, который соответствует определенной траектории накимограф. Для достижения наилучших результатов выравнивания, используйте Z кусочек, который в наилучшей фокусировки для груза отображается. Можно использовать несколько ломтиков Z.
    3. Для каждого изображения в Z-стек (груза, двигателя 1 и двигателя 2; полученной на этапе 4.2.14) определяют XY координаты и амплитуды интенсивности для каждого флуоресцентного puncta использующие установленную алгоритм, чтобы соответствовать 2D Гаусса для функции рассеяния точки, представляющей каждый точечный источник в каждом из трех каналов 16,20,21 (рис 2D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения координат х, выстроенный на заказ MATLAB пакет программного обеспечения под названием "Мотор колокализации" была разработана 16,20, которое включает в себя Gaussian достойный алгоритм, разработанный Jaqaman, Danuser и коллег 21-23. Пакет программного обеспечения и подробные инструкции для ее применения могут быть получены по запросу.
    4. Для каждого из индивидуально грузов puncta которые отображается на мобильных или стационарных траекторий на кимографе, выберите тон XY координаты и амплитуды интенсивности от результатов программы «Мотор колокализации" (эти грузы индивидуально помечены на рисунке 2B). Используйте несколько изображений Z-стек, приобретенные в шаге 4.2.14) на карту больше грузов, которые находятся на разных фокальных плоскостях.
    5. Сравнение индивидуальный XY координаты отображаемого груза к тем, которые получены для каждого из каналов в моторных соответствующего ломтика Z (рис 2D). Определить и выбрать координаты XY двигателя, которые находятся в радиусе 300 нм груза. Для грузов и двигателей, которые имеют сигнал в пределах одной и той же фокальной плоскости, использовать "Мотор колокализации" пакет программного обеспечения для определения puncta что расположены в радиусе 300 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показан обзор микрожидкостных устройств используется расти гиппокампа нейронов (1А, Б). Нейроны высевают в резервуаре 1. Размер микроканалов препятствует диффузии клеточных тел (сомы) в аксонов отделении в то время как длина каналов предотвращает дендритные прогнозы от пересечения весь путь к аксонов отсеке. После ~ 2-3 дней в культуре, нейроны начинают расширяя свои аксоны через микроканалы в аксонов отсека (рис 1B, C). Трансфицированные аксоны, экспрессир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленные здесь дает соотношение направленности движения отдельных флуоресцентных микротрубочек на основе перемещения грузов частиц с относительной типа и количества связанных моторных белков в живых нейронов. Ранее общая моторная состав аксонов везикулярного грузов анализировали на гетерогенных популяций биохимически очищенных везикул и органелл 9,15. Тем не менее, характеризующие двигатель композиция для одного типа груза внутри клеток было достаточно сложной задаче...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Ге Янга, Гауденца Данусера, Хулуда Джакамана и Дэниела Вислера за помощь в адаптации и разработке программного обеспечения для количественного картирования грузов, а также Эмили Нидерст за помощь в создании микрофлюидных устройств. Эта работа была частично поддержана грантом NIH-NIA AG032180 L.S.B.G. и Медицинским институтом Говарда Хьюза. L.S. была частично поддержана грантом NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. была поддержана стипендией Фонда исследования рака Деймона Раньона, грантом NIH по обучению нейропластичности AG000216, а также грантом от Медицинского фонда Эллисона New Scholar in Aging Award, G.E.C была поддержана премией NIH/NCATS 1 TL1 TR001114 и фондом Achievement Rewards for College Scientists.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
поли-L-лизинSigmaP5899-20 мг
D-MEM (Dulbecco' s Модифицированная Eagle Medium) с высоким содержанием глюкозы, с L-глутамином, без пирувата натрия (1x)Life Technologies11965092
FBS (фетальная бычья сыворотка)Life Technologies10082147
Нейробазал-А Medium (1x)Life Technologies10888022
B-27 Сывороточная добавкаLife Technologies10888022
Добавка GlutaMAX I (100x)Life Технологии35050061
HBSS (1x) (Хэнк LifeTechnologies24020117
DPBS (Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер, без магния, без кальция (1x)Life Technologies14190250
пенициллин/стрептомицин (100x)Life Technologies15140122
Corning cellgro Water for Cell Culture Fisher ScientificMT46000CM
PapainUSB Corporation19925
DL-цистеин HClSigma-AldrichC9768
BSA (бычий сывороточный альбумин)Sigma-AldrichA7906
D-глюкозаSigma-AldrichG6152
DNAse I grade IIRoche Applied Sciences10104159001
Липофектамин 2000Технологии Жизни 
Раствор формальдегида 16% ЭМ классаFisher Scientific50980487Внимание: Вреден при вдыхании, контакте с кожей и при проглатывании. Раздражает глаза, дыхательную систему и кожу. Утилизируйте в соответствии с официальными правилами.
СахарозаFisherScientific S5-500
HEPESSigmaH-3375
Нормальная сыворотка ослаJackson Immuno Research017-000-0121
BSA жирные кислоты и IgG без жирных кислот и IgGJackson Immuno Research001-000-162
АцетонFisher ScientificBP2403-4
ЭтанолFisher ScientificBP2818-100
ProLong Gold антифлюидный реагентLife TechnologiesP36934
Покровное стекло 1 1/2. 24 x 40 ммCorning2980-244
Axis микрофлюидное устройство, 450 &; mMilliporeAX450
Adobe PhotoshopAdobe
Nikon Eclipse TE2000-U Фотоаппарат Nikon
Coolsnap HQ Roper Scientific
60 ммFisher Scientific12-565-95
Чашка для клеточной культуры 150 мм FisherScientific12-565-100
Используемые антитела:
Легкая цепь анти-кинезин, V-17Santa Cruz sc-13362проверена с использованием нейронов KLC1-/- (ссылка 16), рекомендуемое разведение 1:100.
Тяжелая цепь Anti Dynein 1, R-325Санта-Круз sc-9115проверена с использованием shRNA против DYN1HC1 (Ref. 16), рекомендуемое разведение 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG АнтителаLife TechnologiesA10042  Рекомендуемое разведение 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) АнтителаLife TechnologiesA31573  Рекомендуемое разведение 1:200.
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Антитела IgG АнтителаLife TechnologiesA11057  Рекомендуемое разведение 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) АнтителаLife TechnologiesA21447  Рекомендуемое разведение 1:200.
Плагины и макросы
ImageJ  http://imagej.nih.gov/ij/index.html. 
ImageJ Плагинhttp://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.
11668027Чашка для клеточной культуры Специфичность Специфичность для кимографа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
  2. Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
  5. Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
  6. Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
  7. Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
  8. Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
  9. Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
  10. Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
  11. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
  12. Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
  13. Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
  14. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
  15. Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
  16. Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
  17. Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
  18. Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
  19. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
  20. Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
  21. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
  22. Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
  23. Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
  24. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
  25. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
  26. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  27. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  29. Moore, D. S., McCabe, G. P. Introduction to the Practice of Statistics. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи