Характеризуя Состав молекулярных моторов на перемещение аксонов Грузы Использование &quot;Грузовой Mapping&quot; Анализ

Sylvia Neumann; George E. Campbell; Lukasz Szpankowski; Lawrence S.B. Goldstein; Sandra E. Encalada

doi:10.3791/52029

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Характеризуя Состав молекулярных моторов на перемещение аксонов Грузы Использование "Грузовой Mapping" Анализ

9.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52029

⸱

30 октября 2014 г.

Sylvia Neumann¹ , George E. Campbell^*¹ , Lukasz Szpankowski^*²^,³ , Lawrence S.B. Goldstein²^,⁴ , Sandra E. Encalada¹

¹Department of Molecular and Experimental Medicine, Dorris Neuroscience Center, The Scripps Research Institute, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, ³Department of Bioengineering, University of California San Diego, ⁴Department of Neurosciences, University of California San Diego School of Medicine

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Внутриклеточный транспорт грузов, таких как везикулы или органеллы, осуществляется молекулярными моторными белками, которые отслеживаются по поляризованным микротрубочкам. Этот протокол описывает корреляцию направленности транспорта отдельных частиц груза, движущихся внутри нейронов, с относительным количеством и типом ассоциированных моторных белков.

Аннотация

Понимание механизмов, с помощью которых молекулярные моторы координации их деятельности для транспортировки везикулярные грузов в нейронах требуется количественный анализ двигатель / грузовых ассоциаций на одном уровне пузырьков. Цель этого протокола заключается в использовании количественных флуоресцентной микроскопии соотнести ("карта") позицию и направленность движения живого груза к составу и относительных количеств двигателей, связанных с тем же грузом. "Отображение Cargo" состоит из живых изображений флуоресцентно меченных грузов, движущихся в аксонов культивируемых на микрофлюидных устройств с последующей химической фиксации во время записи живого движения, и последующее иммунофлюоресценции (ИФ) окрашивания тех же аксонов регионах с антителами против двигателей. Колокализации между грузов и связанных с ними двигателей оценивается путем присвоения позиции субпиксельную координаты моторных и грузовых каналов, по монтажу функций Гаусса к дифракционной-лираничена функции рассеяния точки, представляющие отдельные люминесцентные точечные источники. Фиксированные грузовые и моторные образы впоследствии накладывается на участках движения грузового, чтобы "карта" их на гусеничных траекторий. Сила этого протокола является сочетание живой и IF данные для записи как транспорт везикулярного грузов в живых клетках и определять двигатели, связанные с этими же самыми пузырьков. Эта методика позволяет преодолеть прежние проблемы, которые используют биохимические методы для определения средней состав двигателя очищенных гетерогенных популяций массовых пузырьков, как эти методы не выявляют композиции на отдельных движущихся грузов. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для анализа других транспортных и / или оборот путей в других типах клеток коррелирует движение отдельных внутриклеточных структур с их белкового состава. Ограничения этого протокола являются относительно низкая производительность за счет низкой эффективности трансфекции культивируемыхпервичные нейроны и ограниченное поле зрения, доступного для изображений с высоким разрешением. Будущие приложения могут включать в себя методы, чтобы увеличить количество нейронов, экспрессирующих флуоресцентно меченных грузов.

Введение

Внутриклеточный транспорт имеет решающее значение во всех типах клеток для доставки белков, мембран, органелл и сигнальных молекул в различных сотовых областях ^1. Нейроны являются узкоспециализированными клетки с длинными, поляризованных проекций, что критически зависят от внутриклеточного транспорта эфирных грузов для их дальней доставки различных аксонов микродоменов. Этот транспорт опосредуется кинезинов и динеинами - два больших семейств белков молекулярных двигателей - которые связываются с грузами и отслеживать вдоль поляризованных микротрубочек в антероградная и ретроградных направлений, соответственно. В то время как ретроградная движение в основно....